Differenziare i condrociti da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo derivato dal sangue

Sommario

Presentiamo un protocollo per generare una linea condrogenica dal sangue periferico umano (PB) attraverso cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) utilizzando un metodo senza integrazione, che comprende la formazione del corpo embrionale (EB), l'espansione delle cellule fibroblasiche e l'induzione condrogenica.

Abstract

In questo studio abbiamo utilizzato le cellule del sangue periferico (PBCs) come cellule di sementi per produrre condrociti attraverso cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) in un metodo senza integrazione. A seguito della formazione del corpo embrionale (EB) e dell'espansione cellulare fibroblastica, iPSCs sono indotti per la differenziazione condrogenica per 21 giorni in condizioni prive di siero e privo di xeno. Dopo l'induzione di condrociti, i fenotipi delle cellule sono valutati mediante analisi morfologiche, immunohistochemiche e biochimiche, nonché con l'esame quantitativo in tempo reale PCR di marcatori di differenziazione condrogenica. I pellet condondensivi mostrano una colorazione blu positiva e blu toluidina. L'immunohistochemistry della colorazione dei collagene II e X è anche positivo. Il contenuto di glicosaminoglicano solfato (sGAG) ei marcatori di differenziazione condrogenici COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 e AGGRECAN sono notevolmente aumentati nella condizionePellicole rogeniche rispetto a hiPSC e cellule fibroblastiche. Questi risultati suggeriscono che i PBC possono essere utilizzati come cellule di sementi per generare iPSC per la riparazione della cartilagine, che è specifica del paziente e conveniente.

Introduzione

Il tessuto cartilagineo ha una capacità molto scarsa per l'auto-riparazione e la rigenerazione. Sono stati utilizzati diversi interventi chirurgici e trattamenti biologici per ripristinare la funzionalità della cartilagine e delle articolazioni, con risultati insoddisfacenti. Il recente sviluppo della tecnologia delle cellule staminali può cambiare l'intero campo di riparazione della cartilagine ¹ . Diverse cellule staminali sono state studiate come cellule di sementi, ma le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs) sembrano essere la scelta più promettente in quanto possono fornire molti tipi di cellule specifiche del paziente senza causare reazioni di reiezione ² . Inoltre, possono superare la limitata natura proliferativa delle cellule adulte e mantenere le proprie capacità di auto-rinnovamento e pluripotenti. Inoltre, il targeting genico può essere utilizzato per cambiare il genotipo per ottenere tipi specifici di condrociti.

I fibroblasti sono stati ampiamente usati per generare iPSC perché i loro potenziamenti di riprogrammazione sono stati anche studiati bene.Tuttavia, ci sono ancora alcune limitazioni che devono essere superate, come la dolorosa biopsia dei pazienti e la necessità di espansione in vitro dei fibroblasti, che possono portare a mutazioni genetiche ³ . Recentemente, i PBC sono stati trovati vantaggiosi per la riprogrammazione ⁴ ; Inoltre, sono stati comunemente utilizzati e abbondantemente memorizzati. È possibile che possano reindirizzare la messa a fuoco dello studio dalla pelle. Tuttavia, al meglio delle nostre conoscenze, ci sono poche relazioni sulla riprogrammazione del PBC seguito dalla differenziazione nei condrociti.

Nello studio in corso, utilizziamo PBC come fonte alternativa riprogrammandoli in iPSC e poi differenziando iPSC nel linfondaggio genetico attraverso un sistema di coltura di pellet per imitare la formazione di condrociti.

Protocollo

Il protocollo per la generazione di hiPSC da PBC può essere trovato nel nostro precedente studio ⁵ . Lo studio è stato approvato dal consiglio di revisione istituzionale della nostra istituzione.

1. Formazione del corpo embrionale (EB)

1. Realizzare 50 ml di mezzo hiPSC: Knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) completato con una sostituzione del siero del 15% (KSR), 5% siero fetale bovino (FBS), 1 x amminoacidi non essenziali, 55 μM 2-mercaptoetanolo, 2 mM L -glutamina e 8 ng / mL di fattore di crescita di fibroblasti di base (bFGF).
2. Realizzare 50 mLof EB media di formazione: DMEM integrato con 15% KSR, 5% FBS, 1x aminoacidi non essenziali, 55 μM 2-mercaptoetanolo e 2 mM L-glutammina.
3. Preparare 50 ml di substrato di coltura basale: DMEM integrato con 20% FBS, 1 amminoacido non essenziale, 55 μM 2-mercaptoetanolo e 2 mM L-glutammina.
4. Preparare 10 mL di soluzione di dispersione, 1 mg / mL nel DMEM eliminato.
5. cultuRe hiPSCs su piatti di coltura tissutale da 60 mm con cellule alimentatrici ( cioè un monostrato di cellule fibroblastiche embriotiche irradiate del mouse). Quando le cellule sono confluenti del 80-90%, dissociate le cellule con dispersione e passaggio i hiPSCs 1: 3 ogni 4-5 giorni. Inserire le cellule in un incubatore di CO _{2 di} 37 ° C e 5%.
6. Disseccare le colonie hiPSC indifferenziate in piccoli pezzi (circa 50-100 μm di diametro) utilizzando un ago di vetro disegnato a fuoco quando iPSCs sono confluenti 80-90%. Generalmente, utilizzare le colonie hiPSC in un piatto da 60 mm per generare EB in un piatto di Petri da 100 mm.
   1. Coltivare meno di 100 piccoli pezzi di colonie in un piatto di Petri non aderente da 100 mm contenente 10 ml di mezzo di formazione EB. Mettere i piatti in un incubatore di CO _{2 di} 37 ° C e 5%.
7. Sostituire circa il 25% del mezzo iniziale con una medesima quantità di mezzo di coltura basale ogni 2 giorni. Inclinare il piatto per lasciare che i EB si stabiliscano. Rimuovere con cautela 3 mlDi media superiore e aggiungere 4 ml di terreno colturale fresco di base. Non disturbare le EB.
   NOTA: I EB sono caratterizzati morfologicamente dai pezzi di colonie, assumendo un aspetto rotondo con bordi lisci sotto il microscopio.
8. Dopo 10 giorni di coltura nel piatto Petri non aderente, ricoprire un nuovo piatto da 100 mm di coltura tissutale con 4 ml di gelatina 0,1% per 30 minuti a 37 ° C prima dell'uso.
9. Trasferire il mezzo e gli EB da un piatto di Petri non aderente da 100 mm a un tubo conico da 15 ml. Lasciate il sedimento EB per 4-5 min. Aspirare con attenzione il surnatante e lasciare meno di 0,5 ml di mezzo e EB
10. Seme meno di 100 EB su un piatto di coltura tissutale rivestito con gelatina da 100 mm con 10 ml di terreno di coltura basale. Mettere i piatti in un incubatore di CO _{2 di} 37 ° C e 5%.

2. Formazione delle cellule di pellicola e differenziazione dei condrociti

1. Preparare 10 mL di 0,25% di acido triposina / etilendiammina-tetraacetico (EDTA). Crea 80 ml di bassorilievoAl medium di coltura: DMEM integrato con 20% FBS, 1x amminoacidi non essenziali, 55 μM 2-mercaptoetanolo e 2 mM L-glutamina.
2. Crea 10 ml di mediazione differenziata: DMEM (elevato glucosio) integrato con 10% di insulina transferrina-selenio (ITS), 0,1 μM dexametasone, 1 mM acido ascorbico, 1% piruvato di sodio e 10 ng / Beta 1 (TGF-β1).
3. Aggiornare il mezzo con 10 ml di terreno di coltura basale dopo 48 h. Quindi, aggiornare il mezzo ogni tre giorni con 10 ml di substrato di coltura basale.
   NOTA: Dopo 10 giorni di coltura, le colture fibroblastiche dovrebbero essere estese dalle EB.
   1. Cappare i piatti da 100 mm con 4 ml di gelatina 0,1% per 30 minuti a 37 ° C prima dell'uso. Scartare il surnatante di cellule e lavare le cellule con una volta con Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS).
   2. Digestare le cellule con 3 mL di 0.25% di trysina / EDTA a 37 ° C per 5 min e neutralizzare con 4 mL del mezzo di coltura basale.
4. Dissociare le cellule in singole cellule pipettando su e giù per 5-10 volte e passandole attraverso una maglia nylon da 70 μm. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 xg per 5 min. Rieseguire le cellule su un nuovo piatto di coltura tissutale 100 mm con rivestimento di gelatina con 10 ml di substrato di coltura basale.
5. Aggiornare il mezzo con 10 ml di terreno di coltura basale dopo 48 h. Quindi, aggiornare il mezzo ogni tre giorni con 10 ml di substrato di coltura basale.
   NOTA: Le cellule acquisiscono una omogenea morfologia tipo fibroblastica.
6. Quando si raggiunge la confluenza di ~ 90-100% ( cioè circa 5-7 giorni), raccogliere le cellule con 3 mL di 0.25% di trysina / EDTA a 37 ° C per 5 min. Neutralizzare con 4 ml di terreno di coltura basale. Dissociare le cellule in singole cellule pipettando su e giù per 5 volte. Utilizzare un emocitometro per contare il numero della cellula.
   1. Posizionare 3 x 10 ⁵ cellule in un tubo di polipropilene da 15 ml. Centrifugare a 200 xgPer 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Riposizionare le cellule in 1 ml di mezzo di differenziazione condrogenica.
7. Riacentrifugare le cellule a 300 xg per 3 min e mantenere le cellule in forma di pellet. Mettere il tubo nel 37 ° C e 5% CO ₂ incubatore per 21 giorni. Non avvitare bene il coperchio e lasciare scambiare il gas.
8. Sostituire 3/4 del terreno di coltura ogni tre giorni con un nuovo mezzo di differenziazione condrogenica.
   NOTA: dopo 21 giorni di coltura, i pellets hiPSC-condrogenici (hiPSC-Chon) dovrebbero essere formati. Le cellule staminali mesenchimali umane (MSC), come un controllo positivo, sono raccolte e coltivate anche nel terreno di differenziazione condrogenica per 21 giorni per formare pellet condensatori (hMSC-Chon).

3. Analisi della differenziazione condrogenica

1. Preparare 10 mL di formalina a tampone neutro al 10%.
2. Preparare 50 ml di reagente blu alciente 0,1% e 50 ml di reagente blu toluidina 1%.
3. Pr1 ml degli anticorpi primari: anticorpi policlonali coniglio contro collagene II (1:50) o anticorpi monoclonali del topo contro il collagene X (1:50). Inoltre, preparare anticorpi secondari anti-coniglio o mouse.
4. Preparare 1 mL di soluzione papaina: 10 U / mL in PBS con 0,1 M acetato di sodio, 2,4 mM EDTA e 5 mM L-cisteina.
5. Preparare 100 ml di soluzione di tinture blu dimetilmetilene (DMMB): 100 μl di 16 mg / l di 1,9 dimetilmetilene blu, 40 mM di glicina, 40 mM di NaCl e 9,5 mM di HCl; PH 3,0.
6. Valutare la differenziazione condrogenica dalle macchie azzurre blu e toluidina blu delle sezioni di pellet.
   1. Fissare un pellet hiPSC-Chon o pellet hMSC-Chon in 1 mL di formalina tampone neutralizzato al 10% per 24 h.
   2. Trasferire il pellet in 1 ml di etanolo al 70% in H ₂ O. Disidratare il pellet con 1 ml di etanolo graduato ( cioè 25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 min ciascuno).
   3. Chiarire il pellet in 1 ml di xilene al 100% tre volte. infiltratIl pellet con paraffina per 1 h in un forno a 65 ° C. Incorporare il pellet in blocchi di paraffina con uno stampo di 7 x 7 x 5 mm ³ , seguendo le procedure istologiche di routine ⁶ .
   4. Realizzare sezioni adiacenti per microtoma con uno spessore di circa 4 μm ⁷ . Aderire le sezioni sulle vetrate.
   5. Asciugare le diapositive per 2 ore a 60 ° C in un forno. Deparaffinare le sezioni in tre cicli (3 min ciascuno) usando il xilene al 100%.
   6. Utilizzare una serie di alcol in diminuzione per la reidratazione ( cioè 100, 100, 95, 95, 70, 50 e 25% in H ₂ O, 3 minuti ciascuno) e quindi eseguire un risciacquo finale con acqua deionizzata per 5 minuti.
   7. Macchiare le sezioni con 0,1% reagente blu alcian o 1% toluidine blu colorazione per 4-5 ore e poi risciacquare con acqua distillata.
   8. Dehidrato con una serie di etanolo gradato ( cioè 25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 min ciascuno) seguiti da tre st consecutiveEps di chiarificazione in 100% di xilene. Montare le diapositive e visualizzarle sotto un microscopio.
7. Eseguire immunohistochemistry.
   NOTA: Ulteriori sezioni di pellet vengono ulteriormente valutate mediante immunohistochemistry.
   1. Dopo la deparaffinazione e la reidratazione, portare le scivolature ad ebollizione in 1 mM EDTA, pH 8,0 (impermeabile in acqua bollita da autoclave). Lasciarli sedere per 8 minuti ad una temperatura sottobollente e lasciare che le diapositive si raffreddino a RT.
   2. Sciacquare le diapositive con acqua deionizzata 3 volte. Incubare le sezioni in soluzione al 3% di H ₂ O ₂ in metanolo a RT per 15 minuti per bloccare l'attività endogena perossidasi.
   3. Sciacquare le diapositive con acqua deionizzata e immergetele in DPBS per 5 min. Applicare 50-100 μL di anticorpo primario opportunamente diluito (1:50) alle sezioni sulle diapositive e poi incubarle in una camera umidificata a RT per 1 ora.
   4. Lavare le diapositive 3 volte (5 min ciascuna) con DPBS. Incubare la saCon i rispettivi anticorpi secondari corrispondenti (ad esempio, anti-coniglio o topo) per 15 minuti a RT.
   5. Lavare le diapositive 3 volte (per 5 min ciascuna) con DPBS. Eseguire la rilevazione DAB sotto un microscopio.
   6. Lavare le diapositive con DPBS 3 volte (2 minuti ciascuno). Contrasta i nuclei delle cellule immergendo le diapositive in ematossilina per 1-2 minuti. Dehidrato con una serie di etanolo classificato (25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 min ciascuno) seguito da tre fasi consecutive di chiarificazione con xilene. Infine, montare le diapositive e visualizzarle sotto il microscopio.
8. Rileva il contenuto di sGAG.
   1. Digete i pellet condensatori in soluzione papaina a 60 ° C per 2 ore.
   2. Determinare il contenuto del DNA utilizzando il kit di analisi dsDNA e il sistema di fluorometri. Misurare il contenuto di sGAG mescolandolo con la soluzione di tintura DMMB sotto misura di assorbanza a 525 nm ⁸ .
   3. Calcolare la concentrazione di sGAG contro una curva standard diLo squalo condroitina solfato.
9. Eseguire l'analisi PCR in tempo reale dei marcatori di differenziazione condrogenica nei pellet hiPSC-Chon.
   1. Raccolta 3-4 di medesime pellet condensanti aggiungendo 500 μl di reagente di estrazione ghiacciata ad un tubo. Vortice bene. Incubare il campione per 5 minuti a RT.
   2. Aggiungere 0,1 ml di cloroformio. Vortex il campione per 15 s e incubare a RT per 3 min. Centrifugare il campione per 15 minuti a 12.000 xg e 4 ° C. Trasferire la fase acquosa superiore (circa 250 μL) in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
   3. Aggiungere 25 μL di acetato di sodio e 1 μl di glicogeno al campione. Precipitare l'RNA mescolandolo con 250 μL di alcool isopropilico. Mescolare accuratamente. Incubare il campione in RT per 10 min.
   4. Centrifugare per 10 min a 12.000 xg e 4 ° C. Rimuovere completamente il surnatante. Lavare il pellet RNA due volte con 500 μl di etanolo al 75%.
   5. Centrifugare per 5 minA 7.500 xg e 4 ° C. Rimuovere l'etanolo residuo e asciugare in aria l'impianto di RNA per 5-10 min. Sciogliere l'RNA in 10 μL di acqua priva di nucleasi.
   6. Convertire l'RNA in cDNA usando un sistema di trascrizione trasversale. Soggetti i campioni di cDNA a PCR in tempo reale utilizzando il mix master del kit qPCR (2x) e un sistema PCR in tempo reale ⁹ .
      NOTA: Le sequenze primer sono:
      H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
      H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      H β-ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      H β-ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
      H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      H SOX9 -F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
      H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.

Risultati

Differenziazione condrogenica di hiPSCs:

Il medium di formazione EB e il mezzo di coltura basale sono stati utilizzati per differenziare i hiPSC nel linfatico mesenchimale. È stato utilizzato un metodo di coltura a più fasi ( Figura 1 ). In primo luogo, i hiPSCs sono stati spontaneamente differenziati tramite la formazione di EB per 10 giorni (D10; Figura 2A ). In second...

Discussione

Qui forniamo un protocollo per generare condrociti da PBC tramite iPSC. Poiché i PBC sono più comuni e ampiamente utilizzati nel campo clinico, essi vengono presentati come una potenziale alternativa per la riprogrammazione. In questo studio, visi episomici (EV) sono stati utilizzati per riprogrammare PBC in iPSC, seguendo il metodo stabilito da Zhang et al. ¹¹ . Questo approccio senza integrazione non prevede l'integrazione di genotossicità associata a virus, che si ritiene avere un...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Knockout DMEM	Invitrogen	10829018	Terreno basale utilizzato per la coltura di hiPSC e il terreno di formazione di EB
Sostituzione del siero knockout (KSR)	Invitrogen	10828028	Un integratore di terreno più definito, privo di FBS, utilizzato per la coltura di hiPSC e il terreno di formazione di EB
Siero fetale bovino (FBS)	Hyclone	sh30070.03	Utilizzato per la coltura di hiPSC e il terreno di formazione di EB, offre un eccellente valore per le cellule coltura
Aminoacidi non essenziali	Chemicon	TMS-001-C	Utilizzato come integratore per la crescita in tutto il terreno di coltura cellulare, per aumentare la crescita e la vitalità cellulare
L-glutammina	Invitrogen	TMS-002-C	Un amminoacido necessario per la coltura cellulare
Fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF)	Peprotech	100-18B	Una citochina utilizzata per sostenere la pluripotenza e l'autorinnovamento delle hiPSC
Dispase	Invitrogen	17105041	Utilizzato per la dissociazione hiPSC per la subcoltura
DMEM	Gibco	C11960	Terreno basale utilizzato per il terreno di coltura MSC
0,1% di gelatina	Millipore	ES-006-B	Utilizzato per l'attacco cellulare sulle piastre
0,25% tripsina/EDTA	Gibco 25200072		Utilizzato per la dissociazione cellulare
DPBS	Gibco	14190250	Una soluzione salina bilanciata utilizzata per il lavaggio cellulare o per la preparazione di reagenti
2-mercaptoetanolo	invitrogeno	21985023	Utilizzato come integratore per la crescita in tutti i terreni di coltura cellulare.
ITS	invitrogen	41400045	insulina, transferrina, soluzione di selenio. Utilizzato per la differenziazione condrogenica.
Acido ascorbico	Sigma	4403	Conosciuto come vitamina C. Aiuta nella crescita attiva e ha proprietà antiossidanti.
Piruvato di sodio	Gibco	11360070	Aggiunto al terreno di coltura cellulare come fonte di energia in aggiunta al glucosio.
Fattore di crescita trasformante-beta 1	Peprotech	AF-100-21C	Una citochina che regola la proliferazione cellulare, la crescita e la differenziazione condrogenica.
Anticorpi policlonali di coniglio contro il collagene II	Abcam	ab34712	Questo anticorpo reagisce con i collageni di tipo II, che è specifico per i tessuti cartilaginei
Anticorpi monoclonali di topo contro il collagene X	Abcam	ab49945	Questo anticorpo reagisce con il collagene di tipo X, che è un prodotto di condrotociti ipertrofici.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Per il montaggio e la conservazione a lungo termine di vetrini
Blu di toluidina	Sigma	89640	Utilizzato per il rilevamento di proteoglicani.
Blu di Alcian	Amresco	#0298	Utilizzato per il rilevamento di glucosamminoglicani.
Papaina	Sigma	P4762-25MG	Utilizzato per digerire pellet condrogenici.
Blu di dimetilmetilene	Sigma	341088-1G	Utilizzato per quantificare i glicosaminogliani
Condroitina solfato sale sodico dalla cartilagine di squalo	Sigma	C4384-250MG	Utilizzato per disegnare la curva standard per la misurazione del contenuto di sGAG.
Kit di analisi Qubit dsDNA HS	Invitrogen	Q32851 (100)	Utilizzato per determinare il contenuto di DNA
TRIzol	Invitrogen	15596018	Utilizzato per l'isolamento dell'RNA dalle cellule
Sistema di trascrittasi inversa	Promega	A3500	Utilizzato per convertire l'RNA in cDNA
SYBR FAST kit qPCR Master Mix	Kapa	KK4601	Utilizzato per la PCR in tempo reale