Summary
꿀벌 식민지의 손실은 작물 수분 서비스에 대한 도전입니다. 현재의 pollinator 보호 관행은 혐기성 화학 물질을 사용하여 유해한 농약에 대한 꿀벌의 접촉을 최소화하기위한 대체적인 접근법을 보증합니다. 여기서 우리는 벌에 대한 억지력을 스크린하기위한 시각적 추적 프로토콜에 대한 상세한 방법을 제공합니다.
Abstract
유럽 달콤한 꿀벌, Apis mellifera L. 는 매년 수십억 달러를 번다 경제적으로 농업 적으로 중요한 수분 제입니다. 꿀벌의 식민지 수는 미국과 1947 년 이래 많은 유럽 국가에서 줄어들고 있습니다. 꿀벌을 살충제에 의도하지 않게 노출시키는 것을 포함하여 여러 가지 요인이이 감소에 영향을줍니다. 새로운 수법과 규정의 개발은 이러한 수분제에 대한 농약 노출을 줄이기 위해 보장된다. 한 가지 접근법은 최근의 살충제 처리 작물에서 꿀벌을 억제하는 혐오 화학 물질의 사용입니다. 여기에서는 혐오 화학 물질을 선택하기 위해 노출 된 꿀벌의 억지력을 식별하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 꿀벌 사료를 수집하기 위해 시험 전 15 시간 동안 배양기에서 밤새도록 굶어 죽 읍니다. 개별 꿀벌은 설탕 - 아가 로즈 큐브 (제어 처리) 또는 설탕 - 아가로 오스 - 복합 큐브 (혐오 처리)가있는 페트리 접시에 배치됩니다접시의 중간에. 페트리 접시는 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 꿀벌의 운동 활동을 기록하는 라이트 박스에 카메라 아래에 배치되는 경기장 역할을합니다. 총 8 개의 대조구와 8 개의 혐오 치료제를 10 분 동안 분석하여 각각의 처리를 새로운 꿀벌과 중복시켰다. 여기에서 우리는 혼합 된 처리로 꿀벌이 설탕 - 아가로 오스 큐브에서 차단된다는 것을 보여줍니다. 꿀벌은 추가 화합물없이 당 - 아가로 오스 큐브에 끌립니다.
Introduction
유럽 달콤한 꿀벌, Apis melliferaL. 은 전 세계적으로 2 천억 달러가 넘는 수분 공급 서비스를 제공하는 경제적 및 농업 적으로 중요한 곤충이다. 미국과 유럽에서는 꿀벌의 식민지 수가 감소하고 있습니다. 미국은 캘리포니아 를 잃었다. 1947-2008 년에 관리 된 꿀벌 군체의 60 %가 유럽을 잃어 버렸습니다. 1961-2007 년의 27 % 2 , 3 . 기생충 감염, 병원체 감염, 양봉 관행, 살충제 사용 등이 포함 되나 이에 국한되지 않는 식민지 손실의 증가를 초래할 수있는 요인에는 여러 가지가 있습니다.
꿀벌은 두 가지 주요 경로를 통해 살충제에 노출 될 수 있습니다. 하이브 외부의 살충제 노출은 사료를 먹은 개인이 작물과 접촉 할 때 발생할 수 있습니다.해충으로부터 보호하기 위해 화학 약품을 뿌렸습니다. 하이브 내 살충제 노출은 양봉가가 진드기, 박테리아 및 미생물 오염과 같은 병원성 해충 및 병원균을 통제하기 위해 화학 물질을 사용하는 경우에 발생할 수 있습니다 4 . 살충제 잔류 물은 미국과 캐나다의 24 개 양봉장에서 추출한 왁스, 꽃가루, 꿀벌 시료에서 확인되었습니다 5,6. 살충제 접촉이 꿀벌에 미치는 영향에는 급성 독성뿐만 아니라 마비, 방향 감각 상실 및 행동 및 건강 변화와 같은 치명적이지 않은 영향이 포함됩니다. 현대 농업은 농작물 수확량을 유지하기 위해 살충제 사용을 요구하기 때문에 이러한 화학 물질은 앞으로도 계속 의존하게 될 것입니다 2 . 살충제 노출로부터 꿀벌을 더 잘 보호하기 위해 새로운 프로토콜 및 규정 5 의 개발이 필요합니다.보호를위한 한 가지 가능한 접근법은 음식을 먹이로 먹는 동안 꿀벌이 살충제에 노출되는 것을 줄이기 위해 방수제를 사용하는 것입니다.
방충제 (IR)는 전형적으로 절지 동물 질병 매개체에 대한 개인적 물기 보호 조치로 사용되어왔다. 60 년 이상 전에 개발 된 가장 널리 사용되고 성공적인 IR은 DEET 8 , 9 입니다. 곤충 퇴치 시험의 금본위 제로 간주되며 세계 보건기구 및 환경 보호국 (EPA)에 의해 새로운 방충제 선별 검사에 대한 긍정적 인 통제로 사용됩니다 10 . 또한 DEET는 꿀벌을 위협에서 식민지로 흩어지게하는 것으로 밝혀졌습니다. 개인 IR과 관련된 현재의 특성은 다음과 같습니다 : (1) 광범위한 절지 동물에 대한 지속적인 효과; (2) 피부 또는 의복에 바르면 사용자에게 비자 극적이다; (3) 무취 또는쾌적한 냄새; (4) 의복에 아무런 영향을 미치지 않는다. (5) 피부에 바르거나 사용자의 발한, 씻기 및 닦기에 지장이없는 유성 외관; (6) 일반적으로 사용되는 플라스틱에는 영향을 미치지 않습니다. (7) 화학적으로 안정하고 광범위하게 사용하기에 적당하다. 꿀벌에 사용되는 방충제는 화학적으로 안정하고 널리 사용하기에 알맞고 냄새가 없거나 쾌적한 냄새가 나지 않는 지속 효과, 꿀벌에 무독성과 같은 몇 가지 속성 만 필요합니다. 그러나, 이러한 특성을 깊이 탐구하기 전에, 높은 처리율로 발수 / 억제를 위해 화합물을 스크리닝하는 방법이 필요하다. 여기에서는 꿀벌의 억제를위한 화합물을 스크리닝하는 실험실 분석을위한 프로토콜을 설명합니다. 이는 혐오 성을 결정하는 중요한 단계입니다. 다음 프로토콜은 꿀벌 13 에 대한 살충제의 준 치사 효과를 평가하기위한 시각 추적 방법을 설명하는 이전 연구에서 수정되었습니다. 하우이 프로토콜은 살충제 처리 작물에서 꿀벌을 억제 할 수있는 방충제의 영향을 측정하도록 고안되었습니다. 꿀벌의 화학 억제제에 대한 실험실 테스트에 권장되는 프로토콜이 없으므로이 프로토콜은 이러한 화합물을 스크리닝하는 간단한 방법을 제공합니다.
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Protocol
1. 설탕 - 아가로 오스 큐브 준비
- 설탕 8 g을 달아 50 mL 삼각 플라스크에 넣으십시오.
- 삼각 플라스크에 20 mL의 탈 이온수를 채 웁니다. 플라스크를 소용돌이 칠하여 설탕을 녹이십시오.
- 170 mg의 아가로 오스를 달아 설탕 용액에 첨가합니다.
- 25 초 동안 전자 레인지에 설탕 - 아가로 오스 용액을 가열하십시오. 아가로 오스를 설탕 용액에 녹이십시오.
- 플라스크와 설탕 - 아가로 오스 용액을 식힌다.
참고 : 플라스크는 차갑게 만져야하지만 용액이 고형화되지 않도록하십시오.- 대조군 처리를 위해 설탕 - 아가로 오스 큐브를 준비하려면 반 냉각 된 설탕 - 아가로 오스 용액을 무게 보트 몰드에 부으십시오.
참고 : 계량 보트 몰드는 1.5 x 1.5 x 0.3 cm 3 크기 입니다. - 방충 처리를 위해 당류 - 아가로 오스 - 화합물 큐브를 준비하려면 반 냉각 용액에 원하는 양의 화합물을 첨가하십시오 ( 예 : 1 % DEET in s우거 - 아가로 오스 용액 (v / v)). 화합물을 혼합하기 위해 플라스크를 돌린 다음 용액을 무게 보트 몰드에 부으십시오.
참고 :이 시점에서 8 개의 제어 몰드와 8 개의 테스트 몰드가 준비됩니다. 제어 몰드에는 방충제가 포함되어 있지 않습니다.
- 대조군 처리를 위해 설탕 - 아가로 오스 큐브를 준비하려면 반 냉각 된 설탕 - 아가로 오스 용액을 무게 보트 몰드에 부으십시오.
- 5-10 분 동안 냉장고의 몰드에서 설탕 - 아가로 오스 큐브를 냉각시킵니다. 무게가 나가는 뚜껑 몰드에서 고형 설탕 아가로 오스 큐브를 꺼내고 축축한 종이 타월로 플라스틱 용기에 넣으십시오.
- 용기를 보관 용 냉장고에 넣으십시오. 설탕 - 아가로 오스 큐브는 준비 7 일 이내에 사용해야합니다.
2. 비디오 트래킹 소프트웨어 프로그래밍 및 실험 설정
- 실험 탐색기 막대의 실험 설정 (화면의 왼쪽에있는 추적 소프트웨어에서 자료 표 참조)에서 올바른 카메라가 선택되고 비디오 녹화가 페트리 접시 경기장 중앙에 있는지 확인하십시오.
- 비디오 녹화를 중앙에 놓아야하는 경우 카메라 설정 및 AOI 제어 아래로 이동하여 가운데 X 및 중앙 Y 옵션을 선택하십시오.
- 실험 설정에서 경기장 수를 16 개로 변경합니다. 추적 된 기능에서 중심점 감지를 선택합니다.
- 분석을 위해 원하는 경기장을 설정하려면 경기장 설정을 선택하십시오.
- 16 개의 페트리 접시를 카메라 아래에있는 라이트 박스 위에 4 x 4 패턴으로 놓습니다 ( 그림 1 ).
참고 :이 요리는 녹음 영역을 만드는 데 사용되며 비어 있습니다.
- 16 개의 페트리 접시를 카메라 아래에있는 라이트 박스 위에 4 x 4 패턴으로 놓습니다 ( 그림 1 ).
그림 1 : 라이트 박스에 페트리 접시 배치. 배양 접시는 라이트 박스 위에 4 x 4 블록으로 배열됩니다. 이 배치는 v에 대한 제어 및 방수 처리를 쉽게 식별 할 수있게합니다.실제 추적 프로토콜. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 투기장 설정에서 오른쪽 툴 패널에있는 배경 잡기 버튼을 사용하여 16 개의 페트리 접시를 찍습니다. 이것은 경기장을 설정하기위한 템플릿으로 사용됩니다.
- 투기장 설정 화면의 상단에있는 툴바에서 "타원 만들기"를 선택하고 이미지에있는 페트리 접시 중 하나의 직경과 일치하는 원을 만듭니다. Arena 1 마커를 원에 놓습니다 ( 그림 2 ).
그림 2 : Visual Tracking Software Arena 설정의 스크린 샷 원 안의 대각선 줄무늬를 관찰하면 원 안에 감지 영역이 있는지 확인할 수 있습니다. 에이 구역 1 마커는 각 사각형에 대해 제공되며 각 페트리 접시의 대상 구역을 정의합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 오른쪽 툴 패널의 Arena 1 아래에있는 "Zone Group 1"을 선택하십시오. 화면 상단의 도구 모음에서 "사각형 만들기"를 선택하십시오. 이것을 사용하여 30 x 30 픽셀 사각형을 만든 다음 이전 단계에서 만든 원의 가운데에 위치시킵니다. 상단 도구 모음에서 "영역 추가"를 선택한 다음 정사각형 가운데를 클릭하십시오. 구역 1 마커를 정사각형으로 이동하십시오.
참고 : 생성 된 사각형은 먹이 영역이며 먹이 영역은 당 - 아가로 오스 큐브보다 약간 큰 경우 나열된 크기와 정확하게 동일해야합니다.
les / ftp_upload / 55603 / 55603fig3.jpg "/>
그림 3 : 완성 된 투기장 설정의 스크린 샷. 완성 된 경기장 설정은 다음 예제와 같아야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 오른쪽 툴 패널에서 "Arena 1"을 선택한 다음 duplicate complete arena를 클릭하십시오. 드롭 다운 메뉴에서 "All Other Arenas"를 선택하고 확인을 클릭하십시오. 잡은 이미지의 나머지 페트리 디쉬에 복제 된 경기장 셋업을 옮깁니다 (그림 3).
- "Arena 1"을 선택한 다음 상단 툴바에서 "눈금 조정"을 선택하십시오. 투기장 1 페트리 접시의 직경에 걸쳐 교정 라인을 그립니다. 직경 측정을 9cm로 변경하십시오 (사용중인 페트리 접시의 직경). 오른쪽 툴 패널에서 "경기장 설정 확인"을 선택하십시오.
- 고르다 "왼쪽의 제어 막대에서 "탐지 설정"을 선택하십시오.
- "Detection Settings 1"을 선택한 다음 오른쪽 도구 상자에있는 드롭 다운 메뉴에서 "Gray Scaling"을 선택하십시오. 탐지시 범위가 0에서 83이되도록 설정합니다 ( 그림 4A ).
- "Detection Settings"을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 "Detection Settings 2"라는 새 설정을 지정하십시오. "회색 스케일링"이 선택되어 있는지 확인하고 다른 매개 변수는 변경하지 마십시오.
참고 : 경기장 위의 비디오 창에는 큰 노란색 원이 표시됩니다. 이렇게하면 녹음하기 전에 배양 접시를 올바른 위치에 배치하는 데 도움이됩니다 ( 그림 4B ).
그림 4 : 탐지 설정 1과 2의 스크린 샷 ( A ) a에 대해 수정 된 회색 스케일링으로 경기장이 어떻게 보이는지 보여줍니다.페 트리 접시에 달콤한 꿀벌 주제. ( B ) 시도 사이에 페트리 접시의 위치를 정할 수 있도록 경기장 탐지 영역을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- Experimental Explorer에서 "Trial List"를 선택하고 상단 툴바에서 "Add Variable"을 클릭하십시오. 사용자 정의 변수의 이름을 "치료"로 지정하십시오. 사용자 정의 치료 칼럼의 "Predefined Values"드롭 다운 바를 선택하고 C (대조)와 T (치료)를 미리 정의 된 값으로 추가하십시오. 상단 툴바에있는 "Add Trials"버튼을 선택하십시오. 두 번의 시련을 추가 한 다음 각 경기장이 제어 경기장 (C)인지 치료 경기장 (T)인지 선택하십시오 ( 그림 5 ).
Fi그림 5 : 평가판 목록의 스크린 샷. 프로그램이 여기 정보를 사용하여 데이터를 분리하여 통계적으로 분석하기 때문에 경기장에 올바르게 레이블을 지정하는 것이 중요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- Experiment Explorer 패널 아래의 "Data Profile"을 선택하십시오. 왼쪽 열에서 "사용자 정의 독립 변수"제목 아래에있는 "치료"를 선택하십시오. 그러면 플로우 차트가있는 영역에 "필터"상자가 추가됩니다. 팝업 상자에서 "C"를 선택한 다음 새로 만든 필터를 "시작"상자와 "결과 1"상자 사이에 놓습니다. 순서도 화살표는 시작 상자에서 필터까지 그리고 마지막으로 결과 1을 가리 키도록 조정해야합니다.
- 2.12 단계를 반복하십시오. 그러나 이번에는 필터에 "T"를 선택한 다음"공통 요소"섹션에서 "결과". 새로 생성 된 상자를 순서도 영역으로 이동하고 화살표로 상자를 연결하십시오 ( 그림 6 ).
그림 6 : 데이터 프로파일의 스크린 샷. 이것은 통계 분석에서 적절한 구분을 얻기 위해 순서도를 설정하는 방법을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 파일을 저장하십시오.
3. 꿀벌 개인 수집
- 보호 복을 착용하고 꿀벌 (주로 사육자)을 모으기 위해 하이브를 선택하십시오.
- 하이브의 외부 및 내부 덮개를 제거합니다. 하이브 도구를 사용하여 꿀벌을 포함하지 않는 위쪽의 벌집 몸체에서 프레임을 선택하십시오.하이브 박스에서 조심스럽게 프레임을 들어 올리십시오.
- 꿀벌 여왕을위한 구조를 검사하십시오. 그녀가 없다면 프레임에서 꿀벌 작업자를 수송 용 컨테이너로 청소하십시오. 충분한 수의 개체를 모아서 시험 할 각 화합물에 대해 2 회 완전한 시험을 시행 할 수 있습니다 (대조군과 함께 시험 당 16 개체 사용).
주 : 수집 된 개인은 주로 먹는 식물이어야한다; 그러나 컬렉션에 포함 된 간호사 꿀벌과 같은 다른 노인이있을 수 있습니다. - 꿀벌이 제거 된 시간을 적어 두십시오. 공기 구멍이있는 9 cm x 7 cm x 9 cm 플라스틱 상자에 그들을 옮기고 32 ° C 및 70 % 상대 습도의 배양기에 넣으십시오.
- 15 시간 동안 꿀벌을 굶어 라.
참고 : 이것은 일반적으로 테스트하기 전에 저녁 꿀벌을 수집하는 경우에 가장 효과적입니다.
4. 시각 추적 분석 수행
- 시각적 추적 프로그램을 시작하고 저장을 엽니 다.이 분석을 위해 만들어진 실험 파일.
- "Detection Settings 2"를 선택하십시오.
- 16 개의 페트리 접시 중 8 개의 센터에 대조구 설탕 - 아가로 오스 큐브를 놓으십시오. 나머지 8 가지 설탕 - 아가로 오스 - 화합물 (억지력) 큐브와 함께이 과정을 반복하십시오.
- 포셉을 사용하여 플라스틱 상자에서 단일 꿀벌을 제거하고 그것을 컨트롤 페트리 접시 중 하나에 넣으십시오.
- 나머지 15 페트리 접시에 대해 4.4 단계를 반복하십시오.
- 모든 접시를 라이트 박스에 놓고 탐지 설정 영역 2 (탐지 설정 2가 선택되었을 때 컴퓨터 화면에 표시됨)가 각 페트리 접시 경기장에 맞도록 배치합니다. 적색 스펙트럼으로 설정된 일련의 LED 조명으로 아래에서 라이트 박스를 켜십시오. 전체 상자와 카메라를 검정색 플라스틱 시트로 둘러 싸서 외장을 없애고 경기장 내의 그림자를 줄입니다.
- 페트리 접시가 설정된 후에는 "Detection Settings 1"이선택한 설정.
참고 :이 시점에서 시각 추적 소프트웨어는 페트리 접시 경기장 내의 꿀벌 만 집어 야합니다. - Experiment Explorer에서 "Acquisition"을 선택하십시오. 오른쪽에있는 Acquisition Control (수집 제어) 팝업 상자에있는 녹색 "Start Trial (시작하기)"버튼을 눌러 녹음을 시작하십시오.
- 10 분 동안 분석을 실행 한 다음 Acquisition Control (수집 제어) 팝업 상자에서 빨간색 "Stop Trial (중지)"버튼을 클릭하여 기록을 중지하십시오.
- 페트리 접시에서 개체를 제거하고 두 번 테스트되지 않도록 별도의 컨테이너에 그들을 놓으십시오.
- 같은 화합물에 대한 두 번째 시험을 위해 4.4-4.10 단계를 반복하십시오.
참고 :이 방법은 사용자가 필요에 따라 치료 당 꿀벌의 수를 늘리도록 수정할 수 있습니다. - 실험 탐색기에서 통계를 선택한 다음 계산을 클릭하십시오.
- 데이터를 데이터 관리자 소프트웨어로 내보내고 다음을 사용하여 중요성을 분석합니다. 1-wTukey의 사후 테스트로 분산 분석, 선호 통계 소프트웨어 프로그램을 사용하여 unpaired t-test를 수행했습니다.
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Representative Results
시각적 추적 프로토콜은 설탕 - 아가로 오스 (대조 치료) 또는 당 - 아가로 오스 복합 큐브 (억제 치료)로 대상 구역에서 꿀벌이 소비 한 시간을 기록하기 위해 개발되었습니다. 기록 된 시간은 통계 소프트웨어 프로그램을 사용하여 분석되었고 목표 영역에서 평균 ± 표준 오차가 막대 그래프로보고되었습니다. 해충 퇴치 / 억제 시험의 황금 표준 인 DEET가이 프로토콜에서 긍정적 인 통제로 사용되었습니다. 설탕 - 아가로 오스 큐브 (음성 대조군)가 제공된 꿀벌은 표적 구역에서 343 ± 26 초를 보냈지 만 설탕 - 아가로 오스 -DEET (혐기성 물질)가 제공된 꿀벌은 표적 구역에서 16 ± 4 초를 보냈다 ( 그림 7 ). DEET는 표적 구역에서 꿀벌이 소비하는 시간을 대폭 감소 시켰습니다. 대조군 치료군에 비해 95 %였다.
이 프로토콜을 통해 꿀벌에 대한 억지력을 결정하는 데 관심있는 화합물을 선별했다. 도 8a는 표적 구역에서 음식 소스로부터 꿀벌을 억제하지 않는 화합물을 나타낸다. 대조구에서 목표 영역에있는 꿀벌이 소비 한 평균 시간은 ca 였습니다 . 352 ± 60 초, ca. 화합물 A가 주입 된 당 - 아가로 오스 큐브를 갖는 페트리 접시 내에서 꿀벌에 대해 282 ± 43 초. 도 8B는 개개의 꿀벌에 유사한 억제 효과를 갖는 DEET 이외의 화합물을 나타낸다. 대조 페트리 접시 안에있는 꿀벌은 평균 시간 동안 표적 구역에 남아있었습니다 . 493 ± 31 초, ca. 화합물 B가 함유 된 설탕 - 아가로 오스 큐브가 들어있는 페트리 접시 내의 꿀벌은 23 ± 3 초입니다.이 결과는 꿀벌의 화학적 억제제를 스크리닝 할 때이 프로토콜을 사용 함을 입증합니다. 관심있는 화합물로이 프로토콜을 실행하기 전에,벌꿀 벌에 대한 기아 상태의 양을 결정하기 위해 시간 경과 시험을 수행해야합니다.
그림 7 : 비주얼 추적 소프트웨어 억제 프로토콜의 예제 결과 긍정적 인 제어 DEET. 꿀벌은 저녁에 하이브에서 수집되며 제거 시간이 기록됩니다. 그런 다음 공기 구멍이있는 플라스틱 용기로 옮깁니다. 상자를 32 ℃로 설정된 배양기에 넣고 15 시간 동안 밤새 유지한다. 다음날 아침, 개인은 대조구 설탕 - 아가 로즈 큐브 또는 DEET - 주입 된 설탕 - 아가로 오스 큐브 중 하나를 포함하는 페트리 접시에 배치됩니다. 기술 된 억지 프로토콜이 실행된다. 이 그림에 표시된 결과는 repellency gold standard-DEET의 전형적인 결과입니다. 이 그림에서 우리는 굶주린 꿀벌이 먹이는 데 소비하는 평균 시간을 알 수 있습니다.Control cube ( 약 343 s)를 가진 사람은 DEET ( 약 16 초)가 함침 된 입방체를 먹이는 구역에서 개인이 보내는 평균 시간보다 유의하게 더 컸다 (P <0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : Visual Tracking Software에서 테스트 한 화합물의 결과 예제. ( A ) 대조구 (대상 약 352 초)에서 대상 구역의 개인이 소비 한 평균 시간이 화합물 A로 검사 된 접시에서 목표 구역에서 보낸 평균 시간과 큰 차이가 없음을 보여주는 데이터를 나타냅니다 ( 약 282 초 ). ( B ) 통제 새끼 사이의 목표 영역에서 보낸 평균 시간의 유의 한 차이를 나타내는 데이터를 나타냅니다es ( 약 493 초) 및 화합물 B 주입 큐브 ( 약 23 초). unpaired t-test를 시행하여 유의성을 결정 하였다 (P <0.0001; DF 15). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 시각 추적 프로토콜은 상대적으로 빠르고 쉬운 방법으로 꿀벌의 화학적 억제력을 스크리닝하는 간단한 방법을 제공합니다. 꿀벌의 화학 억제제에 대한 실험실 테스트에 권장되는 프로토콜은 없습니다. 이전 세미 및 풀 필드 연구는 꿀벌 방수제 14 , 15 ; 설명 된 프로토콜은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 일반적인 실험실 외부에서 추가 시설 리소스가 필요합니다. 이 프로토콜은 꿀벌과 같은 화합물의 세미 또는 전체 필드 테스트에 앞서 화학 억제제의 사전 필수 평가로 설계되었습니다.
하이브 외부의 꿀벌에 대한 화학적 억제력을 평가하는 개인을 심사 할 때 어려움이 있습니다. 예를 들어, 꿀벌은 행동에 영향을 미치는 하이브 내 페로몬에 의존하는 사회적 곤충입니다 14 . 이 프로토콜 requi기아뿐만 아니라 페로몬 신호를 더 이상받지 않는 개인의 사용을 재촉하십시오. 기아는 개별 꿀벌의 수유 반응을 표준화하기 위해 필요합니다. 기아 상태 시간은 24 시간 경과 연구에 의해 결정되었다. 굶주림은 개별 꿀벌에 해로운 영향을 미칠 수 있음에 유의해야합니다. 예를 들어 벌집에서 수집 한 18 시간 후 꿀벌은 기면 상태가됩니다. 이러한 관찰을 바탕으로 벌집에서 수집 한 후 15 시간 동안 꿀벌을 굶었습니다.
실패한 스크리닝을 피하기 위해이 프로토콜과 관련된 중요한 단계는 다음을 포함합니다. (1) 기아가 적어도 12 시간 후에 테스트를 수행합니다. (2) 굶주림이 18-19 시간을 초과 한 후에 시험 실시를 피하십시오. (3) 각 시험에 대한 통제 개인을 대체; (4) 경기장 내의 외장 및 제어 그림자 관리. 또한, 새로운 화합물 sc를 스크리닝하기 전에 배양 접시를 교체해야합니다reen. 때로는 꿀벌이 기록하는 동안 페트리 접시에서 배설물을 제거합니다. 일반적으로 녹음 또는 데이터 수집을 방해하지 않습니다. 각 페트리 접시는 설탕 - 아가로 오스 및 화합물 잔류 물뿐만 아니라 꿀벌 배설물을 제거하기 위해 각 화면 후 철저히 세척해야합니다.
이 프로토콜은 주로 꿀벌에 대한 억지력을 위해 화합물을 스크리닝하기 위해 고안되었지만 다른 곤충 종에서 억지력을 식별하는 데 쉽게 적용 할 수 있습니다. 시각적 추적 소프트웨어 사용의 주요 이점 그것은 각 화합물의 스크리닝을위한 완전한 비디오 녹화를한다는 것입니다. 조사자가 각 기록을 검토하고 분석 할 필요가있는 경우 연구자는 관심있는 파일을 선택하고 동일하거나 새로운 매개 변수를 사용하여 신속하게 화면을 다시 수행 할 수 있습니다. 시각 추적 소프트웨어는 또한 꿀벌보다 작은 개별 곤충을 탐지하는 기능을 가지고 있습니다. 그러나, 이것은 카메라 분야에 대한 감소 된 시야를 요구할 수 있으며,s를 단일 화면에 기록 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 강점은 실험실 환경에서 억제 효과를 위해 수분 내에 화합물을 스크리닝하는 능력입니다. 따라서 관심 분야의 화합물 라이브러리를 현장 테스트를 위해 선택한 후보 수로 줄임으로써 시간과 비용을 절약 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
시각적 추적 소프트웨어 및 장비 사용에 대해 Thomas Kuhar 박사에게 감사드립니다. 기술 지원에 대해 James Wilson과 Scott O'Neal에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Kimax | 26500-50 | used for making the sugar/agarose cubes |
| Sugar | Kroger | any similar product will sufffice | |
| Deionized water | acquired in house | ||
| Agarose | Apex | 20-102 | used for making the sugar/agarose cubes |
| Mold for agarose cubes (Weigh Boat) | any mold that will provide the researcher with a 1.5 cm x 1.5 cm x 0.3 cm sugar/agarose cube will suffice | ||
| EthoVision XT | Noldus | visual tracking software | |
| 633 nm LEDs | Cyron | HTP904E | These lights were placed into a constructed light box to illuminate the arenas from below. The box was a simple wooden structure with a frosted plastic/plexi glass cover that allowed the light to disperse upwards without any glare. |
| Laptop or PC | Dell | Inspiron One 2305 | necessary for video tracking software. Any pc device capable of runnin tbe visual tracking software will suffice |
| Bee Keeping protective clothing | Dadant & Sons Inc | V0126 | any protective hood and jacket will suffice |
| Hive tool | Dadant & Sons Inc | M00757 | used to open honey bee hive |
| Container for honey bees | any container suitable for housing and storing honey bees will suffice | ||
| Featherweight forceps narrow tip | Bioquip | 4748 | used to select individual honey bees |
| 9 cm (diameter) Petri dish | Fisher Scientific | S01778 | arena used to contain individual honey bees during video tracking |
| Recording Device (Camera) | Basler | acA-1300-60gm | any device that can record the subject clearly and transfer the file to a computer will suffice |
| GraphPad Prism | Graphpad | any statistical software package will suffice |
References
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