Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Differentierande kondrocyter från perifert blod härledda humana inducerade plöripotenta stamceller

Published: July 18, 2017 doi: 10.3791/55722
Automatic Translation
2, 1, 3, 1
1Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University, 2Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, 3Clinical and Translational Research Center of Shanghai First Maternity & Infant Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att generera en kondrogenstamning från humant perifert blod (PB) via inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) med hjälp av en integrationsfri metod som innefattar embryoidkropps (EB) -bildning, expansion av fibroblastiska celler och kondrogeninduktion.

Abstract

I denna studie använde vi perifera blodceller (PBC) som fröceller för att producera kondrocyter via inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) i en integrationsfri metod. Efter embryoidkropps (EB) -bildning och fibroblastisk cellexpansion induceras iPSCs för kondrogenisk differentiering under 21 dagar under serumfria och xenofria betingelser. Efter kondrocytinduktion utvärderas fenotyperna hos cellerna genom morfologiska, immunohistokemiska och biokemiska analyser, liksom av den kvantitativa realtids PCR-undersökningen av kondrogena differentieringsmarkörer. Kondrogena pellets visar positiv alcianblå och toluidinblåfärgning. Immunohistokemin för kollagen II och X-färgning är också positiv. Det sulfaterade glykosaminoglykan-innehållet (sGAG) och de kondrogena differentieringsmarkörerna COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 och AGGRECAN är signifikant uppreglerade i tjondRogeniska pellets jämfört med hiPSC och fibroblastiska celler. Dessa resultat tyder på att PBC kan användas som fröceller för att generera iPSCs för broskreparation, vilket är patientspecifikt och kostnadseffektivt.

Introduction

Bruskvävnad har en mycket dålig kapacitet för självreparation och regenerering. Olika kirurgiska ingrepp och biologiska behandlingar används för att återställa brusk och ledfunktion, med otillfredsställande resultat. Den senaste utvecklingen av stamcellsteknologin kan ändra hela bruskreparationsfältet 1 . Olika stamceller har studerats som fröceller, men humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) verkar vara det mest lovande valet, eftersom de kan ge många typer av patientspecifika celler utan att orsaka avstötningsreaktioner 2 . Dessutom kan de övervinna den vuxna cellens begränsade proliferativa natur och behålla sin självförnyelse och pluripotenta förmågor. Dessutom kan genriktning användas för att ändra genotypen för att erhålla specifika typer av kondrocyter.

Fibroblaster har använts i stor utsträckning för att generera iPSCs eftersom deras omprogrammeringspotentialer också har blivit väl studerade.Det finns emellertid fortfarande vissa begränsningar som måste övervinnas, såsom den smärtsamma biopsin från patienter och behovet av in vitro- expansion av fibroblasterna, vilket kan resultera i genmutationer 3 . Nyligen visade sig PBCs vara fördelaktiga för omprogrammering 4 ; Dessutom användes de vanligen och lagras rikligt. Det är möjligt att de kan omdirigera studiefokus från huden. Men, så vitt vi vet, finns det få rapporter om PBC-omprogrammering följt av differentiering till kondrocyter.

I den aktuella studien använder vi PBC som en alternativ källa genom att omprogrammera dem till iPSCs och sedan differentiera iPSC: erna i kondrogena linjen genom ett pelletsodlingssystem för att efterlikna kondrocytbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollet för generering av hiPSC från PBC kan hittas i vår tidigare studie 5 . Studien godkändes av institutionens institutionella granskningsråd.

1. Embryoid Body (EB) Formation

  1. Gör 50 ml hiPSC-medium: Knockout Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 15% knockout serumutbyte (KSR), 5% fetalt bovint serum (FBS), 1 x icke-essentiella aminosyror, 55 | iM 2-merkaptoetanol, 2 mM L -glutamin och 8 ng / ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF).
  2. Gör 50 ml av EB-bildningsmedium: DMEM kompletterat med 15% KSR, 5% FBS, 1x icke-essentiella aminosyror, 55 | iM 2-merkaptoetanol och 2 mM L-glutamin.
  3. Gör 50 ml basalt odlingsmedium: DMEM kompletterat med 20% FBS, 1 x icke-essentiella aminosyror, 55 | iM 2-merkaptoetanol och 2 mM L-glutamin.
  4. Förbered 10 ml dispaslösning, 1 mg / ml vid utmatning av DMEM.
  5. CultuRe hiPSCs på 60 mm vävnadsodlingsdiskar med matarceller ( dvs ett monoskikt av bestrålade musembryoniska fibroblastceller). När cellerna är 80-90% konfluenta, disassociera cellerna med dispas och passera hiPSCs 1: 3 var 4-5 dagar. Placera cellerna i ett 37 ° C och 5% CO2 inkubator.
  6. Dissektera de odifferentierade hiPSC-kolonierna i mindre bitar (ca 50-100 μm i diameter) med en elddragen glasnål när iPSCs är 80-90% konfluenta. Använd i allmänhet HiPSC kolonier i en 60 mm maträtt för att generera EB i en 100 mm petriskål.
    1. Kultur mindre än 100 små bitar av kolonier i en 100 mm icke-vidhäftande petriskål innehållande 10 ml EB-formationsmedium. Placera skålarna i en 37 ° C och 5% CO2 inkubator.
  7. Ersätt ca 25% av det ursprungliga mediet med en lika stor mängd basal odlingsmedium varannan dag. Luta upp skålen för att låta EB-systemen lösa sig. Ta försiktigt bort 3 mlAv övre medium och tillsätt 4 ml färskt basalt odlingsmedium. Stör inte EB: erna.
    OBS: EB: erna karaktäriseras morfologiskt av kolonnstyckena och tar ett runt utseende med släta gränser under mikroskopet.
  8. Efter 10 dagar odling i den icke-vidhäftande Petri-skålen, belägga en ny 100 mm vävnadskulturskål med 4 ml 0,1% gelatin i 30 minuter vid 37 ° C före användning.
  9. Överför mediet plus EB från en 100 mm icke-vidhäftande petriskål till ett 15 ml koniskt rör. Låt EB-sedimentet ligga i 4-5 min. Aspirera supernatanten försiktigt och lämna mindre än 0,5 ml medium plus EB
  10. Frö mindre än 100 EB på en 100 mm, gelatinbelagd vävnadsodlingsskål med 10 ml basal odlingsmedium. Placera skålarna i en 37 ° C och 5% CO2 inkubator.

2. Cellpelletsbildning och kondrocytdifferentiering

  1. Gör 10 ml 0,25% trypsin / etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Gör 80 ml basAlkulturmedium: DMEM kompletterat med 20% FBS, 1x icke-essentiella aminosyror, 55 | iM 2-merkaptoetanol och 2 mM L-glutamin.
  2. Gör 10 ml kondrogeniskt differentieringsmedium: DMEM (hög glukos) kompletterad med 10% insulin-transferrin-selenlösning (ITS), 0,1 μM dexametason, 1 mM askorbinsyra, 1% natriumpyruvat och 10 ng / ml omvandlingsvågfaktor- Beta 1 (TGF-β1).
  3. Uppdatera mediet med 10 ml basalt odlingsmedium efter 48 timmar. Därefter uppdateras mediet var tredje dag med 10 ml basalt odlingsmedium.
    OBSERVERA: Efter 10 dagar i odling, bör fibroblastiska cellutväxten ha expanderat från EBs.
    1. Belägg 100mm-disken med 4 ml 0,1% gelatin i 30 minuter vid 37 ° C före användning. Kassera cellens supernatant och tvätta cellerna med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) en gång.
    2. Digestera cellerna med 3 ml 0,25% trypsin / EDTA vid 37 ° C i 5 minuter och neutralisera med 4 mL av basalt odlingsmedium.
  4. Dissociera cellerna i enskilda celler genom att pipettera upp och ner 5-10 gånger och passera dem genom ett 70 μm nylonnät. Centrifugera cellsuspensionen vid 200 xg i 5 min. Fräda cellerna på en ny 100 mm, gelatinbelagd vävnadskulturskål med 10 ml basal odlingsmedium.
  5. Uppdatera mediet med 10 ml basalt odlingsmedium efter 48 timmar. Därefter uppdateras mediet var tredje dag med 10 ml basalt odlingsmedium.
    OBS: Cellerna förvärvar en homogen, fibroblastliknande morfologi.
  6. När ~ 90-100% konfluens uppnås ( dvs. ca 5-7 dagar) skördar cellerna med 3 ml 0,25% trypsin / EDTA vid 37 ° C i 5 minuter. Neutralisera med 4 ml basalt odlingsmedium. Dissociera cellerna i enskilda celler genom att pipettera upp och ner 5 gånger. Använd en hemocytometer för att räkna cellnumret.
    1. Placera 3 x 10 5 celler i ett 15 ml polypropenrör. Centrifugera vid 200 xgI 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Re-suspendera cellerna i 1 ml kondrogeniskt differentieringsmedium.
  7. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 3 min och behåll cellerna i liten pelletsform. Sätta in röret i 37 ° C och 5% CO2 inkubator under 21 dagar. Skruva inte locket ordentligt och låt gasen byta ut.
  8. Ersätt 3/4 av odlingsmediet var tredje dag med färskt kondrogeniskt differentieringsmedium.
    OBS: Efter 21 dagar i odling skulle hiPSC-kondrogena pellets (hiPSC-Chon) ha bildats. Mänskliga mesenkymala stamceller (MSCs), som en positiv kontroll, samlas också upp och odlas i det kondrogena differentieringsmediet under 21 dagar för att bilda kondrogena pellets (hMSC-Chon).

3. Analys av kondrogenisk differentiering

  1. Framställ 10 ml 10% neutralbuffrad formalin.
  2. Framställ 50 ml 0,1% alcianblått reagens och 50 ml 1% toluidinblåttreagens.
  3. PrEpare 1 ml av de primära antikropparna: kaninpolyklonala antikroppar mot kollagen II (1:50) eller musmonoklonala antikroppar mot kollagen X (1:50). Förbered också anti-kanin eller mus sekundära antikroppar.
  4. Gör 1 ml papainlösning: 10 U / ml i PBS med 0,1 M natriumacetat, 2,4 mM EDTA och 5 mM L-cystein.
  5. Gör 100 ml dimetylmetylenblå (DMMB) färglösning: 100 | il av 16 mg / 1 1,9-dimetylmetylenblått, 40 mM glycin, 40 mM NaCl och 9,5 mM HCl; PH 3,0.
  6. Bedöm chondrogen differentiering av alcianblå och toluidinblå fläckar av pelletsektionerna.
    1. Fixera en hiPSC-Chon-pellets eller hMSC-Chon-pellets i 1 ml 10% neutralbuffrad formalin i 24 timmar.
    2. Överföra pelleten till en ml 70% etanol i H2O Dehydratisera pelleten med 1 ml av en graderad etanolserie (dvs 25, 50, 75, 90, 95, 100, och 100%, 3 min vardera).
    3. Klargör pelleten i 1 ml 100% xylen tre gånger. InfiltratE pelleten med paraffin i 1 timme i en 65 ° C ugn. Bädda in pelleten i paraffinblock med en 7 x 7 x 5 mm 3 basform, efter rutinhistologiska procedurer 6 .
    4. Gör intilliggande sektioner med mikrotom med en tjocklek av ca 4 μm 7 . Håll sektionerna på glasskivor.
    5. Torka glidorna i 2 timmar vid 60 ° C i en ugn. Deparaffinera sektionerna i tre cykler (3 min vardera) med 100% xylen.
    6. Använda en minskande alkoholserie för rehydrering (dvs 100, 100, 95, 95, 70, 50, och 25% i H2O, 3 min vardera) och sedan utföra en slutlig sköljning med avjoniserat vatten under 5 min.
    7. Färga avsnitten med 0,1% alcianblått reagens eller 1% toluidinblåfärgning i 4-5 h och skölj dem sedan med destillerat vatten.
    8. Dehydratiseras med en graderad etanolserie ( dvs. 25, 50, 75, 90, 95, 100 och 100%, 3 min vardera) följt av tre på varandra följande stEps för förtydligande i 100% xylen. Montera bilderna och visualisera dem under ett mikroskop.
  7. Utför immunhistokemi.
    OBS: Ytterligare pelletsektioner utvärderas ytterligare genom immunhistokemi.
    1. Efter deparaffinisering och rehydrering bringas glidarna i koka i 1 mM EDTA, pH 8,0 (vattentätt i vatten kokat av autoklav). Låt dem sitta i 8 minuter vid en underkokningstemperatur och låt sedan glidorna svalna vid RT.
    2. Skölj skivorna med avjoniserat vatten 3 gånger. Inkubera sektionerna i 3% H 2 O 2-lösning i metanol vid RT under 15 min för att blockera endogen peroxidasaktivitet.
    3. Skölj bilderna med avjoniserat vatten och fördjupa dem i DPBS i 5 minuter. Applicera 50-100 μl av lämpligt utspädd (1:50) primär antikropp mot sektionerna på glidbanorna och inkubera dem sedan i en fuktad kammare vid RT under 1 h.
    4. Tvätta bilderna 3 gånger (5 min vardera) med DPBS. Inkubera saMples med motsvarande sekundära antikroppar ( dvs anti-kanin eller mus) i 15 minuter vid RT.
    5. Tvätta bilderna 3 gånger (i 5 min vardera) med DPBS. Utför DAB-detektering under ett mikroskop.
    6. Tvätta bilderna med DPBS 3 gånger (2 min vardera). Motverka cellkärnorna genom att fördjupa gliderna i hematoxylin i 1-2 minuter. Dehydratiseras med en graderad etanolserie (25, 50, 75, 90, 95, 100 och 100%, 3 min vardera) följt av tre på varandra följande steg av förtydligande med xylen. Slutligen montera bilderna och visualisera dem under mikroskopet.
  8. Upptäck sGAG-innehåll.
    1. Digestera kondrogena pellets i papainlösning vid 60 ° C under 2 timmar.
    2. Bestäm DNA-innehållet med hjälp av dsDNA-analyspaketet och fluorometersystemet. Mät sGAG-innehållet genom att blanda det med DMMB-färglösning under mät absorbansen vid 525 nm 8 .
    3. Beräkna koncentrationen av sGAG mot en standardkurva påHajkondroitinsulfat.
  9. Utför realtids-PCR-analysen av de kondrogena differentieringsmarkörerna i hiPSC-Chon-pellets.
    1. Skörda 3-4 av samma kondrogena pellets genom att tillsätta 500 pi iskall extraktionsreagens till ett rör. Virvel grundligt. Inkubera provet i 5 min vid RT.
    2. Tillsätt 0,1 ml kloroform. Vortexa provet i 15 s och inkubera det vid RT i 3 min. Centrifugera provet i 15 minuter vid 12 000 xg och 4 ° C. Överför den övre vattenhaltiga fasen (ca 250 μl) i ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    3. Tillsätt 25 μl natriumacetat och 1 μl glykogen till provet. Precipitera RNA genom att blanda den med 250 | il isopropylalkohol. Blanda noggrant. Inkubera provet vid RT i 10 minuter.
    4. Centrifugera i 10 minuter vid 12 000 xg och 4 ° C. Ta bort supernatanten helt. Tvätta RNA-pelleten två gånger med 500 | il 75% etanol.
    5. Centrifugera i 5 minVid 7.500 xg och 4 ° C. Avlägsna allt kvarvarande etanol och lufttorka RNA-pelleten i 5-10 minuter. Lös RNA i 10 μl nukleasfritt vatten.
    6. Konvertera RNA till cDNA med användning av ett omvänd transkriptas-system. Ämne cDNA-proverna i realtid PCR med hjälp av qPCR kit-masterblandningen (2x) och ett realtids-PCR-system 9 .
      OBS: Primersekvenserna är:
      H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
      H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      H- 3-ACTIN- F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      H- 3-ACTIN- R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      H COL2- F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
      H COL2- R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      H SOX9- F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
      H SOX9- R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      H COL10- F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      H COL10- R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kondrogen Differensiering av hiPSC: er:

EB-bildningsmedium och basal odlingsmedium användes för att differentiera hiPSC: erna i mesenkymstammen. En kultur med flera steg användes ( figur 1 ). Först differentierades hiPSC: erna spontant via EB-bildning under 10 dagar (D10; Figur 2A ). För det andra utbröt cellerna från EB i ytterligare 10 dagar (D10 + 10). Under dessa två steg, förlorade iPSCs gradvis sina ursprungliga morfologier och erhöll spindelformade morfologier ( Figur 2B ), som sedan ändrades till en fibroblastisk form efter passage. För det tredje expanderade cellerna i monoskikt efter subkultur ( Figur 2C ). Återstående, odifferentierade celler uteslutes under detta steg. Därefter expanderades cellerna och engagerade sig till fibroblastliknande celler efter5-7 dagar i monolagskultur (D10 + 10 + 7). För det fjärde, när hiPSC-fibroblastliknande celler (hiPSC-F) nådde ca 90% sammanflöde, inducerades de att differentiera till kondrocyter via en 3D-pellets kultur ( Figur 2D ) 10 .

Karakterisering av hiPSC-Chon-pellets:

HiPSC-F odlades i 15 ml polypropenrör i pelleten i 21 dagar. Kondrogena celler kan montera in vitro och producera en karakteristisk extracellulär matris vid hög densitetskultur. I slutet av kulturen kunde vi se ett tätt, broskliknande aggregat, hiPSC-Chon-pelleten, som var upp till 2-3 mm långt och 3 mm tjockt ( Figur 2D ). Cellerna var positiva för alcianblått ( Figur 3A ) och toluidinblå ( Figur 3B ) färgning, vilket indikerade framgångenUl kondrogenisk differentiering av hiPSC-pellets. Immunohistokemianalys för kollagen II ( Figur 3C ) och kollagen X ( Figur 3D ) visade vidare att hiPSC-Chon-pellets hade utvecklat en kondrocytliknande fenotyp. Negativa kontroller av immunhistokemi för kollagen II och kollagen X utfördes för att bättre visa den positiva färgningen (data ej visad) 5 .

SGAG-analys utfördes också efter kondrogenisk differentiering ( Figur 3E ). SGAG-innehållet detekterades i hiPSC-Chon-pellets, hiPSC-F, EBs och de odifferentierade hiPSC: erna. SGAG-innehållet var signifikant uppreglerat i hiPSC-Chon-pellets än i de andra grupperna ( P <0,05). I den positiva kontrollen av hMSC-Chon var sGAG-halten också signifikant uppreglerad ( P <0,05) jämfört med hMSCs. Emellertid sGAG-innehålletMellan hMSC-pellets och hiPSC-Chon-pellets visade ingen skillnad ( P > 0,05).

Genuttryck av kondrogena differentieringsmarkörer:

Genuttryck av differentieringsmarkörerna för kondro-progenitor-linjen ( SOX9 och COL2 ) och fullständigt differentierade kondrocyter ( AGGRECAN och COL10 ) användes för att karakterisera fenotypen av kondrogena pellets ( Figur 4 ). I jämförelser mellan hiPSCs, hiPSC-F och hiPSC-Chon-pellets upprepades uttryck av COL2 , COL10 , SOX9 och AGGRECAN signifikant i hiPSC-Chon än i de andra grupperna ( P <0,05). I den positiva kontrollen av hMSC-Chon var även uttrycket av dessa markörer uppreglerat väsentligt än i hMSCs ( P <0,05). Emellertid är genuttrycket mellan hMSC-pellets och hiPSC-Chon-pellets visade inga skillnader ( P > 0,05). Sammantaget tyder dessa resultat på en framgångsrik kondrogenisk differentieringsprocess från humana iPSCs.

Figur 1
Figur 1: Schematisk översikt över protokollet. En multistegskulturmetod som används för att differentiera humana iPSCs till kondrocyter, inklusive : 1) Spontan differentiering via EB-bildning, 2) Cellutväxt från EB, 3) Monolagscellkultur efter subkultur, och 4) 3D-pelletskultur. Kondrocytfenotypen utvärderas genom histologisk analys, biokemisk analys och kondrogen-genuttryck. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

"Figur Figur 2: Generering av kondrocyter från hiPSCs. ( A ) EB-bildning på D10. Skalstång = 100 μm. ( B ) Cellutväxt från EB på D10 + 10. Skalstång = 100 μm. ( C ) Monolagcellerkultur på D10 + 10 + 7. Skalstång = 100 μm. ( D ) 3D-pelletskultur. Denna siffra har ändrats från vår tidigare studie 5 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: Karakterisering av hiPSC-Chon-pellets. ( A ) Alcianblåfärgning och ( B ) toluidinblåfärgning av glykosaminoglykaner och proteoglykaner. Skalstång = 100 μm. ( C och D ) Immunohistokemi för kollagen II och kollagen X. Skalstång = 100 | im. ( E ) Biokemisk karakterisering av hiPSC-Chon-pellets kontra hiPSCs, EBs och hiPSC-F jämfört med hMSC-Chon kontra hMSCs. SGAG per DNA. Linjen representerar medelvärdet ± SEM. N = 3, * P <0,05. Denna siffra har ändrats från vår tidigare studie 5 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4
Figur 4: Genuttrycksanalys. RT-qPCR-genuttrycksanalys av kondrogena differentieringsmarkörer ( COL2 , COL10 , SOX9 och AGGRECAN ) i hiPSC-Chon mot hiPSCs och hiPSCF jämfört med hMSC-Chon kontra hMSCs. Linjen representerar medelvärdet ± SEM. N = 3, * P <0,05. Denna siffra har ändrats från vår tidigare studie 5 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här tillhandahåller vi ett protokoll för att generera kondrocyter från PBC via iPSCs. Eftersom PBC är vanligare och används i stort på kliniska fält presenteras de som ett potentiellt alternativ för omprogrammering. I denna studie användes episomala vektorer (EV) för att omprogrammera PBC till iPSCs, enligt metoden som fastställdes av Zhang et al. 11 . Detta integrationsfria tillvägagångssätt involverar inte integrering av virusassocierad genotoxicitet, vilket antas ha en bred effekt i kliniska fält 12 , 13 . Omprogrammeringseffektiviteten för att generera integrationsfria iPSC från blodceller i denna studie var nöjd. Mer än 30 iPSCs kan produceras från 2 ml perifert blod. Därför har PBC potential att vara fröcellerna som används för att generera iPSCs för broskteknik och andra kliniska tillämpningar.

De viktigaste stegen av kondrogena differeNtiation från hiPSCs inkluderade: EB-bildning, cellutväxt från EBs, monolagskultur och 3D-pelletskultur. Ockifferentierade hiPSC-kolonier dissekeras i mindre bitar med en elddragen glasnål. Den mekaniska metoden, även om den är mer teknisk, är bättre än enzymatisk matsmältning (såsom dispas eller kollagenas) på grund av minskad skada och den specifika storleken (50-100 pm i diameter) vid förvärv. Vidare kan mekanisk matsmältning manuellt kassera matarcellerna, vilket kommer att undertrycka hiPSC-differentieringen. HiPSCs skiljer sig spontant för att bilda EBs, vilka karaktäriseras som de tredimensionella, multicellulära aggregaten med släta gränser. Flera EB kan kluster ihop för att bilda oregelbundna former. För att upprätthålla EB i goda förhållanden odlas mindre än 100 EBs i en 100 mm icke-vidhäftande petriskål med 10 ml EB-formationsmedium. Omkring 50 EB i en 100 mm maträtt anses vara den bästa koncentrationen. EBs utsädes sedan på Till 10 cm, gelatinbelagda rätter med basal odlingsmedium. Tätheten av fördelningen av EB är viktig för den tillräckliga utväxten av EB. Mindre än 100 EBs odlas på en 100 mm maträtt. Inom 10 dagar efter kulturen växer fibroblastiska celler gradvis ut och expanderas från EBs. Monolagsteget utförs för att utesluta återstående, odifferentierade celler närvarande i EB: erna, såväl som att expandera celler som är förbundna med mesenkymstammen. 0,5-1 x 106 celler är sådda i en 100 mm skål för monoskiktcellodling. Expressionen av cellytmarkörer på hiPSC-F analyserades genom flödescytometrisk analys i vår tidigare studie 5 . Resultaten visade att majoriteten av hiPSC-F uttryckte CD73 (81,81 ± 2,05%) och CD105 (endoglin, 81,90 ± 1,61%), vilka är kända för att vara de positiva humana mesenkymmarkörerna. Dessutom har sex olika iPSCs och en mänsklig embryonal stamcell (ESC) använts för att reproducera dessa metoder.

Ve_content "> Den inducerade kondrogena differentieringen av pluripotenta celler är också en komplex nyckelprocess. Med tanke på detta användes klassiskt kondrogeniskt medium för induktion av kondrogenes från hiPSCs. TGF-beta1 och dexametason kompletteras i pellets kulturmedium. Har visats ha ett signifikant inflytande på kondrogena potentiella förmågor 14. En annan skillnad än andra protokoll var koncentrationen av 10% ITS, vilket är mycket högre än den typiskt rapporterade 1% ITS 15 , 16, 1% ITS plus 10% FBS förbättrad Bruskbildning i andra metoder 17 , 18. ITS som ett serumutbyte kan främja kondrocytproliferation och bildning och behålla de kondrogena fenotyperna. För att ersätta djurkomponenterna hos FBS uppgraderade vi koncentrationen av ITS till 10%, vilket har bevisats Att effektivt promoTe kondrocyt differentiering 7 .

En celldensitet med hög densitet är en annan viktig faktor för kondrogenisk differentiering. Det finns många andra cellodlingsmetoder som kan användas för att inducera kondrogenisk differentiering, såsom mikromasskultur, samkultur med andra celler, biomaterialbaserad kultur och genetisk manipulation 1 , 19 , 15 . 3D-pelletskulturen i vår studie, vilket resulterar i högcellstäthet och hög cellcellsinteraktion, är lättare att utföra utan andra celler eller material. Eftersom det utförs i 15 ml centrifugrör, är en begränsning att den endast kan användas i en liten skala av kondrogenisk differentieringsanalys. Dock kan plattor med 96 brunnar med runda botten användas som ett lovande alternativ 7 . Därför kan annan förbättring av odlingsmetoderna främja effektiviteten av kondrogenaDifferentiering in vitro . I vår studie genomfördes den kondrogena induktionen så länge som 21 dagar under serumfritt och xenofrisamt tillstånd, under vilket alla djurrelaterade komponenter avlägsnades. Därför är förfarandet i vår studie anpassningsbart för framtida kliniska tillämpningar.

Man tror att autologa stamceller skulle vara det perfekta valet för broskreparation, eftersom de inte bara kan minska avstötningen utan också uppnå vävnadsregenerering genom att utnyttja den naturliga utvecklingen av embryonal utveckling 20 , 21 . De befanns dock ha begränsad proliferativ potential in vitro 22 . Därför kan en integrationsfri metod för att generera kondrocyter från PBC via iPSCs vara ett mer lovande tillvägagångssätt för broskvävsteknik. Med vår metod kan 2 ml blod vara tillräckligt för att inducera patientspecifika kondrocyter som behövs för bruskdefektts. Dessutom använde vi också hMSCs som en positiv kontroll för att jämföra med celler differentierade från iPSCs, vilket föreslog att iPSCs har goda kondrogena differentieringspotentialer.

Sammanfattningsvis visade denna studie att PBC kan användas som kandidater för kondrocytregenerering. Detta skulle vidare kunna återspegla en framtida riktning för att generera fröceller för broskreparation i ett patientspecifikt och kostnadseffektivt förhållningssätt till regenerativ medicin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Xiaobin Zhang för sin plasmid. Vi tackar också Shaorong Gao och Qianfei Wang för deras vänliga hjälp under experimentet. Denna studie stöds av National Natural Science Foundation of China (No.81101346, 81271963, 81100331), Peking 215 högtalareprojekt (nr.2014-3-025) och Peking Chao-Yang sjukhusfonden (nr . CYXX-2017-01) och Youth Innovation Promotion Association av kinesiska vetenskapsakademin (YL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Knockout DMEM Invitrogen 10829018 Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium
Knockout Serum Replacement (KSR) Invitrogen 10828028 A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone sh30070.03 Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture
Nonessential amino acids Chemicon TMS-001-C Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability
L-glutamine Invitrogen TMS-002-C An amino acid required for cell culture
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Peprotech 100-18B A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs
Dispase Invitrogen 17105041 Used for hiPSC dissociation for subculture
DMEM Gibco C11960 Basal medium used for MSC culture medium
0.1% gelatin Millipore ES-006-B Used for cell attachment onto the dishes
0.25% trypsin/EDTA Gibco 25200072 Used for cell dissociation
DPBS Gibco 14190250 A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing
2-mercaptoethanol invitrogen 21985023 Used as a growth supplement in all the cell culture medium.
ITS invitrogen 41400045 Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation.
Ascorbic acid Sigma 4403 Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property.
Sodium pyruvate Gibco 11360070 Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose.
Transforming growth factor-beta 1 Peprotech AF-100-21C A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation.
Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II Abcam ab34712 This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues.
Mouse monoclonal antibodies to Collagen X Abcam ab49945 This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes.
Permount Fisher Scientific SP15-100 For mounting and long-term storage of slides
Toluidine blue Sigma 89640 Used for proteoglycans detection.
Alcian blue Amresco #0298 Used for glucosaminoglycans detection.
Papain Sigma P4762-25MG Used to digest chondrogenic pellets.
Dimethylmethylene blue Sigma 341088-1G Used to quantitate glycosaminoglyans
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage Sigma C4384-250MG Used to draw the standard curve for sGAG content measurement.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851 (100) Used to determine DNA content
TRIzol Invitrogen 15596018 Used for RNA isolation from cells
Reverse Transcriptase System Promega A3500 Used to convert RNA into cDNA
SYBR FAST qPCR kit Master Mix Kapa KK4601 Used for Real-time PCR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  2. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  3. Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
  4. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
  5. Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
  6. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
  7. Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
  8. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  9. Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5'-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
  10. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  11. Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
  12. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
  13. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
  14. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  15. Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
  16. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
  17. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  18. Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
  19. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  20. Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
  21. Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).

Tags

Utvecklingsbiologi utgåva 125 inducerade pluripotenta stamceller perifert blod differentiering embryoidkropp fibroblastiska celler kondrocyt
Differentierande kondrocyter från perifert blod härledda humana inducerade plöripotenta stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Hai, Y., Chen, J., Liu, T.… More

Li, Y., Hai, Y., Chen, J., Liu, T. Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (125), e55722, doi:10.3791/55722 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter