Name: Differenziare i condrociti da cellule staminali pluripotenti indotte dalluomo derivato dal sangue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Scopri un protocollo riproducibile per differenziare iPSC da cellule del sangue periferico in condrociti. Questo metodo senza siero e xeno-free offre un approccio personalizzato per la rigenerazione della cartilagine.

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Gli autori vogliono ringraziare Xiaobin Zhang per il suo plasmide. Ringraziamo anche Shaorong Gao e Qianfei Wang per il loro aiuto gentile durante l&#39;esperimento. Questo studio è sostenuto dalla Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (No.81101346, 81271963, 81100331), dal progetto di talento di Pechino 215 ad alto livello (No.2014-3-025) e dal Fondo Chao-Yang Hospital di Pechino (No CYXX-2017-01) e l&#39;Associazione per la promozione dell&#39;innovazione giovanile dell&#39;Accademia delle Scienze Cinesi (YL).

Il protocollo per la generazione di hiPSC da PBC può essere trovato nel nostro precedente studio 5 . Lo studio è stato approvato dal consiglio di revisione istituzionale della nostra istituzione. 1. Formazione del corpo embrionale (EB) <ol><li> Realizzare 50 ml di mezzo hiPSC: Knockout Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) completato con una sostituzione del siero del 15% (KSR), 5% siero fetale bovino (FBS), 1 x amminoacidi non essenziali, 55 μM 2-mercaptoetanolo, 2 mM L -glutamina e 8 ng / mL di fattore di crescita di fibroblasti di base (bFGF). </li><li> Realizzare 50 mLof EB media di formazione: DMEM integrato con 15% KSR, 5% FBS, 1x aminoacidi non essenziali, 55 μM 2-mercaptoetanolo e 2 mM L-glutammina. </li><li> Preparare 50 ml di substrato di coltura basale: DMEM integrato con 20% FBS, 1 amminoacido non essenziale, 55 μM 2-mercaptoetanolo e 2 mM L-glutammina. </li><li> Preparare 10 mL di soluzione di dispersione, 1 mg / mL nel DMEM eliminato. </li><li> cultuRe hiPSCs su piatti di coltura tissutale da 60 mm con cellule alimentatrici ( cioè un monostrato di cellule fibroblastiche embriotiche irradiate del mouse). Quando le cellule sono confluenti del 80-90%, dissociate le cellule con dispersione e passaggio i hiPSCs 1: 3 ogni 4-5 giorni. Inserire le cellule in un incubatore di CO 2 di 37 ° C e 5%. </li><li> Disseccare le colonie hiPSC indifferenziate in piccoli pezzi (circa 50-100 μm di diametro) utilizzando un ago di vetro disegnato a fuoco quando iPSCs sono confluenti 80-90%. Generalmente, utilizzare le colonie hiPSC in un piatto da 60 mm per generare EB in un piatto di Petri da 100 mm. <ol><li> Coltivare meno di 100 piccoli pezzi di colonie in un piatto di Petri non aderente da 100 mm contenente 10 ml di mezzo di formazione EB. Mettere i piatti in un incubatore di CO 2 di 37 ° C e 5%. </li></ol></li><li> Sostituire circa il 25% del mezzo iniziale con una medesima quantità di mezzo di coltura basale ogni 2 giorni. Inclinare il piatto per lasciare che i EB si stabiliscano. Rimuovere con cautela 3 mlDi media superiore e aggiungere 4 ml di terreno colturale fresco di base. Non disturbare le EB. NOTA: I EB sono caratterizzati morfologicamente dai pezzi di colonie, assumendo un aspetto rotondo con bordi lisci sotto il microscopio. </li><li> Dopo 10 giorni di coltura nel piatto Petri non aderente, ricoprire un nuovo piatto da 100 mm di coltura tissutale con 4 ml di gelatina 0,1% per 30 minuti a 37 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Trasferire il mezzo e gli EB da un piatto di Petri non aderente da 100 mm a un tubo conico da 15 ml. Lasciate il sedimento EB per 4-5 min. Aspirare con attenzione il surnatante e lasciare meno di 0,5 ml di mezzo e EB </li><li> Seme meno di 100 EB su un piatto di coltura tissutale rivestito con gelatina da 100 mm con 10 ml di terreno di coltura basale. Mettere i piatti in un incubatore di CO 2 di 37 ° C e 5%. </li></ol> 2. Formazione delle cellule di pellicola e differenziazione dei condrociti <ol><li> Preparare 10 mL di 0,25% di acido triposina / etilendiammina-tetraacetico (EDTA). Crea 80 ml di bassorilievoAl medium di coltura: DMEM integrato con 20% FBS, 1x amminoacidi non essenziali, 55 μM 2-mercaptoetanolo e 2 mM L-glutamina. </li><li> Crea 10 ml di mediazione differenziata: DMEM (elevato glucosio) integrato con 10% di insulina transferrina-selenio (ITS), 0,1 μM dexametasone, 1 mM acido ascorbico, 1% piruvato di sodio e 10 ng / Beta 1 (TGF-β1). </li><li> Aggiornare il mezzo con 10 ml di terreno di coltura basale dopo 48 h. Quindi, aggiornare il mezzo ogni tre giorni con 10 ml di substrato di coltura basale. NOTA: Dopo 10 giorni di coltura, le colture fibroblastiche dovrebbero essere estese dalle EB. <ol><li> Cappare i piatti da 100 mm con 4 ml di gelatina 0,1% per 30 minuti a 37 ° C prima dell&#39;uso. Scartare il surnatante di cellule e lavare le cellule con una volta con Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS). </li><li> Digestare le cellule con 3 mL di 0.25% di trysina / EDTA a 37 ° C per 5 min e neutralizzare con 4 mL del mezzo di coltura basale. </li></ol></li><li> Dissociare le cellule in singole cellule pipettando su e giù per 5-10 volte e passandole attraverso una maglia nylon da 70 μm. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 xg per 5 min. Rieseguire le cellule su un nuovo piatto di coltura tissutale 100 mm con rivestimento di gelatina con 10 ml di substrato di coltura basale. </li><li> Aggiornare il mezzo con 10 ml di terreno di coltura basale dopo 48 h. Quindi, aggiornare il mezzo ogni tre giorni con 10 ml di substrato di coltura basale. NOTA: Le cellule acquisiscono una omogenea morfologia tipo fibroblastica. </li><li> Quando si raggiunge la confluenza di ~ 90-100% ( cioè circa 5-7 giorni), raccogliere le cellule con 3 mL di 0.25% di trysina / EDTA a 37 ° C per 5 min. Neutralizzare con 4 ml di terreno di coltura basale. Dissociare le cellule in singole cellule pipettando su e giù per 5 volte. Utilizzare un emocitometro per contare il numero della cellula. <ol><li> Posizionare 3 x 10 5 cellule in un tubo di polipropilene da 15 ml. Centrifugare a 200 xgPer 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Riposizionare le cellule in 1 ml di mezzo di differenziazione condrogenica. </li></ol></li><li> Riacentrifugare le cellule a 300 xg per 3 min e mantenere le cellule in forma di pellet. Mettere il tubo nel 37 ° C e 5% CO 2 incubatore per 21 giorni. Non avvitare bene il coperchio e lasciare scambiare il gas. </li><li> Sostituire 3/4 del terreno di coltura ogni tre giorni con un nuovo mezzo di differenziazione condrogenica. NOTA: dopo 21 giorni di coltura, i pellets hiPSC-condrogenici (hiPSC-Chon) dovrebbero essere formati. Le cellule staminali mesenchimali umane (MSC), come un controllo positivo, sono raccolte e coltivate anche nel terreno di differenziazione condrogenica per 21 giorni per formare pellet condensatori (hMSC-Chon). </li></ol> 3. Analisi della differenziazione condrogenica <ol><li> Preparare 10 mL di formalina a tampone neutro al 10%. </li><li> Preparare 50 ml di reagente blu alciente 0,1% e 50 ml di reagente blu toluidina 1%. </li><li> Pr1 ml degli anticorpi primari: anticorpi policlonali coniglio contro collagene II (1:50) o anticorpi monoclonali del topo contro il collagene X (1:50). Inoltre, preparare anticorpi secondari anti-coniglio o mouse. </li><li> Preparare 1 mL di soluzione papaina: 10 U / mL in PBS con 0,1 M acetato di sodio, 2,4 mM EDTA e 5 mM L-cisteina. </li><li> Preparare 100 ml di soluzione di tinture blu dimetilmetilene (DMMB): 100 μl di 16 mg / l di 1,9 dimetilmetilene blu, 40 mM di glicina, 40 mM di NaCl e 9,5 mM di HCl; PH 3,0. </li><li> Valutare la differenziazione condrogenica dalle macchie azzurre blu e toluidina blu delle sezioni di pellet. <ol><li> Fissare un pellet hiPSC-Chon o pellet hMSC-Chon in 1 mL di formalina tampone neutralizzato al 10% per 24 h. </li><li> Trasferire il pellet in 1 ml di etanolo al 70% in H 2 O. Disidratare il pellet con 1 ml di etanolo graduato ( cioè 25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 min ciascuno). </li><li> Chiarire il pellet in 1 ml di xilene al 100% tre volte. infiltratIl pellet con paraffina per 1 h in un forno a 65 ° C. Incorporare il pellet in blocchi di paraffina con uno stampo di 7 x 7 x 5 mm 3 , seguendo le procedure istologiche di routine 6 . </li><li> Realizzare sezioni adiacenti per microtoma con uno spessore di circa 4 μm 7 . Aderire le sezioni sulle vetrate. </li><li> Asciugare le diapositive per 2 ore a 60 ° C in un forno. Deparaffinare le sezioni in tre cicli (3 min ciascuno) usando il xilene al 100%. </li><li> Utilizzare una serie di alcol in diminuzione per la reidratazione ( cioè 100, 100, 95, 95, 70, 50 e 25% in H 2 O, 3 minuti ciascuno) e quindi eseguire un risciacquo finale con acqua deionizzata per 5 minuti. </li><li> Macchiare le sezioni con 0,1% reagente blu alcian o 1% toluidine blu colorazione per 4-5 ore e poi risciacquare con acqua distillata. </li><li> Dehidrato con una serie di etanolo gradato ( cioè 25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 min ciascuno) seguiti da tre st consecutiveEps di chiarificazione in 100% di xilene. Montare le diapositive e visualizzarle sotto un microscopio. </li></ol></li><li> Eseguire immunohistochemistry. NOTA: Ulteriori sezioni di pellet vengono ulteriormente valutate mediante immunohistochemistry. <ol><li> Dopo la deparaffinazione e la reidratazione, portare le scivolature ad ebollizione in 1 mM EDTA, pH 8,0 (impermeabile in acqua bollita da autoclave). Lasciarli sedere per 8 minuti ad una temperatura sottobollente e lasciare che le diapositive si raffreddino a RT. </li><li> Sciacquare le diapositive con acqua deionizzata 3 volte. Incubare le sezioni in soluzione al 3% di H 2 O 2 in metanolo a RT per 15 minuti per bloccare l&#39;attività endogena perossidasi. </li><li> Sciacquare le diapositive con acqua deionizzata e immergetele in DPBS per 5 min. Applicare 50-100 μL di anticorpo primario opportunamente diluito (1:50) alle sezioni sulle diapositive e poi incubarle in una camera umidificata a RT per 1 ora. </li><li> Lavare le diapositive 3 volte (5 min ciascuna) con DPBS. Incubare la saCon i rispettivi anticorpi secondari corrispondenti (ad esempio, anti-coniglio o topo) per 15 minuti a RT. </li><li> Lavare le diapositive 3 volte (per 5 min ciascuna) con DPBS. Eseguire la rilevazione DAB sotto un microscopio. </li><li> Lavare le diapositive con DPBS 3 volte (2 minuti ciascuno). Contrasta i nuclei delle cellule immergendo le diapositive in ematossilina per 1-2 minuti. Dehidrato con una serie di etanolo classificato (25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 min ciascuno) seguito da tre fasi consecutive di chiarificazione con xilene. Infine, montare le diapositive e visualizzarle sotto il microscopio. </li></ol></li><li> Rileva il contenuto di sGAG. <ol><li> Digete i pellet condensatori in soluzione papaina a 60 ° C per 2 ore. </li><li> Determinare il contenuto del DNA utilizzando il kit di analisi dsDNA e il sistema di fluorometri. Misurare il contenuto di sGAG mescolandolo con la soluzione di tintura DMMB sotto misura di assorbanza a 525 nm 8 . </li><li> Calcolare la concentrazione di sGAG contro una curva standard diLo squalo condroitina solfato. </li></ol></li><li> Eseguire l&#39;analisi PCR in tempo reale dei marcatori di differenziazione condrogenica nei pellet hiPSC-Chon. <ol><li> Raccolta 3-4 di medesime pellet condensanti aggiungendo 500 μl di reagente di estrazione ghiacciata ad un tubo. Vortice bene. Incubare il campione per 5 minuti a RT. </li><li> Aggiungere 0,1 ml di cloroformio. Vortex il campione per 15 s e incubare a RT per 3 min. Centrifugare il campione per 15 minuti a 12.000 xg e 4 ° C. Trasferire la fase acquosa superiore (circa 250 μL) in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 25 μL di acetato di sodio e 1 μl di glicogeno al campione. Precipitare l&#39;RNA mescolandolo con 250 μL di alcool isopropilico. Mescolare accuratamente. Incubare il campione in RT per 10 min. </li><li> Centrifugare per 10 min a 12.000 xg e 4 ° C. Rimuovere completamente il surnatante. Lavare il pellet RNA due volte con 500 μl di etanolo al 75%. </li><li> Centrifugare per 5 minA 7.500 xg e 4 ° C. Rimuovere l&#39;etanolo residuo e asciugare in aria l&#39;impianto di RNA per 5-10 min. Sciogliere l&#39;RNA in 10 μL di acqua priva di nucleasi. </li><li> Convertire l&#39;RNA in cDNA usando un sistema di trascrizione trasversale. Soggetti i campioni di cDNA a PCR in tempo reale utilizzando il mix master del kit qPCR (2x) e un sistema PCR in tempo reale 9 . NOTA: Le sequenze primer sono: H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC; H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA; H β-ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC; H β-ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC; H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC; H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT; H SOX9 -F: AGCGAACGCACATCAAGAC; H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG; H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT; H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui forniamo un protocollo per generare condrociti da PBC tramite iPSC. Poiché i PBC sono più comuni e ampiamente utilizzati nel campo clinico, essi vengono presentati come una potenziale alternativa per la riprogrammazione. In questo studio, visi episomici (EV) sono stati utilizzati per riprogrammare PBC in iPSC, seguendo il metodo stabilito da Zhang et al. 11 . Questo approccio senza integrazione non prevede l&#39;integrazione di genotossicità associata a virus, che si ritiene avere un...

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Yueying Li 
yueyinglee2010@hotmail.com 
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences
The corresponding author is now listed as:
Tie Liu 
waterkins@163.com 
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University

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Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Il tessuto cartilagineo ha una capacità molto scarsa per l&#39;auto-riparazione e la rigenerazione. Sono stati utilizzati diversi interventi chirurgici e trattamenti biologici per ripristinare la funzionalità della cartilagine e delle articolazioni, con risultati insoddisfacenti. Il recente sviluppo della tecnologia delle cellule staminali può cambiare l&#39;intero campo di riparazione della cartilagine 1 . Diverse cellule staminali sono state studiate come cellule di sementi, ma le cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo (hiPSCs) sembrano essere la scelta più promettente in quanto possono fornire molti tipi di cellule specifiche del paziente senza causare reazioni di reiezione 2 . Inoltre, possono superare la limitata natura proliferativa delle cellule adulte e mantenere le proprie capacità di auto-rinnovamento e pluripotenti. Inoltre, il targeting genico può essere utilizzato per cambiare il genotipo per ottenere tipi specifici di condrociti. I fibroblasti sono stati ampiamente usati per generare iPSC perché i loro potenziamenti di riprogrammazione sono stati anche studiati bene.Tuttavia, ci sono ancora alcune limitazioni che devono essere superate, come la dolorosa biopsia dei pazienti e la necessità di espansione in vitro dei fibroblasti, che possono portare a mutazioni genetiche 3 . Recentemente, i PBC sono stati trovati vantaggiosi per la riprogrammazione 4 ; Inoltre, sono stati comunemente utilizzati e abbondantemente memorizzati. È possibile che possano reindirizzare la messa a fuoco dello studio dalla pelle. Tuttavia, al meglio delle nostre conoscenze, ci sono poche relazioni sulla riprogrammazione del PBC seguito dalla differenziazione nei condrociti. Nello studio in corso, utilizziamo PBC come fonte alternativa riprogrammandoli in iPSC e poi differenziando iPSC nel linfondaggio genetico attraverso un sistema di coltura di pellet per imitare la formazione di condrociti.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829018</td><td>Terreno basale utilizzato per la coltura di hiPSC e il terreno di formazione di EB</td></tr><tr><td>Sostituzione del siero knockout (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>Un integratore di terreno più definito, privo di FBS, utilizzato per la coltura di hiPSC e il terreno di formazione di EB</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>sh30070.03</td><td>Utilizzato per la coltura di hiPSC e il terreno di formazione di EB, offre un eccellente valore per le cellule coltura</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Chemicon</td><td>TMS-001-C</td><td>Utilizzato come integratore per la crescita in tutto il terreno di coltura cellulare, per aumentare la crescita e la vitalità cellulare</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>TMS-002-C</td><td>Un amminoacido necessario per la coltura cellulare</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Una citochina utilizzata per sostenere la pluripotenza e l'autorinnovamento delle hiPSC</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105041</td><td>Utilizzato per la dissociazione hiPSC per la subcoltura</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11960</td><td>Terreno basale utilizzato per il terreno di coltura MSC</td></tr><tr><td>0,1% di gelatina</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td>Utilizzato per l'attacco cellulare sulle piastre</td></tr><tr><td>0,25% tripsina/EDTA</td><td>Gibco 25200072</td><td></td><td>Utilizzato per la dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>Una soluzione salina bilanciata utilizzata per il lavaggio cellulare o per la preparazione di reagenti</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>invitrogeno</td><td>21985023</td><td>Utilizzato come integratore per la crescita in tutti i terreni di coltura cellulare.</td></tr><tr><td>ITS</td><td>invitrogen</td><td>41400045</td><td>insulina, transferrina, soluzione di selenio. Utilizzato per la differenziazione condrogenica.</td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma</td><td>4403</td><td>Conosciuto come vitamina C. Aiuta nella crescita attiva e ha proprietà antiossidanti.</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Aggiunto al terreno di coltura cellulare come fonte di energia in aggiunta al glucosio.</td></tr><tr><td>Fattore di crescita trasformante-beta 1</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-21C</td><td>Una citochina che regola la proliferazione cellulare, la crescita e la differenziazione condrogenica.</td></tr><tr><td>Anticorpi policlonali di coniglio contro il collagene II</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Questo anticorpo reagisce con i collageni di tipo II, che è specifico per i tessuti cartilaginei</td></tr> .<tr><td>Anticorpi monoclonali di topo contro il collagene X</td><td>Abcam</td><td>ab49945</td><td>Questo anticorpo reagisce con il collagene di tipo X, che è un prodotto di condrotociti ipertrofici.</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>Per il montaggio e la conservazione a lungo termine di vetrini</td></tr><tr><td>Blu di toluidina</td><td>Sigma</td><td>89640</td><td>Utilizzato per il rilevamento di proteoglicani.</td></tr><tr><td>Blu di Alcian</td><td>Amresco</td><td>#0298</td><td>Utilizzato per il rilevamento di glucosamminoglicani.</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Sigma</td><td>P4762-25MG</td><td>Utilizzato per digerire pellet condrogenici.</td></tr><tr><td>Blu di dimetilmetilene</td><td>Sigma</td><td>341088-1G</td><td>Utilizzato per quantificare i glicosaminogliani</td></tr><tr><td>Condroitina solfato sale sodico dalla cartilagine di squalo</td><td>Sigma</td><td>C4384-250MG</td><td>Utilizzato per disegnare la curva standard per la misurazione del contenuto di sGAG.</td></tr><tr><td>Kit di analisi Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851 (100)</td><td>Utilizzato per determinare il contenuto di DNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Utilizzato per l'isolamento dell'RNA dalle cellule</td></tr><tr><td>Sistema di trascrittasi inversa</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>Utilizzato per convertire l'RNA in cDNA</td></tr><tr><td>SYBR FAST kit qPCR Master Mix</td><td>Kapa</td><td>KK4601</td><td>Utilizzato per la PCR in tempo reale</td></tr></tbody></table>

differenziare i condrociti da cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo derivato dal sangue

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In questo studio abbiamo utilizzato le cellule del sangue periferico (PBCs) come cellule di sementi per produrre condrociti attraverso cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) in un metodo senza integrazione. A seguito della formazione del corpo embrionale (EB) e dell&#39;espansione cellulare fibroblastica, iPSCs sono indotti per la differenziazione condrogenica per 21 giorni in condizioni prive di siero e privo di xeno. Dopo l&#39;induzione di condrociti, i fenotipi delle cellule sono valutati mediante analisi morfologiche, immunohistochemiche e biochimiche, nonché con l&#39;esame quantitativo in tempo reale PCR di marcatori di differenziazione condrogenica. I pellet condondensivi mostrano una colorazione blu positiva e blu toluidina. L&#39;immunohistochemistry della colorazione dei collagene II e X è anche positivo. Il contenuto di glicosaminoglicano solfato (sGAG) ei marcatori di differenziazione condrogenici COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 e AGGRECAN sono notevolmente aumentati nella condizionePellicole rogeniche rispetto a hiPSC e cellule fibroblastiche. Questi risultati suggeriscono che i PBC possono essere utilizzati come cellule di sementi per generare iPSC per la riparazione della cartilagine, che è specifica del paziente e conveniente.

Differenziazione condrogenica di hiPSCs: Il medium di formazione EB e il mezzo di coltura basale sono stati utilizzati per differenziare i hiPSC nel linfatico mesenchimale. È stato utilizzato un metodo di coltura a più fasi ( Figura 1 ). In primo luogo, i hiPSCs sono stati spontaneamente differenziati tramite la formazione di EB per 10 giorni (D10; Figura 2A ). In second...

Presentiamo un protocollo per generare una linea condrogenica dal sangue periferico umano (PB) attraverso cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) utilizzando un metodo senza integrazione, che comprende la formazione del corpo embrionale (EB), l&#39;espansione delle cellule fibroblasiche e l&#39;induzione condrogenica.

Differenziare i condrociti da cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo derivato dal sangue

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule della linea condrogenica da cellule staminali pluripotenti indotte derivate dal sangue periferico umano, o cellule IPS. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della rigenerazione della cartilagine riguardo all'uso di cellule del sangue periferico derivate dal paziente come cellule C per la generazione di cellule IPS finalizzate alla riparazione della cartilagine. I principali vantaggi di questa tecnica sono la facile riproducibilità e il fatto che la differenziazione in condrociti avviene in condizioni libere da siero e da agenti xenogeni.Iniziare seminando cellule iPS umane in quattro millilitri di mezzo per cellule staminali pluripotenti indotte umane su una piastra per colture cellulari da 60 millimetri contenente uno strato monocellulare di fibroblasti embrionali murini irradiati utilizzati come cellule nutrici. Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius in un’atmosfera contenente il cinque percento di anidride carbonica. Quando le cellule staminali raggiungono una confluenza compresa tra l’80 e il 90 percento, dissociare le cellule con soluzione di dispasi per il sottocoltivo.Dopo due

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Biologia dello sviluppo

L'articolo descrive la metodologia dettagliata per differenziare efficacemente le cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti selettivamente modulando la via di Wnt, seguita da analisi citofluorimetrica di marcatori di riferimento per valutare l'omogeneità e l'identità della popolazione.

Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

Lo stress meccanico può indurre la differenziazione condrogenica delle cellule staminali, fornendo un potenziale approccio terapeutico per la riparazione della cartilagine compromessa. Presentiamo un protocollo per indurre la differenziazione condrogenica di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) utilizzando la gravità centrifuga (CG). L'upregolazione di SOX9 indotta dalla CG porta allo sviluppo di fenotipi condrogenici.

Condrogenico Differenziazione induzione di cellule staminali derivate da tessuto adiposo per gravità centrifuga

Qui, presentiamo pluripotenti umane protocolli di coltura della cellula formativa (hPSC), utilizzata per differenziare hPSCs in CD34+ progenitori ematopoietici. Questo metodo utilizza la modifica di fase-specifici di Canonica WNT segnalazione per specificare le celle esclusivamente al programma ematopoietica sia definitiva o primitivo.

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

Qui proponiamo un protocollo di differenziazione condrogenica da cellule staminali pluripotenti indotte da cellule mononucleate del sangue cordonale.

Formazione di pellet condensato da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue

Vi proponiamo un protocollo che Mostra come differenziare i cheratinociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte e fibroblasti e generare un organoid pelle 3D, utilizzando questi cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo contiene un ulteriore passaggio di generazione di un modello di topi umanizzati. La tecnica presentata qui miglioreranno ricerca dermatologica.

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

L'obiettivo del presente protocollo è quello di testare la capacità di cellule progenitrici derivate dal tessuto adiposo umano perivascolare di differenziarsi in stirpi multipli delle cellule. La differenziazione è stata confrontata alle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano, che è noto per differenziare in adipociti, Osteocita e lignaggi di condrociti.

Capacità di differenziazione delle cellule progenitrici umane aortica perivascolare adiposo

Presentato qui è un semplice protocollo per la differenziazione diretta delle cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane in circa 1 settimana.

Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo descrive e confronta due metodi rappresentativi per differenziare le hiPSC in cellule stromali mesenchimali (MSC). Il metodo monostrato è caratterizzato da un costo inferiore, da un funzionamento più semplice e da una più facile differenziazione osteogenica. Il metodo dei corpi embrioidi (EBs) è caratterizzato da un minor consumo di tempo.

Confronto di due metodi rappresentativi per la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule stromali mesenchimali

Questo protocollo presenta il differenziamento degli osteoclasti umani dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e descrive i metodi per la caratterizzazione degli osteoclasti e dei precursori degli osteoclasti.

Differenziamento e caratterizzazione di osteoclasti da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento dei condrociti, dei condroprogenitori derivati dal dosaggio di adesione della fibronectina (FAA-CP) e dei condroprogenitori migratori (MCP) dalla cartilagine articolare umana. Copre la digestione enzimatica, l'adesione della fibronectina e i saggi basati sulla migrazione per isolare e caratterizzare queste cellule.

Isolamento di condrociti e condroprogenitori mediante adesione della fibronectina e saggio migratorio

Questo studio descrive un metodo per la produzione di sferoidi condrocitici aggregando le cellule in sferoidi in condizioni di bassa adesione utilizzando la gravità, seguita dalla coltura degli sferoidi risultanti in mini-bioreattori.

Generazione di sferoidi da vari condrociti utilizzando condizioni di bassa adesività per gravità e mini-bioreattori fatti in casa

Scopri un protocollo riproducibile per differenziare iPSC da cellule del sangue periferico in condrociti. Questo metodo senza siero e xeno-free offre un approccio personalizzato per la rigenerazione della cartilagine.

Differenziare i condrociti da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo derivato dal sangue

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