Differenziare i condrociti da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo derivato dal sangue

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule di linea condrogenica da cellule staminali pluripotenti indotte derivate dal sangue periferico umano, o cellule IPS. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo della rigenerazione della cartilagine sull'utilizzo di cellule del sangue periferico derivate dal paziente come cellule C per la generazione delle cellule IPS per la riparazione della cartilagine. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è facilmente riproducibile e la differenziazione dei condrociti avviene in condizioni di siero e xeno-free.

Inizia piastrando le cellule IPS umane in quattro millilitri di terreno IPSC umano su una piastra di coltura tissutale da 60 millimetri contenente un monostrato di cellule alimentatrici di fibroblasti embrionali di topo irradiate. Coltiva le cellule a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al cinque percento. Quando le cellule staminali sono confluenti all'80-90 per cento, dissociare le cellule con la soluzione dispace per la subcoltura.

Dopo due o tre passaggi, utilizzare un ago di vetro trafilato a fuoco per sezionare l'80-90% di colonia di IPSC indifferenziata confluente in frammenti più piccoli e trasferire non più di 100 pezzi di coltura cellulare in una nuova piastra di Petri non aderente da 100 millimetri contenente 10 millilitri di terreno di formazione del corpo embrioide. La dissociazione meccanica è migliore della digestione automatica perché riduce il danno cellulare a piccoli frammenti di cellule da trasferire nel nuovo contenitore di coltura e annuncia lo smaltimento manuale delle cellule di alimentazione, che reprimono la differenziazione delle cellule IPS umane. Riportare le cellule IPS umane nell'incubatore per colture cellulari.

Dopo due giorni, inclinare la capsula per far depositare i corpi embrioidi e sostituire con cura tre millilitri di terreno di formazione del corpo embrioide con quattro millilitri di terreno di coltura basale fresco. Dopo 10 giorni, si saranno formati corpi embrioidi. Rivestire un nuovo piatto da 100 millimetri con quattro millilitri di gelatina allo 0,1% per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Trasferisci i corpi embrioidi con il surnatante in un tubo conico da 15 millilitri e lascia riposare i corpi per quattro o cinque minuti. Aspirare tutti tranne gli ultimi 0,5 millilitri di terreno e risospendere i corpi embrioidi in 10 millilitri di terreno di coltura basale fresco. Quando la gelatina si è solidificata, scartarla.

Quindi seminare le cellule sul piatto ricoperto di gelatina e posizionare il piatto nell'incubatore per colture cellulari. Dopo 10 giorni in coltura, i corpi embrioidi si saranno differenziati in escrescenze di cellule fibroblastiche. Per indurre la differenziazione dei condrociti, lavare la coltura con DPBS e staccare le cellule con tre millilitri di tripsina EDTA allo 0,25% a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Quando le cellule si sono sollevate dal fondo della piastra, neutralizzare la reazione con quattro millilitri di terreno di coltura basale fresco e titolare delicatamente la coltura da cinque a 10 volte. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a rete di nylon da 70 micron e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Quindi seminare le cellule su una nuova piastra da 100 millimetri rivestita di gelatina in 10 millilitri di terreno di coltura basale fresco.

Quando la coltura raggiunge la confluenza dal 90 al 100 percento, raccogliere le cellule con tre millilitri di tripsina EDTA allo 0,25 percento, come appena dimostrato per il conteggio. Trasferire una quota di cellule da tre volte 10 a una quinta in una provetta di polipropilene da 15 millilitri per la centrifugazione. E risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di differenziazione condrogenico.

Quindi, centrifugare nuovamente le cellule e posizionare la provetta nell'incubatore per colture cellulari per 21 giorni senza disturbare il pellet. Le cellule condrogeniche possono assemblarsi in vitro, producendo metriche extracellulari caratteristiche in condizioni di coltura ad alta densità. Dopo 21 giorni di coltura, si sarà formato un pellet condrogenico di cellule IPS umane.

Dopo 21 giorni di coltura, le cellule condrogeniche IPSC umane sono positive per il blu di alciano e la toluidina nella colorazione blu, indicando una differenziazione condrogenica riuscita del pellet HIPSC. L'analisi immunoistochimica del collagene 2 e del collagene 10 conferma ulteriormente il loro fenotipo simile ai condrociti. L'analisi dei glicosaminoglicani solfatati rivela che il contenuto di glicosaminoglicani solfatati delle cellule è significativamente sovraregolato nei pellet condrogenici IPSC umani, rispetto alle cellule fibroblastiche IPSC umane, ai corpi embrioidi e alle cellule IPS umane indifferenziate.

Inoltre, le cellule condrogeniche IPSC umane dimostrano un alto livello di espressione genica del lignaggio condroprogenitore e marcatori condrocitari completamente differenziati, suggerendo il raggiungimento di una differenziazione condrogenica di successo. Un metodo di coltura multistep utilizzato per differenziare le IPSC umane in condrociti, inclusa la differenziazione spontanea tramite la formazione di EB, la crescita cellulare da EB, la coltura cellulare monostrato dopo la coltura cellulare e la coltura di pellet 3D. Il fenotipo dei condrociti viene valutato mediante analisi istologica, analisi biochimica ed espressione genica condrogenica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un metodo di coltura multistep per indurre la differenziazione delle cellule IPS umane in condrociti. Questa tecnica potrebbe essere più specifica per il paziente ed economica.