Summary
शहद मधुमक्खी कालोनियों की हानि ने फसल परागण सेवाओं के लिए एक चुनौती प्रस्तुत की है। वर्तमान परागणक संरक्षण प्रथाएं एक वैकल्पिक दृष्टिकोण की पुष्टि करती हैं जो मधु मधुमक्खियों के संपर्क को हानिकारक कीटनाशकों के लिए विकर्षक रसायनज्ञों का उपयोग करने के लिए कम कर देती हैं। यहां, हम मधुमक्खियों के लिए स्क्रीन पर रोक लगाने के लिए विजुअल ट्रैकिंग प्रोटोकॉल के विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं।
Abstract
यूरोपीय शहद मधु, एपिस मेलिफेरा एल , एक आर्थिक और कृषि की महत्वपूर्ण परागणक है जो अरबों डॉलर सालाना उत्पन्न करता है। 1 9 47 के बाद से हनी मधुमक्खी कॉलोनी संख्या संयुक्त राज्य अमेरिका और कई यूरोपीय देशों में घट रही है। इस गिरावट में कई कारक भूमिका निभाते हैं, जिनमें कीटनाशकों के लिए शहद के मधुमक्खियों के अनजाने में जोखिम भी शामिल है। इन परागणिकों के लिए कीटनाशक के जोखिम को कम करने के लिए नए तरीकों और विनियमों के विकास का समर्थन किया जाता है। एक दृष्टिकोण विकर्षक रसायनज्ञों का उपयोग होता है जो कि हाल ही में कीटनाशक उपचारित फसल से मधु मक्खियों को रोकते हैं। यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो कि मधु मक्खियों की चुनौतियों का सामना करने वाले विकर्षक रसायनज्ञों के सामने आते हैं। शहद मधुमक्खी मेंढक को इकट्ठा किया जाता है और एक इनक्यूबेटर में रातोंरात भूखा होता है परीक्षण के 15 घंटे पहले। व्यक्तिगत शहद मधुमक्खियों को पेट्री डिश में रखा जाता है जो कि या तो एक चीनी-एगरोज़ क्यूब (नियंत्रण उपचार) या चीनी-एगरोस-कम्पाउंड घन (विकर्षक उपचार) में रखा जाता हैपकवान के बीच में पेट्री डिश वीडियो ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर का इस्तेमाल करते हुए शहद मधुमक्खी गतिरोध गतिविधियों को रिकॉर्ड करने के लिए एक प्रकाश बॉक्स में कैमरे के नीचे स्थित क्षेत्र के रूप में कार्य करता है। प्रत्येक 10 मिनट की अवधि के लिए 8 नियंत्रण और 8 विकर्षक उपचारों का विश्लेषण किया गया था, प्रत्येक मधुमक्खी मधुमक्खी के साथ दोहराया गया था। यहां, हम यह दिखाते हैं कि शहद मधुमक्खियों का मिश्रण एक मिश्रित उपचार के साथ चीनी-एगरोज़ क्यूब्स से विचलित होता है जबकि शहद के मधुमक्खियां एक अतिरिक्त परिसर के बिना चीनी-एगारोज़ क्यूब्स से आकर्षित होता है।
Introduction
यूरोपीय शहद मधुमक्खी, एपिस मेलिफेराएल , एक आर्थिक और कृषि की महत्वपूर्ण किट है जो परागण सेवाएं प्रदान करती है जो 200 बिलियन अमरीकी डॉलर से अधिक का विश्व स्तर पर 1 मूल्यवान है। संयुक्त राज्य अमेरिका और यूरोप में मधु मक्खी कॉलोनी संख्या में गिरावट आई है। संयुक्त राज्य अमेरिका ने सीए खो दिया है 1 947-2008 से प्रबंधित शहद मधुमक्खी कालोनियों का 60% जबकि यूरोप ने सीए खो दिया है 27% से 1 961-2007 2 , 3 कई कारक हैं जो कॉलोनी घाटे की बढ़ी हुई संख्या के लिए ज़िम्मेदार हो सकते हैं, जिनमें परजीवी infestations, रोगजनक संक्रमण, मधुमक्खी पालन प्रथाओं, और कीटनाशक उपयोग 2-4 शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं है।
शहद के मधुमक्खियों के दो मुख्य मार्गों के माध्यम से कीटनाशकों के संपर्क में हो सकते हैं। हाइपे के बाहर कीटनाशक का प्रदर्शन तब हो सकता है जब व्यक्तियों को फसल के संपर्क में आना पड़ता हैकीट से सुरक्षा के लिए रसायनों के साथ छिड़का गया है हाइव के भीतर कीटनाशक के संपर्क में हो सकता है, जब मधुमक्खियों में रसायनों का उपयोग इनहेव कीटों और रोगजनकों को नियंत्रित करने के लिए होता है, जैसे कि कण, बैक्टीरिया और माइक्रोसॉपरिडिया 4 । संयुक्त राज्य अमेरिका और कनाडा 5 , 6 में कीटनाशक के अवशेषों को मोम, पराग, और मधुमक्खी के नमूने में 24 एपिएरिअर्स से पहचाने गए हैं। मधुमक्खी से कीटनाशक के संपर्कों के प्रभाव में तीव्र विषाक्तता और साथ ही उप-घातक प्रभाव शामिल हैं जैसे पक्षाघात, भटकाव और व्यवहार और स्वास्थ्य परिवर्तन 1 , 7 । चूंकि आधुनिक कृषि को उच्च फसल की पैदावार बनाए रखने के लिए कीटनाशकों के उपयोग की आवश्यकता है, भविष्य में इन रसायनों पर भरोसा जारी रहेगा 2 । मधुमक्खियों को कीटनाशक के जोखिम से बेहतर बनाए रखने के लिए, नए प्रोटोकॉल और नियमों के विकास की आवश्यकता है 5 ।सुरक्षा के लिए एक संभावित दृष्टिकोण भोजन के लिए प्याज करते समय कीटनाशकों के लिए शहद के मधुमक्खियों के जोखिम को कम करने के लिए प्रतिकारकों का उपयोग होता है
कीट repellents (आईआर) आम तौर पर arthropod रोग वैक्टर 8 के खिलाफ व्यक्तिगत काटने सुरक्षा उपायों के रूप में इस्तेमाल किया गया है 60 साल से अधिक पहले विकसित और सबसे अधिक प्रभावी आईआर, डीईईटी 8 , 9 है । इसे कीट प्रत्यारोपित परीक्षण के लिए सोने के मानक माना जाता है और विश्व स्वास्थ्य संगठन और पर्यावरण संरक्षण एजेंसी द्वारा उपन्यास विकर्षक स्क्रीनिंग 10 के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। इसके अतिरिक्त, डीईईटी अपने कॉलोनी 11 के लिए खतरे से मधु मक्खियों को फैलाने के लिए मिल गया है व्यक्तिगत आईआर से जुड़ी वर्तमान विशेषताओं में शामिल हैं: (1) मानवता के व्यापक संवर्ग के खिलाफ स्थायी प्रभाव; (2) जब त्वचा या कपड़ों पर लागू होता है तो उपयोगकर्ता को परेशान नहीं करता; (3) गंधहीन यासुखद गंध; (4) कपड़े पर कोई प्रभाव नहीं; (5) त्वचा पर लागू होने और उपयोगकर्ता द्वारा पसीना, धोने और पोंछने का सामना करने के लिए कोई तेल दिखाई नहीं देता; (6) आमतौर पर इस्तेमाल किए गए प्लास्टिक पर कोई प्रभाव नहीं; और (7) व्यापक रूप से उपयोग के लिए रासायनिक स्थिर और सस्ती 12 मधु मक्खियों के लिए प्रयुक्त एक विकर्षक के लिए इन गुणों की कुछ आवश्यकता होती है जैसे स्थायी प्रभाव, अपरिवर्तक, बिना गंध या सुखद गंध, रासायनिक रूप से स्थिर और व्यापक उपयोग के लिए किफायती, और मधु मक्खियों के लिए गैर विषैले। हालांकि, गहराई में इन गुणों की खोज करने से पहले, उच्च-थ्रुपुट तरीके से repellency / deterrence के लिए स्क्रीनिंग यौगिकों का एक तरीका आवश्यक है। यहाँ, हम मधु मक्खियों के विरोध के लिए यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए एक प्रयोगशाला परख के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, repellency निर्धारित करने में एक महत्वपूर्ण कदम। मधु मक्खियों 13 पर कीटनाशकों के उप-प्रभावों का आकलन करने के लिए एक दृश्य ट्रैकिंग पद्धति का वर्णन करने वाले पिछले अध्ययन से निम्नलिखित प्रोटोकॉल को संशोधित किया गया है। होवेदेखें, यह प्रोटोकॉल अलग-अलग है क्योंकि यह उम्मीदवार पुनर्विक्रताओं के प्रभाव को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो कीटनाशक द्वारा इलाज की गई फसलों से शहद मधुमक्खियों को रोक सकता है। मधु मक्खियों के लिए रासायनिक बाधाओं के प्रयोगशाला परीक्षण के लिए कोई सिफारिश नहीं प्रोटोकॉल हैं, और इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल ने इस तरह के यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए सरल दृष्टिकोण प्रदान किया है।
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Protocol
1. चीनी-एगरोज़ क्यूब्स तैयार करें
- 8 ग्राम चीनी का वजन और 50 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में रखें।
- 20 एमएल डी-ionized पानी के साथ Erlenmeyer फ्लास्क भरें। फ्लास्क घूमते हुए चीनी को भंग कर दें।
- 170 मिलीग्राम agarose वजन और इसे चीनी समाधान में जोड़ें।
- 25 एस के लिए उच्च पर एक माइक्रोवेव में चीनी-एगरोज़ समाधान को गरम करें Agarose को चीनी समाधान में भंग।
- फ्लास्क और शर्करा-agarose समाधान ठंडा करने की अनुमति दें।
नोट: फ्लास्क स्पर्श के लिए अच्छा होना चाहिए, लेकिन समाधान को स्थिर करने की अनुमति नहीं दें।- नियंत्रण उपचार के लिए एक चीनी-एगरोज़ घन तैयार करने के लिए, अर्ध-शीत-शर्करा-एगरोज़ समाधान को तौले जाने वाले नौका मोल्ड में डाल दें।
नोट: वजन की ढालना वजन 1.5 x 1.5 x 0.3 सेमी 3 आयाम है। - विकर्षक उपचार के लिए एक चीनी-एगरोज-कम्पाउंड क्यूब तैयार करने के लिए, अर्ध-ठंडा समाधान के लिए इच्छित मात्रा में मिश्रित जोड़ ( जैसे , 1% डीईटी एस मेंUgar-agarose समाधान (वी / वी))। यौगिक में मिश्रण करने के लिए फ्लास्क भंवर चढ़ाएं और फिर तौलना में एक बोतल के ढालना में समाधान डालना।
नोट: इस बिंदु पर आठ नियंत्रण मोल्ड और आठ परीक्षण मोल्ड तैयार किए जाएंगे। नियंत्रण मोल्ड में विकर्षक नहीं होते हैं
- नियंत्रण उपचार के लिए एक चीनी-एगरोज़ घन तैयार करने के लिए, अर्ध-शीत-शर्करा-एगरोज़ समाधान को तौले जाने वाले नौका मोल्ड में डाल दें।
- 5-10 मिनट के लिए फ्रिज में शीर्जेज क्यूब्स को फ्रिज में कूल करें निचले सागर-एगरोज़ क्यूब्स को नाव के ढालना ताने से हटा दें और उन्हें एक सिक्त कागज तौलिया के साथ एक प्लास्टिक के कंटेनर में रखें।
- भंडार के लिए एक रेफ्रिजरेटर में कंटेनरों को रखें। तैयारी के 7 दिनों के भीतर शर्करा-अग्मार्क क्यूब्स का इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
2. वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्रामिंग और प्रायोगिक सेटअप
- प्रयोग एक्सप्लोरर बार में प्रयोग सेटिंग के अंतर्गत, स्क्रीन के बाईं ओर स्थित ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर में, सामग्री तालिका देखें) सुनिश्चित करें कि सही कैमरा चुना गया है और यह कि वीडियो रिकॉर्डिंग पेट्री डिश एरिना पर केंद्रित है
- अगर वीडियो रिकॉर्डिंग को केन्द्रित करने की आवश्यकता है, तो कैमरे की सेटिंग में जाएं और एओआई नियंत्रण के तहत जाएं और केंद्र एक्स और केंद्र वाई विकल्प चुनें।
- प्रयोग सेटिंग के तहत, एरेनाओं की संख्या को 16 पर बदलें। ट्रैक किए गए विशेषताओं के अंतर्गत केंद्र-बिंदु का पता लगाने का चयन करें।
- परख के लिए वांछित क्षेत्र सेटअप करने के लिए एरेना सेटिंग्स का चयन करें।
- कैमरे के नीचे स्थित एक लाइट बॉक्स के शीर्ष पर एक 4 x 4 पैटर्न में 16 पेट्री व्यंजन रखें ( चित्रा 1 )।
नोट: इन व्यंजनों का प्रयोग रिकॉर्डिंग क्षेत्र बनाने के लिए किया जाता है और खाली हैं।
- कैमरे के नीचे स्थित एक लाइट बॉक्स के शीर्ष पर एक 4 x 4 पैटर्न में 16 पेट्री व्यंजन रखें ( चित्रा 1 )।
चित्रा 1: प्रकाश बॉक्स पर पेट्री डिश व्यवस्था। पेट्री डिश की रोशनी बॉक्स के ऊपर 4 x 4 ब्लॉक में व्यवस्थित किया जाता है। यह व्यवस्था वी के नियंत्रण और विकर्षक उपचार की आसान पहचान प्रदान करती हैवास्तविक ट्रैकिंग प्रोटोकॉल इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
- एरेना सेटिंग्स में, 16 पेट्री व्यंजनों की एक तस्वीर लेने के लिए, दाईं ओर टूल पैनल पर स्थित हड़पने वाले पृष्ठभूमि बटन का उपयोग करें। इस क्षेत्र को सेटअप करने के लिए टेम्पलेट के रूप में इसका उपयोग किया जाएगा
- एरेना सेटिंग्स स्क्रीन के शीर्ष पर उपकरण पट्टी से "अंडाकार बनाएं" चुनें और एक ऐसा मंडली बनाएं जो छवि में पेटी डिश के व्यास से मेल खाती है। वृत्त में एरेना 1 मार्कर रखें ( चित्रा 2 )।
चित्रा 2: दृश्य ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर एरिना सेटिंग्स का स्क्रीनशॉट मंडल के भीतर विकर्ण पट्टियों का अवलोकन सर्कल में पहचान क्षेत्र की पुष्टि करता है। ए जोन 1 मार्कर प्रत्येक वर्ग के लिए प्रदान किया जाता है और हर पेट्री डिश के लिए लक्ष्य क्षेत्र को परिभाषित करता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
- दाईं ओर टूल पैनल में एरेना 1 के नीचे स्थित "ज़ोन समूह 1" चुनें स्क्रीन के शीर्ष पर टूल बार से "आयत बनाएं" चुनें इस का उपयोग करके एक 30 x 30 पिक्सेल वर्ग बनाएं और उसके बाद उस मंडली के केंद्र पर स्थित करें जो पिछले चरण में बनाया गया था। शीर्ष टूलबार से "जोन जोड़ें" चुनें और फिर वर्ग के बीच में क्लिक करें। ज़ोन 1 मार्कर को स्थानांतरित करें ताकि यह वर्ग में हो।
नोट: बनाया गया वर्ग भोजन क्षेत्र है और यह एक आवश्यकता नहीं है कि खाद्य क्षेत्र ठीक उसी आकार के रूप में सूचीबद्ध हो, जब तक कि यह चीनी-एगरोज क्यूब से थोड़ा बड़ा हो।
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चित्रा 3: पूर्ण एरिना सेटिंग्स का स्क्रीनशॉट। पूर्ण क्षेत्र सेटिंग इस उदाहरण की तरह दिखनी चाहिए। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
- दाहिनी ओर टूल पैनल में "एरेना 1" चुनें और फिर पूर्ण क्षेत्र डुप्लिकेट पर क्लिक करें। ड्रॉप डाउन मेनू से "सभी अन्य एरेनास" चुनें और फिर ठीक क्लिक करें खींचा छवि (चित्रा 3) में बाकी पेट्री डिश में डुप्लिकेट एरिना सेटअप्स को ले जाएं।
- "एरेना 1" चुनें और फिर शीर्ष टूल बार पर "कैलिब्रेट करें स्केल" चुनें एरेना 1 पेट्री डिश के व्यास में कैलिब्रेशन लाइन को खींचें व्यास का माप 9 सेमी (पेट्री डिश के व्यास का इस्तेमाल किया जा रहा है) में बदलें। दाहिनी ओर टूल पैनल पर "मान्य एरेना सेटिंग्स" चुनें।
- चुनते हैं "जांच सेटिंग्स "बाईं ओर नियंत्रण पट्टी पर
- "जांच सेटिंग्स 1" चुनें और फिर दाईं ओर टूल बॉक्स पर स्थित ड्रॉप डाउन मेनू में "ग्रे स्केलिंग" चुनें। पता लगाने के तहत, सीमा निर्धारित करें ताकि यह 0 से 83 ( चित्रा 4 ए ) हो।
- "जांच सेटिंग्स" पर राइट क्लिक करें और "जांच सेटिंग्स 2" नामक एक नई सेटिंग बनाएं। सुनिश्चित करें कि "ग्रे स्केलिंग" अभी भी चुना गया है, लेकिन अन्य मापदंडों को परिवर्तित नहीं करें।
नोट: एरेनास पर वीडियो विंडो में बड़े पीले चक्कर होंगे। यह पेट्री डिश की रिकॉर्डिंग ( चित्रा 4 बी ) से पहले सही स्थितियों में व्यवस्थित करने में सहायता करेगा।
चित्रा 4: जांच सेटिंग्स 1 और 2 का स्क्रीनशॉट। ( ए ) दिखाता है कि ऐरेना किस तरह ग्रे स्केलिंग के साथ दिखेगाएक पेट्री डिश में शहद मधुमक्खी विषय ( बी ) मैदान का पता लगाने के क्षेत्र को दिखाता है ताकि पेट्री डिश की स्थिति परीक्षणों के बीच की जा सके। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
- प्रायोगिक एक्सप्लोरर में "ट्रायल सूची" का चयन करें और शीर्ष टूल बार में "वेरिएबल जोड़ें" पर क्लिक करें। उपयोगकर्ता को परिभाषित चर के रूप में "उपचार" नाम दें उपयोगकर्ता परिभाषित उपचार कॉलम में "पूर्वनिर्धारित मान" ड्रॉप डाउन बार चुनें और सी (नियंत्रण) और टी (उपचार) को पूर्वनिर्धारित मानों के रूप में जोड़ें। शीर्ष टूल बार पर स्थित "परीक्षण जोड़ें" बटन चुनें। दो परीक्षण जोड़ें, फिर प्रत्येक क्षेत्र के लिए यह चयन करें कि यह एक नियंत्रण क्षेत्र (सी) या उपचार क्षेत्र (टी) ( चित्रा 5 ) है।
फाईअनुच्छेद 5: परीक्षण सूची का स्क्रीनशॉट। एरेनाओं को लेबल करना सही तरीके से महत्वपूर्ण है क्योंकि कार्यक्रम यहां डेटा का उपयोग करने के लिए डेटा को अलग-अलग विश्लेषण करने के लिए उपयोग करता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
- प्रयोग एक्सप्लोरर पैनल के तहत "डेटा प्रोफ़ाइल" चुनें। बाएं हाथ के कॉलम पर "यूज़र-डिफ़ाइंड इंडीपेंडेंट व्हेरिएबल" शीर्षक के अंतर्गत स्थित "ट्रीटमेंट" चुनें। यह प्रवाह चार्ट के साथ क्षेत्र में "फ़िल्टर" बॉक्स को जोड़ देगा पॉप अप बॉक्स में "सी" का चयन करें और फिर "आरंभ" बॉक्स और "परिणाम 1" बॉक्स के बीच में नए बनाए गए फिल्टर को रखें। फ्लोचार्ट तीरों को समायोजित करना चाहिए ताकि वे प्रारंभिक बॉक्स से फ़िल्टर तक और आखिर में परिणाम 1 पर इंगित करें।
- चरण 2.12 को दोहराएं, हालांकि इस बार फ़िल्टर के लिए "T" चुनें और फिर चयन करें"सामान्य तत्व" अनुभाग के तहत "परिणाम"। नव निर्मित बक्से को फ्लोचार्ट क्षेत्र में ले जाएं और तीरों के साथ बक्से कनेक्ट करें ( चित्रा 6 )।
चित्र 6: डेटा प्रोफाइल का स्क्रीनशॉट यह दर्शाता है कि सांख्यिकीय विश्लेषण में उचित पृथक्करण प्राप्त करने के लिए फ़्लोचार्ट कैसे स्थापित किया जाना चाहिए। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
- फ़ाइल सहेजें।
3. हनी बी व्यक्तियों को लीजिए
- सुरक्षात्मक कपड़े रखो और शहद मधुमक्खियों को इकट्ठा करने के लिए एक हाइव का चयन करें (अधिकतर मेंढक)।
- हाइव के बाहरी और आंतरिक कवर को निकालें शीर्ष हाइव शरीर से फ़्रेम का चयन करने के लिए एक हाइव टूल का उपयोग करें जिसमें ब्रूड शामिल नहीं है।धीरे से छत्ते बॉक्स के फ्रेम को ऊपर उठाएं
- शहद मधुमक्खी रानी के लिए फ्रेम का निरीक्षण करें अगर वह वहां नहीं है, तो मधु मक्खी के कर्मचारियों को फ्रेम से एक कंटेनर में परिवहन के लिए मिटाना। प्रत्येक यौगिक के परीक्षण के लिए दो पूर्ण परीक्षण चलाने में सक्षम होने के लिए पर्याप्त व्यक्तियों को एकत्रित करें (16 व्यक्तियों को प्रति परीक्षण के साथ उपयोग किया जाता है)
नोट: एकत्रित व्यक्तियों को प्राथमिक रूप से फोर्जर्स होना चाहिए; हालांकि, संग्रह में शामिल नर्स मधुमक्खियों जैसे अन्य आयु वर्ग के व्यक्ति भी हो सकते हैं। - उस समय का ध्यान रखें जब मधु मक्खियों को हटा दिया गया था उन्हें 9 सेमी x 7 सेंटीमीटर एक्स 9 सेमी प्लास्टिक के बॉक्स में हवा का छेद लगाकर उन्हें 32 डिग्री सेल्सियस और 70% सापेक्ष आर्द्रता पर रखें।
- 15 घंटे के लिए मधु मक्खियों को भूखा
नोट: यह आम तौर पर सबसे अच्छा काम करता है यदि शहद की मधुमक्खी को जांचने से पहले शाम को एकत्र किया जाता है।
4. दृश्य ट्रैकिंग आकलन आयोजित करें
- दृश्य ट्रैकिंग प्रोग्राम को प्रारंभ करें और सहेजें खोलेंडी प्रयोगात्मक फ़ाइल जो इस परख के लिए बनाई गई थी।
- "जांच सेटिंग्स 2" चुनें
- 16 पेट्री डिश के 8 में से 8 के केंद्रों में चीनी-एगरोज क्यूब्स का नियंत्रण रखें। शेष 8 व्यंजनों में चीनी-एगरोज़-यौगिक (निवारक) क्यूब्स के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं।
- प्लास्टिक बॉक्स से एक एकल मधु मक्खी को निकालने के लिए संदंश का उपयोग करें और इसे पेट्री डिश के नियंत्रण में रखें।
- शेष 15 पेट्री व्यंजनों के लिए चरण 4.4 को दोहराएं।
- सभी बर्तन लाइट बॉक्स पर रखें और उन्हें स्थान दें ताकि अखाड़ा का पता लगाने के क्षेत्रों (कंप्यूटर स्क्रीन पर दिखाया जाए जब पता लगाने की सेटिंग 2 चुने हो) प्रत्येक पेट्री डिश अखाड़ा में फिट हो जाएंगे लाल स्पेक्ट्रम पर सेट एलईडी रोशनी की एक सरणी के नीचे से प्रकाश बॉक्स रोशन। बाहरी रोशनी को खत्म करने और एरेनाओं के भीतर छाया को कम करने के लिए पूरे बॉक्स और कैमरे को काले प्लास्टिक शीट के साथ घेरे।
- पेट्री डिश सेट किए जाने के बाद, सुनिश्चित करें कि "जांच सेटिंग्स 1" हैचयनित सेटिंग
नोट: इस बिंदु पर दृश्य ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर केवल पेट्री डिश अखाड़ा में मधु मक्खियों को चुनना चाहिए। - प्रयोग एक्सप्लोरर से "अधिग्रहण" चुनें। रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए अधिग्रहण नियंत्रण में स्थित हरे रंग की "प्रारंभ परीक्षण" बटन को दाएं बॉक्स को दबाएं
- 10 मिनट के लिए परख चलाएं और रिकॉर्डिंग को रोकने के लिए प्राप्ति नियंत्रण पॉप अप बॉक्स पर लाल "स्टॉप ट्रायल" बटन पर क्लिक करें।
- पेट्री डिश से व्यक्तियों को निकालें और उन्हें एक अलग कंटेनर में रखें ताकि उन्हें दो बार परीक्षण न किया जाए।
- एक ही परिसर पर दूसरे परीक्षण के लिए चरण 4.4-4.10 दोहराएं।
नोट: इस विधि को उपयोगकर्ता द्वारा आवश्यक उपचार के अनुसार मधुमक्खी की संख्या में वृद्धि करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। - प्रयोग एक्सप्लोरर में आंकड़े चुनें और फिर गणना करें पर क्लिक करें।
- डाटा मैनेजर सॉफ़्टवेयर में डेटा निर्यात करें और उसके बाद एक-डब्ल्यू का इस्तेमाल करते हुए महत्त्व के लिए डेटा का विश्लेषण करेंए ट्यूके के पोस्ट-टेस्ट के साथ विचलन का विश्लेषण, और पसंदीदा स्टैटिस्टिकल सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके एक अनपेक्षित टी-टेस्ट।
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Representative Results
शर्करा-एगारोज (नियंत्रण उपचार) या चीनी-एगरोज-कंपाउंड क्यूब (निवारक उपचार) के साथ एक लक्ष्य क्षेत्र में बिताए गए समय की मात्रा रिकॉर्ड करने के लिए एक दृश्य ट्रैकिंग प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। एक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके रिकॉर्ड समय का विश्लेषण किया गया था और लक्ष्य क्षेत्र में ± मानक त्रुटि बिताए गए औसत बार को बार ग्राफ के रूप में रिपोर्ट किया गया है डीईईटी, कीट से बचाने वाली / निवारक परीक्षण के लिए सोने का मानक, इस प्रोटोकॉल में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। शहद मधुमक्खियों को एक चीनी-एगरोज़ घन (नकारात्मक नियंत्रण) के साथ लक्ष्य क्षेत्र में 343 ± 26 एस खर्च किया गया जबकि शहद मधुमक्खियों को चीनी एगरोज़-डीईईटी (विकर्षक) के साथ लक्ष्य क्षेत्र में 16 ± 4 एस खर्च किया गया ( चित्रा 7 )। डीईईटी ने सीए से लक्ष्य क्षेत्र में शहद के मधुमक्खियों द्वारा व्यय किए गए समय की मात्रा में काफी कमी आई है 95% नियंत्रण उपचार की तुलना में।
शहद के मधुमक्खियों के विरोध को निर्धारित करने के लिए ब्याज वाले यौगिकों को तब इस प्रोटोकॉल के माध्यम से दिखाया गया था। चित्रा 8 ए एक परिसर का प्रतिनिधित्व करता है जो लक्ष्य क्षेत्र में खाद्य स्रोत से मधु मक्खियों को नहीं रोकता है। नियंत्रण व्यंजनों में लक्षित ज़ोन में मधु मक्खियों द्वारा लगाए जाने का मतलब सीए था । 352 ± 60 एस, सीए की तुलना में 282 ± 43 एस पेट्री डिश के भीतर मधु मक्खियों के लिए जो कि मिश्रित एसिड युक्त चीनी-एगरोज़ क्यूब्स था। चित्रा 8 बी अलग-अलग मधुमक्खियों पर इसी तरह के प्रतिरोध प्रभाव वाले डीईईटी के अलावा एक यौगिक का प्रतिनिधित्व करता है। शहद के मधुमक्खियों के नियंत्रण पेट्री डिश में अंदर सीए के एक औसत समय के लिए लक्ष्य क्षेत्र में बने रहे । सीए की तुलना में 493 ± 31 एस । शहद के मधुमक्खियों के लिए 23 ± 3 एस में पेट्री डिश के भीतर एक चीनी-एगरोज़ घन होता है जिसमें मिश्रित बी के साथ संचार होता है। ये परिणाम मधु मक्खियों के लिए रासायनिक बाधाओं की जांच के लिए इस प्रोटोकॉल के उपयोग को मान्य करते हैं। इस प्रोटोकॉल को ब्याज के यौगिकों के साथ चलाने से पहले, हो सकता हैमधु मक्खियों के लिए भुखमरी के समय की मात्रा निर्धारित करने के लिए समय-समय पर परीक्षण करने के लिए आवश्यक हो।
चित्रा 7: दृश्य ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर डिसेंटेंस प्रोटोकॉल पॉजिटिव कंट्रोल डीईईटी से उदाहरण के परिणाम शहद मधुमक्खियों को शाम में एक हाइव से एकत्र किया जाता है और निकालने का समय दर्ज किया जाता है। तब उन्हें एक प्लास्टिक के कंटेनर में स्थानांतरित किया जाता है जिसमें वायु छेद होते हैं। बॉक्स को इन्क्यूबेटर सेट में 32 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया है और 15 घंटे के लिए रातोंरात रखा गया है। निम्नलिखित सुबह, व्यक्तियों को पेट्री डिश में रखा जाता है जिसमें या तो नियंत्रण शर्करा-agarose घन या डीईईटी-इन्वर्क्स्ड शुगर-एगरोज क्यूब होता है। वर्णित निवारण प्रोटोकॉल तब चलाया जाता है। इस आंकड़े में दिखाए गए परिणाम रिपेलेंसी गोल्ड मानक डीईईटी के लिए विशिष्ट हैं। इस आंकड़े से हम देखते हैं कि एक भूखे मधु मक्खन खाने के समय में जितने समय व्यतीत करेंगेएक नियंत्रण क्यूब ( सीए। 343 एस) के साथ एक डीईईटी ( सीए 16 एस) के साथ गर्भवती घन के साथ खिला क्षेत्र में व्यतीत होने वाले औसत समय की तुलना में काफी अधिक है (पी <0.0001)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 8: विजुअल ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर से कम्पाउंड के परीक्षण के उदाहरण ( ए ) डेटा का प्रतिनिधित्व करता है जो नियंत्रण व्यंजन ( सीए। 352 एस) में लक्ष्य क्षेत्र के व्यक्तियों द्वारा बिताए गए औसत समय को दर्शाता है, यौगिक ए ( सीए 282 एस के साथ परीक्षण किए गए व्यंजनों में लक्ष्य क्षेत्र में बिताए गए औसत समय से काफी अंतर नहीं है )। ( बी ) नियंत्रण संतुलन के बीच लक्ष्य क्षेत्र में बिताए गए औसत समय में महत्वपूर्ण अंतर दिखाने वाले डेटा का प्रतिनिधित्व करता हैएसई ( सीए 493 एस) और मिश्रित बी-कंवर्ज़ क्यूब्स ( सीए 23 एस)। महत्व निर्धारित करने के लिए एक अनपेक्षित टी-परीक्षण चलाया गया (पी <0.0001; डीएफ 15)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
यह दृश्य ट्रैकिंग प्रोटोकॉल मधु मक्खियों के लिए अपेक्षाकृत तेज़ और आसान तरीके से रासायनिक बाधाओं को स्क्रीन करने के लिए सरल दृष्टिकोण प्रदान करता है। मधु मक्खियों के लिए रासायनिक बाधाओं के प्रयोगशाला परीक्षण के लिए कोई सिफारिश नहीं प्रोटोकॉल हैं। पिछला अर्ध-और पूर्ण-क्षेत्रीय अध्ययन ने शहद मधुमक्खी विकारों की जांच 14 , 15 ; हालांकि वर्णित प्रोटोकॉल समय लेने वाली, श्रम-गहन होते हैं, और सामान्य प्रयोगशाला के बाहर अतिरिक्त सुविधा संसाधनों की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल को शहद के मधुमक्खियों के साथ ऐसे यौगिकों के सेमी-या पूर्ण-क्षेत्र परीक्षण से पहले रासायनिक बाधाओं के पूर्व-अपेक्षित मूल्यांकन के रूप में डिजाइन किया गया था।
शहद के बाहर शहद के लिए रासायनिक बाधाओं का मूल्यांकन करने के लिए व्यक्ति को जांचने के दौरान चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। उदाहरण के लिए, मधु मक्खियों सामाजिक कीड़े हैं जो कि हाइव के भीतर फेरोमोन पर भरोसा करते हैं जो 14 व्यवहार को प्रभावित करती है। इस प्रोटोकॉल की आवश्यकताभुखमरी के अलावा व्यक्तियों के उपयोग को फिर से रखें, जो अब फेरोमोन संकेत प्राप्त नहीं करते हैं। अलग-अलग मधु मक्खियों के खिला प्रतिक्रियाओं को मानकीकृत करने के लिए भुखमरी की आवश्यकता होती है। भुखमरी का समय 24 घंटे के समय के अध्ययन से निर्धारित किया गया था। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि भुखमरी व्यक्तिगत मधु मक्खियों पर हानिकारक प्रभाव हो सकती है। उदाहरण के लिए, मधुमक्खी मधुमक्खी मधुमक्खी के छत्ते से संग्रह के बाद 18 घंटे में सुस्त हो जाते हैं। इन टिप्पणियों के आधार पर, शहद मधुमक्खियों के पोते से संग्रह के बाद 15 घंटे भूखे थे।
असफल स्क्रीनिंग से बचने के लिए इस प्रोटोकॉल से जुड़े महत्वपूर्ण कदमों में शामिल हैं: (1) कम से कम 12 घंटे की भूख के बाद परीक्षण कराना; (2) भुखमरी 18-19 घंटे से अधिक होने के बाद परीक्षण करने से बचें, क्योंकि यह मधु मक्खी की शक्ति कम हो जाती है; (3) प्रत्येक परीक्षण के लिए नियंत्रण व्यक्तियों की जगह; और (4) एरेनाओं के भीतर बाहरी प्रकाश और नियंत्रण छाया का प्रबंधन। इसके अतिरिक्त, पेट्री डिश को एक नया परिसर स्कैनिंग करने से पहले प्रतिस्थापित किया जाना चाहिएरीन। कभी-कभी, मधुमक्खी मधुमक्खी पेट्री डिश के दौरान रिकार्डिंग के दौरान मलजल करेंगे। यह आमतौर पर रिकॉर्डिंग या डेटा संग्रह में हस्तक्षेप नहीं करता है। सभी पेट्री व्यंजन को प्रत्येक स्क्रीन के बाद अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए ताकि शर्करा-एगरोज़ और मिश्रित अवशेषों के साथ-साथ मधु मक्खी के मल को हटाया जा सके।
यह प्रोटोकॉल मुख्य रूप से मधु मक्खियों के प्रति प्रतिरोध के लिए यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, लेकिन आसानी से अन्य कीट प्रजातियों में प्रतिरोध को समझने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। विज़ुअल ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करने का एक बड़ा लाभ यह है कि यह प्रत्येक परिसर के स्क्रीनिंग के लिए एक पूर्ण वीडियो रिकॉर्डिंग बनाता है यदि प्रत्येक रिकॉर्डिंग की समीक्षा और विश्लेषण करने की आवश्यकता है, तो अन्वेषक ब्याज की फ़ाइल का चयन कर सकता है और फिर से उसी या नए पैरामीटर के साथ स्क्रीन को तुरंत व्यवस्थित कर सकता है। दृश्य ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर में एक मधु मक्खी की तुलना में छोटे कीटों की पहचान करने की क्षमता भी होती है। हालांकि, यह कैमरे के क्षेत्र और कम क्षेत्र के लिए दृष्टि के कम क्षेत्र की आवश्यकता हो सकती हैएक एकल स्क्रीन में रिकॉर्ड किया जाना है। इस प्रोटोकॉल की ताकत एक प्रयोगशाला सेटिंग में निवारक प्रभावों के लिए मिनटों में यौगिकों को स्क्रीन करने की क्षमता है। जैसे, क्षेत्र परीक्षण के लिए उम्मीदवारों की एक संख्या में ब्याज की एक संगठनात्मक पुस्तकालय को कम करके समय और धन बचाया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम विज़ुअल ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर और उपकरण के उपयोग के लिए डॉ। थॉमस कुहर को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम अपनी तकनीकी सहायता के लिए जेम्स विल्सन और स्कॉट ओ'नल को धन्यवाद देते हैं
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Kimax | 26500-50 | used for making the sugar/agarose cubes |
| Sugar | Kroger | any similar product will sufffice | |
| Deionized water | acquired in house | ||
| Agarose | Apex | 20-102 | used for making the sugar/agarose cubes |
| Mold for agarose cubes (Weigh Boat) | any mold that will provide the researcher with a 1.5 cm x 1.5 cm x 0.3 cm sugar/agarose cube will suffice | ||
| EthoVision XT | Noldus | visual tracking software | |
| 633 nm LEDs | Cyron | HTP904E | These lights were placed into a constructed light box to illuminate the arenas from below. The box was a simple wooden structure with a frosted plastic/plexi glass cover that allowed the light to disperse upwards without any glare. |
| Laptop or PC | Dell | Inspiron One 2305 | necessary for video tracking software. Any pc device capable of runnin tbe visual tracking software will suffice |
| Bee Keeping protective clothing | Dadant & Sons Inc | V0126 | any protective hood and jacket will suffice |
| Hive tool | Dadant & Sons Inc | M00757 | used to open honey bee hive |
| Container for honey bees | any container suitable for housing and storing honey bees will suffice | ||
| Featherweight forceps narrow tip | Bioquip | 4748 | used to select individual honey bees |
| 9 cm (diameter) Petri dish | Fisher Scientific | S01778 | arena used to contain individual honey bees during video tracking |
| Recording Device (Camera) | Basler | acA-1300-60gm | any device that can record the subject clearly and transfer the file to a computer will suffice |
| GraphPad Prism | Graphpad | any statistical software package will suffice |
References
- Gallai, N., Salles, J. M., Settele, J., Vaissière, B. E. Economic valuation of the vulnerability of world agriculture confronted with pollinator decline. Ecol Econ. 68 (3), 810-821 (2009).
- van Engelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, Suppl 1. S80-S95 (2010).
- Aizen, M. A., Harder, L. D. The Global Stock of Domesticated Honey Bees Is Growing Slower Than Agricultural Demand for Pollination. Current Biol. 19 (11), 915-918 (2009).
- Smith, K. M., Loh, E. H., Rostal, M. K., Zambrana-torrelio, C. M., Mendiola, L., Daszak, P. Pathogens, Pests, and Economics Drivers of Honey Bee Colony Declines and Losses. Ecohealth. 10, 434-445 (2014).
- Mullin, C. A., Frazier, M., et al. High Levels of Miticides and Agrochemicals in North American Apiaries: Implications for Honey Bee Health. PLoS ONE. 5 (3), (2010).
- Li, Y., Kelley, R. A., Anderson, T. D., Lydy, M. J. Development and comparison of two multi-residue methods for the analysis of select pesticides in honey bees, pollen, and wax by gas chromatography - quadrupole mass spectrometry. Talanta. 140, 81-87 (2015).
- Kakumanu, M. L., Reeves, A. M., Anderson, T. D., Rodrigues, R. R., Williams, M. A., Williams, M. A. Honey Bee Gut Microbiome Is Altered by In-Hive Pesticide Exposures. Front Microbiol. 7, 1-11 (2016).
- Katz, T. M., Miller, J. H., Hebert, A. A. Insect repellents: Historical perspectives and new developments. J Am Acad Dermatol. 58 (5), 865-871 (2008).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents. Pestic Biochem Phys. 106 (3), 149-155 (2013).
- Lawrence, K. L., Achee, N. L., Bernier, U. R., Mundal, K. D., Benante, J. P. Field Evaluations of Topical Arthropod Repellents in North, Central, and South America. J Med Entomol. 51 (5), 980-988 (2014).
- Collins, A. M., Rubink, W. L., Cuadriello Aguilar,, I, J., Hellmich Ii,, L, R. Use of insect repellents for dispersing defending honey bees (Hymenoptera Apidae). J Econ Entomol. 89 (3), 608-613 (1996).
- Brown, M., Hebert, A. A. Insect repellents: An overview. J Am Acad Dermatol. 36 (2), 243-249 (1997).
- Teeters, B. S., Johnson, R. M., Ellis, M. D., Siegfried, B. D. Using video-tracking to assess sublethal effects of pesticides on honey bees (Apis mellifera L.). Environ Toxicol Chem. 31 (6), 1349-1354 (2012).
- Vallet, A., Cassier, P., Lensky, Y. Ontogeny of the fine structure of the honeybee (Apis mellifera L.) workers and the pheromonal activity of 2-heptanone. J Insect Physiol. 37 (11), 789-804 (1991).
- Free, J. B., Ja Pickett,, Ferguson, aW., Simpkins, J. R., Smith, M. C. Repelling foraging honeybees with alarm pheromones. J Agr Sci. 105 (2), 255 (1985).
