Summary
इस वीडियो लेख ऊतकीय विश्लेषण और चयापचय रूपरेखा के लिए विच्छेदन द्वारा एक माउस से अग्ंयाशय को सफलतापूर्वक हटाने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं का एक विस्तृत प्रदर्शन प्रदान करता है ।
Abstract
हम अग्ंयाशय विशिष्ट प्रतिलेखन कारक है, 1a cre-recombinase जांच कर रहा है; लोक्स-stop-लोक्स-िईद्भस्टेन चूहा सार्कोमा, glycine में एसपारटिक एसिड से 12 codon (Ptf1acre/ LSL-KrasG12D/+) मानव अग्नाशय के कैंसर के एक मॉडल के रूप में माउस तनाव । हमारे वर्तमान अध्ययन के लक्ष्य के लिए अग्नाशय के कैंसर की प्रगति के उपंयास चयापचय के निशान की पहचान है । हम मूत्र, मल, रक्त, और अग्न्याशय ऊतक निष्कर्षों के चयापचय की रूपरेखा का प्रदर्शन किया है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कैंसर प्रगति चरण के लिए अग्ंयाशय के ऊतकीय विश्लेषण । माउस अग्ंयाशय मानव में की तरह एक अच्छी तरह से परिभाषित ठोस अंग नहीं है, बल्कि एक diffusely वितरित नरम ऊतक है कि आसानी से माउस आंतरिक शरीर रचना विज्ञान या व्यक्तियों है कि कम या कोई अनुभव के साथ अपरिचित व्यक्तियों द्वारा की पहचान नहीं है प्रदर्शन माउस अंग विच्छेदन । इस अनुच्छेद के प्रयोजन के लिए एक विस्तृत कदम वार दृश्य प्रदर्शन प्रदान करने के लिए विच्छेदन द्वारा माउस अग्ंयाशय को हटाने में नौसिखिया गाइड है । यह लेख विशेष रूप से छात्रों और अनुसंधान के लिए नए जांचकर्ताओं के लिए मूल्यवान होना चाहिए कि चयापचय रूपरेखा या ऊतकीय विश्लेषण के लिए विच्छेदन द्वारा माउस अग्ंयाशय की कटाई की आवश्यकता है ।
Introduction
माउस मानव अग्नाशय के कैंसर1,2के एक महत्वपूर्ण पशु मॉडल के रूप में उभरा है । Ptf1a मेंcre/ LSL-KrasG12D/+ माउस मॉडल, िईद्भस्टेन चूहा सार्कोमा (कश्मीर रास) oncogene अग्न्याशय में विशेष रूप से सक्रिय है, अग्न्याशय में कैंसर के घावों की दीक्षा में जिसके परिणामस्वरूप, अग्नाशय intraepithelial neoplasias (PanINs) के रूप में जाना जाता है, कि प्रगति अग्नाशय वाहिनी adenocarcinomas, सामांयतः के रूप में संदर्भित करने के लिए PDACs3। इस माउस मॉडल प्रणाली मानव अग्नाशय के कैंसर के लिए सबसे अच्छा उपलब्ध पशु मॉडलों में से एक प्रदान करता है4,5, अतिरिक्त लाभ के साथ कि PanINs जीवन के पहले पांच महीनों के भीतर उभरने और अक्सर एक के भीतर PDAC प्रगति एकल वर्ष4,5, जबकि अग्नाशय के कैंसर सबसे अधिक बार उंर के 60-70 वर्ष मनुष्यों में होता है ।
Ptf1a से विच्छेदन द्वारा अग्ंयाशय का निष्कर्षणcre/ LSL-KrasG12D/+ विभिंन उंर में चूहों अग्ंयाशय में कैंसर के विकास की विस्तृत अनुदैर्ध्य ऊतकीय परीक्षा के लिए अनुमति देता है, को प्रगति के माध्यम से जल्द से प्नि्न चरणों से लेकर PDAC3,4 , 5. पांच से पंद्रह महीने से लेकर उंर में अग्ंयाशय कटाई भी ऊतक निष्कर्षों को तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अग्ंयाशय4 चयापचय में वैश्विक परिवर्तन विशेषता है कि स्वस्थ से रोगग्रस्त ऊतक संक्रमण के दौरान हो 6,7.
यह आलेख एक माउस अग्न्याशय निष्कर्षण करने के लिए आवश्यक चरणों का एक पूर्ण दृश्य मार्गदर्शिका प्रस्तुत करता है और आगे विश्लेषण के लिए एक अग्ंयाशय के संग्रहण के लिए दिशानिर्देश उपलब्ध कराता है । इस गाइड प्रकार मैं मधुमेह सहित अन्य अग्नाशय के रोगों पर अनुसंधान का आयोजन व्यक्तियों के लिए समान रूप से मूल्यवान हो जाएगा, और विशेष रूप से छात्रों और माउस का उपयोग कर अग्न्याशय की कटाई को शामिल अनुसंधान के लिए नए जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी होना चाहिए चयापचय की रूपरेखा या ऊतकीय विश्लेषण के लिए विच्छेदन ।
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Protocol
- शल्य प्रक्रिया के लिए दो अलग क्षेत्रों की स्थापना, ऑपरेटिंग मेज और बाद आपरेशन तालिका । सभी सामग्री और आवश्यक बर्तन के साथ दोनों क्षेत्रों चरण ।
- मंच ऑपरेटिंग तालिका के तहत एक वेंट हूड । तालिका की प्रक्रिया के निरंतर और बेरोक प्रदर्शन की अनुमति देता है एक तरीके से उपकरण के साथ व्यवस्थित करें ।
- एक ही कमरे में और ऑपरेशन के मुख्य तालिका के पास एक पश्चात की मेज स्थापित करें । प्रक्रिया भर में बाँझ वातावरण के रूप में दोनों तालिकाओं को बनाए रखें ।
- ऑपरेटिंग मेज पर निंनलिखित आपूर्ति प्लेस: ढक्कन के साथ एक ग्लास जार, १ १५ मिलीलीटर ट्यूब, सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी, ७०% इथेनॉल का एक निचोड़ बोतल, दो फोम बोर्डों, दो संदंश, दो 1 मिलीलीटर 21 गेज सीरिंज, २ ५० मिलीलीटर ट्यूबों, एक केंद्रापसारक ट्यूब , एक क्रायोजेनिक शीशी, चार सर्जिकल पैड, दस पिंस, पोंछे निष्फल की एक मशीन, और एक sharps कंटेनर ।
- स्थान पर निंनलिखित आपूर्ति के बाद आपरेशन तालिका: एक विश्लेषणात्मक शेष, एक 4 एल देवर तरल नाइट्रोजन, एक उथले चौड़ा मुंह देवर, एक अस्थाई microtube रैक, सर्जिकल कैंची, दो संदंश, चार क्रायोजेनिक शीशियों के एक जोड़ी, और की एक मशीन बाँझ पोंछे.
- formalin. के साथ ७५% मात्रा के लिए १ ५० मिलीलीटर और १ १५ मिलीलीटर ट्यूब भरें
- प्रत्येक कोने में एक पिन का उपयोग कर, एक लगभग 30 सेमी x 30 सेमी फोम बोर्ड को विच्छेदन बोर्ड के रूप में सेवा करने के लिए एक शल्य चिकित्सा पैड प्रत्यय । कार्रवाई के दौरान शेष चार पिन का उपयोग करें । एक शल्य पैड के साथ एक छोटे फोम बोर्ड तैयार करने के लिए अंगों को पोस्ट सेशन टेबल हस्तांतरण ।
चेतावनी: Isoflurane (९९.९%) एक विषाक्त रासायनिक है, और एक वेंट हूड में इस्तेमाल किया जाना चाहिए अपशिष्ट संवेदनाहारी गैस की सफाई से सुरक्षा के अधिकतम स्तर को सुनिश्चित करने के लिए < सुप वर्ग = "xref" > ८ . isoflurane का उपयोग कर खुले ड्रॉप विधि के उपयोग से जुड़े शोधकर्ताओं को जोखिम के बारे में अतिरिक्त जानकारी टेलर द्वारा एक लेख में पाया जा सकता है और Mook < सुप वर्ग = "xref" > ८ . - ग्लास जार में एक शल्य पैड जगह और isoflurane (९९.९%) की कुछ बूंदों के साथ लेना और शीर्ष पर एक कागज तौलिया जगह isoflurane के साथ माउस के सीधे संपर्क को रोकने के । इसी तरह, शेष ट्यूब लाइन और isoflurane की कुछ बूंदों के साथ सोख और माउस और isoflurane के बीच सीधे संपर्क को रोकने के लिए शीर्ष पर एक अतिरिक्त पैड जगह के लिए एक शल्य पैड का उपयोग करें ।
- अधिकतम भरण रेखा तक पहुंच जाता है जब तक कि उथले चौड़े मुंह देवर में तरल नाइट्रोजन डालो ।
- संज्ञाहरण कक्ष में विच्छेदन के लिए चयनित माउस जगह, यानी एक isoflurane की कुछ बूंदों के साथ लथपथ पैड के साथ ग्लास जार (९९.९%) ढक्कन के साथ कवर, ~ 1 min.
के लिए नोट: इस समय माउस से माउस को बदलता है । एक बार माउस बेहोश है, यह कक्ष से निकालें और यह ऑपरेटिंग बोर्ड पर जगह है । - ओरिएंट माउस इतना है कि यह झूठ बोल रही है ventral ओर ऊपर और इसके सिर के साथ वैज्ञानिक से दूर बताया । ट्यूब के अंदर सिर प्लेस एक शल्य isoflurane की कुछ बूंदों के साथ लथपथ पैड के साथ लाइन में खड़ा (९९.९%), और एक पैर चुटकी द्वारा एक उत्तेजना परीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि माउस उत्तेजनाओं के लिए अप्रतिसादी है ।
- यदि यह परीक्षण विफल रहता है और माउस पैर पिंच परीक्षण करने के लिए प्रतिसाद देता है, तो चरण १.८ दोहराएँ ।
- सर्जिकल फोम बोर्ड को माउस के अंगों पिन और ७०% इथेनॉल के साथ माउस के ventral पक्ष गीला ।
- चुटकी फर/त्वचा संदंश के साथ मूत्रमार्ग खोलने के पास और थोड़ा ऊपर की ओर खींच । मूत्रमार्ग खोलने, ऊपर midline और ठोड़ी पर समाप्त से शुरू उदर गुहा के माध्यम से शल्य कैंची के साथ एक चीरा बनाओ ।
प्रारंभिक चीरा के शुरुआती बिंदु के पास
- , संदंश के साथ फर/त्वचा के एक तरफ ले लो और नीचे कैंची के साथ एक और चीरा बनाने के लिए पीठ पंजा की ओर तिरछे ।
- विपरीत दिशा में एक ही तरीके से इस दोहराएं ।
नोट: फर/त्वचा एक व्यापक खोलने बनाने के लिए नीचे पिन किया जा सकता है, लेकिन आवश्यक नहीं है ।
- दिल का पता लगाने और पेरीकार्डियम, जो दिल के आसपास थैली है हटाने के लिए, सिरिंज सुई के कॉलेस्ट्रॉल से बचने के लिए ।
- ने पेरीकार्डियम को संदंश से पकड़ लिया और उसे कैंची से काट डाला । ध्यान से धड़कते दिल में सिरिंज सुई डालने के द्वारा दिल पंचर प्रदर्शन और धीरे सवार वापस लेने के लिए शुरू. इष्टतम रक्त संग्रह के लिए
- , सुई के सवार का उपयोग करने के लिए दिल की पंपिंग कार्रवाई की नकल और भी जल्दी से ड्राइंग से बचें ।
नोट: आमतौर पर रक्त के बारे में 1 मिलीलीटर एकत्र किया जा सकता है ।
रक्त संग्रह को पूरा करने के बाद - , और sharps कंटेनर में सिरिंज के निपटान के केंद्रापसारक ट्यूब में खून दूर ।
- के बाद दिल पंचर किया जाता है, दिल को जोड़ने संलग्नक निकालकर इच्छामृत्यु बाहर ले ।
नोट: हेपरिन, एक विरोधी कौयगुलांट, इस प्रक्रिया में सिरिंज से पहले दिल पंचर करने के लिए इस विशिष्ट अध्ययन में सीरम संग्रह के लिए coagulate करने के लिए रक्त की अनुमति देने के लिए नहीं जोड़ा गया था. हालांकि, शोधकर्ता रक्त जमावट प्लाज्मा इकट्ठा करने के लिए रोकने के लिए चाहते थे, हेपरिन दिल पंचर करने से पहले सिरिंज के लिए जोड़ा जा सकता है.
- यदि अध्ययन माउस के genotyping शामिल है, एक जीनोटाइप सत्यापन के लिए एक केंद्रापसारक ट्यूब में कैंची और जगह के साथ कान के एक हिस्से को गोली चलाना ।
- माउस के बाईं ओर पेट की स्थिति जानें । धीरे शुरू (ताकि फाड़ से बचने के लिए) दो संदंश.
का उपयोग करके पेट और ग्रहणी से अग्ंयाशय को अलग नोट: जब पेट और आंतों से अग्ंयाशय अलग, यह बहुत महत्वपूर्ण है कि संदंश धीरे अग्ंयाशय ऊतक के अंगों से दूर गाइड करने के लिए और कुचल या संदंश के साथ अग्ंयाशय आंसू नहीं किया जाता है ।- छोटी आंत jejunum और लघ्वान्त्र वर्गों से अग्ंयाशय अलग करने के लिए जारी है, और अंत में बड़ी आंत के caecum से ।
- caecum पर, संदंश का स्थान और मलाशय की ओर शेष बृहदांत्र साथ अग्ंयाशय की जुदाई जारी है ।
नोट: इस बिंदु पर, यह कटौती करने के लिए सुविधाजनक है और पेट के क्षेत्र के लिए तुरंत मलाशय से पूर्ववर्ती बृहदांत्र के हिस्से को हटा दें । - अग्ंयाशय और संलग्न तिल्ली का पता लगाने । माउस के दाईं ओर की ओर अग्ंयाशय स्लाइड । संदंश के साथ अग्ंयाशय और वक्ष गुहा के बीच बचे हुए कनेक्शन को पूरी तरह से अलग कर अग्न्याशय और adjoined तिल्ली को पृथक करें ।
- अग्ंयाशय निकालें और यह परीक्षा के लिए बाहर फैल गया । पहचान प्रयोजनों के लिए अग्ंयाशय से जुड़ी तिल्ली छोड़ दें ।
- अग्ंयाशय से सभी संयोजी ऊतक, वसा और mesenteric ऊतक निकालें ।
नोट: इस ऊतक रंग में कण है और इस तरह आसानी से अग्ंयाशय ऊतक कि रंग में pinker है से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर पूरे अग्ंयाशय को हटा दिया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, यदि अग्ंयाशय की जरूरत है तौला और शरीर के वजन की तुलना में या जानवरों के समूहों के बीच । में Ptf1a cre/+ ; LSL-Kras G12D/+ माउस मॉडल, विशेष रूप से पुराने महीनों में, हार्ड रेशेदार अग्नाशय के ऊतकों मौजूद हो सकता है । इस मामले में, अग्न्याशय के सावधान हटाने के रूप में आंतों ट्यूमर ऊतक में किया जा सकता है के रूप में आयोजित किया जाना चाहिए । उन्नत मामलों में, असामान्य तिल्ली और जिगर ऊतक भी मौजूद हो सकता है.
- अग्ंयाशय से सभी संयोजी ऊतक, वसा और mesenteric ऊतक निकालें ।
- यदि चाहें, तो इस बिंदु पर अंय अंगों को हटा दें ।
- अंगों के निष्कर्षण के बाद, नमूनों को संरक्षण के लिए पश्चात क्षेत्र में ले जाएं ।
- प्रत्येक अंग तौलना और उंहें अपने संबंधित क्रायोजेनिक शीशी में जगह है ।
नोट: साथ बुद्धिएच प्रत्येक नमूने के द्रव्यमान, किसी भी अनियमितताओं भविष्य के संदर्भ के लिए दर्ज किया जाना चाहिए । - एक बार जब अंगों तौला जाता है, उंहें स्नैप ठंड के लिए तरल नाइट्रोजन में जगह है । स्नैप जमने के बाद
- , अंगों को स्टोर करें-८० & #176; लंबी अवधि के भंडारण के लिए सी.
- जगह बेंच शीर्ष पर formalin संग्रहीत नमूने रातोंरात, और अगली सुबह ७०% इथेनॉल के लिए formalin से उनके समाधान बदल जाते हैं ।
नोट: इन नमूनों को लंबी अवधि के स्टोरेज के लिए 4 & #176; C पर संग्रहित करना चाहिए ।
लॉन्ग टर्म स्टोरेज के लिए - , फ्रीज में खून और कान का मुक्का-८० & #176; ग.. रक्त से सीरम संग्रह के लिए, रक्त 30 मिनट के लिए coagulate तो यह केंद्रापसारक अनुमति देते हैं । एक पिपेट का उपयोग कर सीरम भाग निकालें और फिर पर संग्रह करें-८० & #176; C.
- निष्फल पोंछे के साथ सभी विच्छेदन उपकरण प्रक्षालन । isoflurane लथपथ सर्जिकल पैड के साथ लाइन में खड़ा ट्यूब टोपी । एक ताजा शल्य पैड के साथ फोम बोर्ड पर सर्जिकल पैड बदलें । माउस के उन भागों को निपटाना जो सुविधा के प्रति एकत्र नहीं किए गए थे & #39; s पशु निपटान नीति.
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Representative Results
चित्र 1 ऑपरेटिंग वातावरण क्षेत्र का ओवरव्यू दिखाता है और चित्र 2 पोस्ट कार्रवाई क्षेत्र दिखाता है । हालांकि इस सेटिंग उपकरण और मचान की ंयूनतम राशि प्रदान करता है, व्यक्तियों के लिए सबसे अच्छा सूट व्यक्तिगत जरूरतों को इस परिवर्तन चुन सकते हैं । प्रोटोकॉल प्रयोग की विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए । इस प्रक्रिया को एक तरह से है कि एक चूहे के जीवन को समाप्त में आयोजित किया जाता है, उचित euthanization9की आवश्यकता होती है । जब शोधकर्ता तैयार है, माउस isoflurane लथपथ पैड (चित्रा 3) के साथ संज्ञाहरण चैंबर में रखा गया है ।
एक बार माउस बेहोश है, माउस को हटाने और यह बोर्ड पर पृष्ठीय पक्ष जगह है । एक पैर की अंगुली-चुटकी प्रक्रिया माउस दर्द (चित्रा 4) के लिए निष्क्रिय है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए । लागू ७०% इथेनॉल प्रारंभिक चीरा क्षेत्र निष्फल करने के लिए । टर्मिनल रक्त ड्रा पहले आयोजित किया जाना चाहिए, अग्न्याशय हटाने से पहले, पर्याप्त रक्त पुनर्प्राप्ति सुनिश्चित करने के लिए. खून निकालने से पहले, पेरीकार्डियम 21 जी सुई खोलने के कॉलेस्ट्रॉल को रोकने के लिए हटाया जाना चाहिए । टर्मिनल रक्त ड्रा पूरा करने के बाद, दिल इच्छामृत्यु की एक द्वितीयक विधि के रूप में अलग है और अग्ंयाशय तो हटा दिया है ।
पेट, जो अग्न्याशय हटाने (चित्रा 5) के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है पता लगाने के द्वारा शुरू. नोट: चरम देखभाल अग्न्याशय, जो एक नाजुक और नाजुक ऊतक है को हटाने के दौरान प्रयोग किया जाना चाहिए, और इसलिए सभी आपरेशनों कोमल बल के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए । संदंश का प्रयोग, धीरे पेट से अग्ंयाशय दूर खींचने के लिए शुरू करके विच्छेदन शुरू और जठरांत्र (सैनिक) पेट से ग्रहणी के लिए काम कर रहे पथ के बाहरी अस्तर से अग्नाशय के ऊतकों को अलग करने के लिए जारी है, jejunum और लघ्वान्त्र ( चित्रा 6) । एक बार caecum पहुंच गया है, अग्न्याशय की आसान हटाने संदंश की स्थिति इतनी है कि एक संदंश caecum पकड़ रहा है और अन्य संदंश बड़ी आंत से अग्ंयाशय अलग करने के लिए जारी रखने के लिए प्रयोग किया जाता है द्वारा हासिल की है (चित्रा 7) । बड़ी आंत से हटाने के बाद, अग्ंयाशय माउस के दाईं ओर पर रखा गया है और किसी भी शेष संलग्नक गंभीर है(चित्रा 8) ।
अग्ंयाशय निरीक्षण के लिए बाहर अनुषांगिक किया जाना चाहिए और किसी भी विषमता दर्ज की जानी चाहिए (चित्र 9) । Ptf1a मेंcre/ LSL-KrasG12D/+ माउस तनाव, अग्ंयाशय संभवतः एक कठोर ट्यूमर (चित्रा 10) शामिल हो सकता है । संभावित मेटास्टेसिस के लिए अन्य अंगों की भी जांच की जानी चाहिए । एक बार अग्न्याशय हटा दिया गया है, यह वजन और दर्ज किया जाना चाहिए । अग्ंयाशय का एक भाग भविष्य में चयापचय की रूपरेखा विश्लेषण या अंय परीक्षण और अग्ंयाशय के एक भाग के लिए तरल नाइट्रोजन में स्नैप-जमे हुए होना चाहिए भविष्य ऊतकीय विश्लेषण के लिए formalin में रखा जाना चाहिए । चित्रा 11 बाद के विश्लेषण में उपयोग के लिए विच्छेदन से एकत्र विभिन्न अंगों के प्रारंभिक भंडारण से पता चलता है. विच्छेदन द्वारा एकत्र अंगों और आगे के अध्ययन के लिए संग्रहीत व्यक्तिगत शोधकर्ता के लक्ष्यों पर निर्भर करेगा ।
ऊतक और रक्त के नमूनों ऊतकीय विश्लेषण के लिए और चयापचय की रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अग्ंयाशय के ऊतकों के ऊतकीय विश्लेषण का एक उदाहरण चित्र 12में दिखाया गया है । चयापचय profiling स्नैप-जमे हुए ऊतक के नमूने और रक्त के नमूने पर आयोजित किया जा सकता है । प्रतिनिधि नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) स्पेक्ट्रा अग्न्याशय ऊतक अर्क के हाइड्रोफिलिक और hydrophobic घटकों के क्रमशः चित्रा 13A और 13Bमें दिखाए जाते हैं । एक प्रतिनिधि एनएमआर स्पेक्ट्रम एक सीरम नमूना एक टर्मिनल रक्त ड्रा प्रक्रिया के समय एकत्र रक्त से तैयार पर एकत्र की चित्रा 14में दिखाया गया है ।
चित्र 1 : ऑपरेटिंग क्षेत्र के मचान. विच्छेदन के लिए सही उपकरण और ऑपरेटिंग शर्तों के सामांय लेआउट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : ऑपरेशन के बाद क्षेत्र के मचान । सामान्य लेआउट सही उपकरण और संचालन शर्तों पश्चात प्रक्रियाओं के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : संज्ञाहरण चैंबर । isoflurane के माध्यम से संज्ञाहरण के लिए उचित वातावरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : उत्तेजना परीक्षा । उत्तेजना किसी भी दर्द या असुविधा को सुनिश्चित करने के लिए प्रारंभिक चीरा करने से पहले माउस पर आयोजित परीक्षण सहा नहीं किया जा रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 5 : अग्न्याशय को हटाने की शुरुआत. अग्ंयाशय के प्रारंभिक निष्कर्षण का संकेत माउस के उंमुखीकरण, स्थान संदंश द्वारा संकेत दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 6 : आंतों के साथ अग्ंयाशय निष्कर्षण । जठरांत्र संबंधी मार्ग से अग्ंयाशय को अलग करने की प्रक्रिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 7 : Caecum पर अग्ंयाशय हटाने । संदंश एक बार caecum के स्थान पर पहुंच गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 8 : अग्ंयाशय हटाने । अग्ंयाशय को माउस के दाहिनी ओर रखें । किसी भी शेष संलग्नक पूरी तरह से अग्ंयाशय को हटाने के लिए काटा जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 9 : अग्ंयाशय परीक्षा । संलग्न तिल्ली माउस से हटाने के बाद जांच की जा रही के साथ अग्ंयाशय । तिल्ली अनुलंब तीर द्वारा इंगित किया गया है, और अग्ंयाशय क्षैतिज तीर द्वारा इंगित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 10 : अग्ंयाशय परीक्षा । एक अग्नाशय ट्यूमर को प्रदर्शित करने के लिए संलग्न तिल्ली के साथ अग्न्याशय माउस से हटाने के बाद जांच की जा रही. तिल्ली अनुलंब तीर द्वारा इंगित किया गया है, और अग्ंयाशय क्षैतिज तीर द्वारा इंगित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 11 : अंगों का भंडारण हटा दिया. अंगों और एकत्र नमूनों का उचित भंडारण, लंबी अवधि के भंडारण और भविष्य के विश्लेषण के लिए तैयार । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 12 : अग्ंयाशय ऊतक के ऊतकीय विश्लेषण । Hematoxylin और eosin अग्न्याशय ऊतक से सना हुआ चित्र । क) एक Ptf1a से सामांय अग्ंयाशय ऊतकcre/ LSL-KrasG12D/- नियंत्रण माउस । ख) एक Ptf1a के अग्ंयाशय से प्नि्न ऊतकcre/ LSL-KrasG12D/+ अध्ययन माउस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 13 : चयापचय की रूपरेखा विश्लेषण । एक आयामी प्रोटॉन नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) स्पेक्ट्रा of A) हाइड्रोफिलिक और ख) अग्ंयाशय ऊतक के hydrophobic चरण घटकों के बाद ऊतक homogenization निष्कर्षों और क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल निष्कर्षण के अधीन । एनएमआर स्पेक्ट्रा ८५० मेगाहर्ट्ज में अधिग्रहीत किया गया था और चयापचय रूपरेखा विश्लेषण में उपयोग के लिए उपयुक्त हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 14 : सीरम के प्रतिनिधि एनएमआर स्पेक्ट्रम । रक्त टर्मिनल रक्त ड्रा प्रक्रिया द्वारा एकत्र चयापचय की रूपरेखा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस स्पेक्ट्रम एक ठेठ एक आयामी प्रोटॉन ८५० मेगाहर्ट्ज एनएमआर एक टर्मिनल रक्त ड्रा नमूना से प्राप्त सीरम पर एकत्र स्पेक्ट्रम से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व
जबकि अंय माउस विच्छेदन के अनौपचारिक वीडियो मौजूद है, इस वीडियो लेख पहले पेशेवर गुणवत्ता प्रदान करता है, की समीक्षा की सहकर्मी, विस्तृत निष्कर्षण और माउस अग्ंयाशय की कटाई के लिए आवश्यक कदम के सभी के दृश्य प्रदर्शन 10 विच्छेदन द्वारा . अग्न्याशय चयापचय गतिविधि और इंसुलिन उत्पादन के लिए एक मुख्य अंग होने के साथ, विच्छेदन और अग्न्याशय की कटाई शारीरिक विशेषताओं के संरक्षण के लिए अनुमति देता है11. अग्न्याशय को अलग करके, भविष्य विश्लेषण नमूना पर आयोजित किया जा सकता है. इस प्रक्रिया की तुलना और एक ही समय सीमा के भीतर एक ही जीव के भीतर अंय ऊतकों से बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति देता है ।
तकनीक की सीमाएं
इस प्रक्रिया की सबसे बड़ी सीमा है माउस जीवन की समाप्ति है, जिससे अनुदैर्ध्य संग्रह और एक ही माउस से कई ऊतक के नमूनों के नमूने को रोकने । आदेश में उंर, लिंग, या अंय quantifiers से संबंधित प्रवृत्तियों का विश्लेषण करने के लिए, एक क्रॉस-अनुभागीय जनसंख्या लागू किया जाना चाहिए, जैसा कि हम अग्नाशय के कैंसर के चयापचय के अपने अध्ययन के लिए किया है । इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा प्रक्रिया को थामने के लिए अक्षमता है । एक बार euthanization शुरू की है, प्रक्रिया अपनी संपूर्णता में किया जाना चाहिए ।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण चरणों
माउस के हिंद पंजा चुटकी द्वारा उत्तेजना परीक्षण के निष्पादन के लिए सुनिश्चित करें कि माउस मानवीय उपचार प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि माउस इस उत्तेजना पर प्रतिक्रिया नहीं करता है, तो प्रक्रिया के रूप में किया जा सकता है की योजना बनाई है । हालांकि, माउस उत्तेजना परीक्षण का एक परिणाम के रूप में एक व्यथित प्रतिक्रिया प्रदर्शित करना चाहिए, माउस समय की एक अतिरिक्त अवधि के लिए संज्ञाहरण चैंबर को लौटा दिया जाना चाहिए और परीक्षण उत्तेजना परीक्षण के लिए एक प्रतिक्रिया जब तक दोहराया नहीं देखा है12।
इसी तरह, टर्मिनल दिल पंचर के तुरंत बाद टर्मिनल रक्त का नमूना एक द्वितीयक विधि के रूप में एकत्र किया जाता है दिल को कनेक्शन हटाने के बाद, इच्छामृत्यु का मानवीय बलिदान सुनिश्चित करता है माउस की । एक प्रभावी रक्त आकर्षित सुनिश्चित करने के लिए, वैज्ञानिक सिरिंज कि माउस की धड़कन के समान है के साथ एक पंप गति का उपयोग करना चाहिए, विश्लेषण के लिए रक्त की अधिकतम संग्रह के लिए अनुमति देता है.
संशोधन और समस्या निवारण
formalin से अंगों को ७०% इथेनॉल समाधान स्विचन ऊतकीय विश्लेषण के लिए आवश्यक embedding प्रक्रिया के लिए अंगों को तैयार करता है । विभिंन भंडारण समाधान की आवश्यकता हो सकती है वैज्ञानिक को अंगों के साथ अंय प्रयोगों का चयन करना चाहिए । विश्लेषण से पहले, अंग की अखंडता को बनाए रखने के लिए-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत अंगों की किसी भी संभावित गल सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
का उपयोग Ptf1acre/ LSL-KrasG12D/+ माउस मॉडल गैर अग्नाशय प्राथमिक ट्यूमर और रोगों13की घटना को कम करता है । इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि किसी भी अनियमितताओं के लिए स्पष्ट कर रहे हैं कि अग्न्याशय या अन्य अंगों के लिए विच्छेदन और विश्लेषण के लिए ऊतक नमूने के संग्रह.
भविष्य अनुप्रयोगों
विच्छेदन से माउस अग्ंयाशय की कटाई विश्लेषण के कई प्रकार के लिए एक ही नमूना पर आयोजित किया जा करने के लिए अनुमति देता है । इनमें से सबसे लोकप्रिय शामिल है, लेकिन करने के लिए सीमित नहीं हैं, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, hematoxylin और eosin प्रोटोकॉल, immunohistochemistry, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी6,7, 14 , 15. मधुमेह, अग्नाशयशोथ, और अग्नाशय के कैंसर जैसे रोगों16उपर्युक्त तकनीकों का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
पहुंच स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों/राष्ट्रीय कैंसर संस्थान अनुदान संख्या-1R15CA152985-01A1 से इस काम के लिए समर्थन स्वीकार करता है । इस परियोजना को भी मियामी विश्वविद्यालय के स्नातक अनुसंधान पुरस्कार कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया है, मियामी विश्वविद्यालय डॉक्टरेट-छात्रवृत्ति कार्यक्रम और मियामी विश्वविद्यालय ग्रीष्मकालीन विद्वानों कार्यक्रम के लिए स्नातक के अवसर ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Jar | Corning | 3140-150 | The glass jar used in the video has been discontinued. This is its replacement. |
| Lid of Glass Jar | Corning | 9985-150 | The glass jar lid used in the video has been discontinued. This is its replacement. |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 339650 | |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 9201 | |
| Squeeze bottle | Fisher Scientific | 03-409-10DD | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Foam Boards | Therapak | 562908 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 200205SHN | |
| 1 mL 21G Syringes | BD Biosciences | 309624 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 339652 | |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| Surgical Pads | Fisher Scientific | S67011 | |
| T-Pins Length: 2" | Advance Store Products | X32T-05 | |
| Sterilizing Wipes | Professional Disposables International Inc. | Q85084 | |
| Sharps Container | Fisher Scientific | 14-827-122 | |
| Analytical Balance | Marshall Scientific | ME-AE200 | |
| 4L Dewar | Taylor-Wharton | 4LD | |
| Shallow Wide Mouth Dewar | Fisher Scientific | F3087-V | |
| Floating Microtube Rack | VWR | 60986-100 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL, Sterile | Fisher Scientific | 10-500-25 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
| Liquid Nitrogen | Wright Brothers | NIT-60-XX | |
| Mouse Kras Strain | The Jackson Laboratory | OO8179 | |
| Mouse Cre Strain | MMRRC | OOO435-UNC |
References
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