Summary
Wij presenteren een protocol voor het genereren van een chondrogeen afkomst van menselijk perifere bloed (PB) via geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) met behulp van een integratievrije methode, waaronder embryoïde lichaamsvorming (EB), uitbreiding van fibroblastische cellen en chondrogeeninductie.
Abstract
In deze studie hebben we perifere bloedcellen (PBC's) als zaadcellen gebruikt om chondrocyten te produceren via geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in een integratievrije methode. Na de vorming van embryoïde lichaam (EB) en fibroblastische celuitbreiding worden de iPSC's geïnduceerd voor chondrogeen differentiatie gedurende 21 dagen onder serumvrije en xeno-vrije condities. Na chondrocytische inductie worden de fenotypes van de cellen geëvalueerd door morfologische, immunohistochemische en biochemische analyses, evenals door het kwantitatieve real-time PCR onderzoek van chondrogeen differentiatie markers. De chondrogeenpellets tonen positieve alcianblauw en toluidine blauwkleuring. De immunohistochemie van collageen II en X-kleuring is ook positief. Het gesulfateerde glycosaminoglycan (sGAG) gehalte en de chondrogeen differentiatie merkers COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 en AGGRECAN worden significant in de chronisch gereguleerdRogenic pellets vergeleken met hiPSCs en fibroblastische cellen. Deze resultaten suggereren dat PBC's kunnen worden gebruikt als zaadcellen om iPSC's te genereren voor kraakbeenherstel, dat is patiëntspecifiek en kosteneffectief.
Introduction
Kraakbeenweefsel heeft een zeer slechte capaciteit voor zelfherstel en regeneratie. Diverse chirurgische interventies en biologische behandelingen worden gebruikt om kraakbeen- en gewrichtsfunctie te herstellen, met onbevredigende resultaten. De recente ontwikkeling van stamceltechnologie kan het hele kraakbeenherstelveld 1 veranderen . Verschillende stamcellen zijn als zaadcellen bestudeerd, maar door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) lijken de meest veelbelovende keuzes te zijn, omdat ze vele soorten patiëntenpecifieke cellen kunnen leveren zonder afwijzingsreacties te veroorzaken 2 . Bovendien kunnen ze de beperkte proliferatieve aard van volwassen cellen overwinnen en hun zelfvernieuwende en pluripotente vaardigheden handhaven. Bovendien kan gen targeting gebruikt worden om het genotype te veranderen om specifieke soorten chondrocyten te verkrijgen.
Fibroblasten zijn veel gebruikt om iPSCs te genereren, omdat hun herprogrammeringspotenties ook goed bestudeerd zijn.Er zijn echter nog enkele beperkingen die moeten worden overwonnen, zoals de pijnlijke biopsie van patiënten en de noodzaak voor de in vitro- uitbreiding van de fibroblasten, die kan leiden tot genmutaties 3 . Onlangs bleken PBC's voordelig te zijn voor herprogrammering 4 ; Bovendien werden ze veelal gebruikt en overvloedig opgeslagen. Het is mogelijk dat ze de studiefocus van de huid kunnen doorsturen. Naar ons beste weten, zijn er maar weinig rapporten over PBC-herprogrammering gevolgd door differentiatie in chondrocyten.
In de huidige studie gebruiken we PBC's als een alternatieve bron door ze in iPSCs te programmeren en vervolgens de iPSC's te differentiëren in de chondrogene lijn door middel van een pelletcultuur systeem om chondrocytevorming na te bootsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol voor het genereren van hiPSC's van PBC's is te vinden in onze vorige studie 5 . De studie is goedgekeurd door de Institutional Review Board van onze instelling.
1. Embryoid Body (EB) Formation
- Maak 50 ml hiPSC-medium: Knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 15% knock-out serumvervanging (KSR), 5% foetaal bees serum (FBS), 1 x niet-essentiële aminozuren, 55 μM 2-mercaptoethanol, 2 mM L -glutamine, en 8 ng / ml basis fibroblast groeifactor (bFGF).
- Maak 50 ml EB formatiemedium: DMEM aangevuld met 15% KSR, 5% FBS, 1x nonessential aminozuren, 55 μM 2-mercaptoethanol en 2 mM L-glutamine.
- Maak 50 ml basaal cultuurmedium: DMEM aangevuld met 20% FBS, 1 x niet-essentiële aminozuren, 55 μM 2-mercaptoethanol en 2 mM L-glutamine.
- Bereid 10 ml dispasoplossing, 1 mg / ml in knockout DMEM op.
- CultuRe hiPSCs op 60 mm weefselkweekschotels met voedercellen ( dwz een monolaag van bestraalde muis embryonale fibroblastcellen). Wanneer de cellen 80-90% samenvloeien, verwijder de cellen met dispase en verplaats de hiPSCs 1: 3 om de 4-5 dagen. Plaats de cellen in een 37 ° C en 5% CO2 incubator.
- Dissect de ongedifferentieerde hiPSC kolonies in kleinere stukken (ongeveer 50-100 μm in diameter) met een vuurgetrokken glazen naald wanneer de iPSCs 80-90% samenvloeien. Gebruik in het algemeen hiPSC kolonies in een 60 mm schotel om EB's te genereren in een 100 mm Petri schotel.
- Cultuur minder dan 100 kleine kolonies in een 100 mm non-adherent Petri schotel met 10 ml EB formatiemedium. Plaats de afwas in een 37 ° C en 5% CO 2- broeikas.
- Vervang ongeveer 25% van het initiële medium met een gelijke hoeveelheid van het basale kweekmedium om de 2 dagen. Kantel de schotel om de EB te laten vallen. Verwijder voorzichtig 3 mlVan het bovenste medium en voeg 4 ml vers basaal cultuurmedium toe. Verstoor de EB's niet.
OPMERKING: De EB's worden morfologisch gekenmerkt door de kolonies, waarbij ze een ronde verschijning hebben met gladde randen onder de microscoop. - Na 10 dagen kweek in de non-adherent Petri-schotel, bedek een nieuwe 100 mm weefselkweekschotel met 4 ml 0,1% gelatine gedurende 30 minuten bij 37 ° C voor gebruik.
- Breng het medium plus EB's van een 100 mm non-adherent Petri-schotel over op een 15 ml kegelbuis. Laat het EB-sediment voor 4-5 min. Aspirateer de supernatant zorgvuldig en laat minder dan 0,5 ml medium plus EB's
- Zaai minder dan 100 EB's op een 100 mm gelatine-gecoate weefselkweekschotel met 10 ml basaal kweekmedium. Plaats de afwas in een 37 ° C en 5% CO 2- broeikas.
2. Cell Pellet Formation en Chondrocyten Differentiatie
- Maak 10 ml 0,25% trypsine / ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). Maak 80 ml basAl cultuurmedium: DMEM aangevuld met 20% FBS, 1x nonessential aminozuren, 55 uM 2-mercaptoethanol en 2 mM L-glutamine.
- Maak 10 ml chondrogeen differentiatie medium: DMEM (hoge glucose) aangevuld met 10% insuline-transferrine-selenium oplossing (ITS), 0,1 μM dexamethason, 1 mM ascorbinezuur, 1% natriumpyruvaat en 10 ng / ml transformerende groeifactor- Bèta 1 (TGF-β1).
- Vernieuw het medium met 10 ml basaal kweekmedium na 48 uur. Vervolgens vernieuw het medium om de drie dagen met 10 ml basaal cultuurmedium.
OPMERKING: Na 10 dagen in de cultuur zouden fibroblastische celuitgroeiingen uit de EB's moeten zijn uitgebreid.- Bedek de 100 mm schoteltjes met 4 ml 0,1% gelatine gedurende 30 minuten bij 37 ° C voor gebruik. Gooi de celsupernatant weg en doe de cellen eens met Dulbecco's Fosfaatbufferde Saline (DPBS).
- Digest de cellen met 3 ml 0,25% trypsine / EDTA bij 37 ° C gedurende 5 minuten en neutraliseer met 4 mL van basaal cultuurmedium.
- Dissocieer de cellen in enkele cellen door de 5-10 keer op en neer te pipetteren en ze door een 70 μm nylon gaas te passeren. Centrifugeer de cel suspensie bij 200 xg gedurende 5 minuten. Zet de cellen opnieuw op een nieuwe 100 mm gelatine-gecoate weefselkweekschotel met 10 ml basaal cultuurmedium.
- Vernieuw het medium met 10 ml basaal kweekmedium na 48 uur. Vervolgens vernieuw het medium om de drie dagen met 10 ml basaal cultuurmedium.
OPMERKING: De cellen verwerven een homogene, fibroblast-achtige morfologie. - Wanneer ~ 90-100% samenvloeiing bereikt wordt ( dwz ongeveer 5-7 dagen), oogst de cellen gedurende 5 minuten met 3 ml 0,25% trypsine / EDTA bij 37 ° C. Neutraliseer met 4 ml basaal cultuurmedium. Dissocieer de cellen in enkele cellen door 5 keer op en neer te pipetteren. Gebruik een hemocytometer om het celnummer te tellen.
- Plaats 3 x 10 5 cellen in een 15 ml polypropyleenbuis. Centrifuge bij 200 xgGedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). De cellen opnieuw opschorten in 1 ml chondrogeen differentiatie medium.
- Hercentrifugeer de cellen bij 300 xg gedurende 3 minuten en houd de cellen in kleine pelletvorm. Zet de buis gedurende 21 dagen in de 37 ° C en 5% CO 2 incubator. Schroef het deksel niet stevig vast en laat het gas uitwisselen.
- Vervang 3/4 van het kweekmedium om de drie dagen met vers chondrogeen differentiatie medium.
OPMERKING: Na 21 dagen in de cultuur zouden hiPSC-chondrogeenpellets (hiPSC-Chon) moeten zijn gevormd. Menselijke mesenchymale stamcellen (MSC's) worden als positieve controle verzameld en gekweekt in het chondrogeen differentiatiemedium gedurende 21 dagen om chondrogeenpellets (hMSC-Chon) te vormen.
3. Analyse van Chondrogeen Differentiatie
- Bereid 10 ml 10% neutrale gebufferde formaline op.
- Bereid 50 ml 0,1% alcianblaag reagens en 50 ml 1% toluidine blauw reagens op.
- PrEpare 1 ml van de primaire antilichamen: konijn polyclonale antilichamen tegen collageen II (1:50) of monoklonale monoklonale antilichamen tegen collageen X (1:50). Bereid ook anti-konijnen of muis secundaire antilichamen op.
- Maak 1 ml papainoplossing: 10 U / ml in PBS met 0,1 M natriumacetaat, 2,4 mM EDTA en 5 mM L-cysteïne.
- Maak 100 ml dimethylmethyleenblauw (DMMB) kleurstofoplossing: 100 μl 16 mg / L 1,9-dimethylmethylenblauw, 40 mM glycine, 40 mM NaCl en 9,5 mM HCI; PH 3,0.
- Bepaal chondrogene differentiatie door alcia blue en toluidine blauwe vlekken van de pelletsecties.
- Fixeer een hiPSC-Chon pellet of hMSC-Chon pellet in 1 ml 10% neutrale gebufferde formaline gedurende 24 uur.
- Breng de pellet 1 ml 70% ethanol in H2O Dehydrateer het pellet met 1 ml van een gegradeerde ethanolreeks (dat wil zeggen, 25, 50, 75, 90, 95, 100 en 100%, 3 min ieder).
- Verduidelijkt de pellet in 1 ml 100% xyleen drie keer. infiltratE de pellet met paraffine gedurende 1 uur in een 65 ° C oven. Breng de pellet in de paraffineblokken met een 7 x 7 x 5 mm 3 basisvorm na de routine histologische procedures 6 .
- Maak aangrenzende delen door microtome met een dikte van ongeveer 4 μm 7 . Houd de secties op glazen glijbanen vast.
- Droog de glijbanen gedurende 2 uur bij 60 ° C in een oven. Deparaffinize de secties in drie cycli (3 minuten elk) met 100% xyleen.
- Gebruik een afnemende alcoholreeks voor rehydratie ( dwz 100, 100, 95, 95, 70, 50 en 25% in H 2 O, 3 min elk) en voer dan 5 minuten spoelen met gedeïoniseerd water.
- Vlek de secties met 0,1% alcianblauw reagens of 1% toluidine blauwkleuren gedurende 4-5 uur en spoel ze vervolgens met gedestilleerd water.
- Dehydrateer met een gegradeerde ethanol serie ( dwz 25, 50, 75, 90, 95, 100 en 100%, 3 minuten elk) gevolgd door drie opeenvolgende stEps van verduidelijking in 100% xyleen. Monteer de dia's en visualiseer ze onder een microscoop.
- Doe immunohistochemie.
OPMERKING: Extra pelletsecties worden verder beoordeeld door immunohistochemie.- Na de deparaffinisatie en rehydratie, breng de glijbanen in 1 mM EDTA, pH 8,0 (waterdicht in water gekookt door autoclaaf). Laat ze 8 minuten bij een onderkooktemperatuur zitten en laat de dia's bij RT afkoelen.
- Spoel de glijbanen 3 keer met gedeïoniseerd water af. Incubeer de secties 3% H 2O 2-oplossing in methanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min om endogene peroxidase activiteit te blokkeren.
- Spoel de glijbanen met gedeïoniseerd water en laat ze 5 minuten in DPBS dompelen. Voeg 50-100 μl van geschikt verdund (1:50) primair antilichaam toe aan de afdelingen op de glijbanen en incubeer deze vervolgens gedurende een uur in een bevochtigde kamer bij RT.
- Was de dia's 3 keer (5 min elk) met DPBS. Incubeer de saMples met de bijbehorende secundaire antilichamen ( dwz anti-konijn of muis) gedurende 15 min bij RT.
- Was de dia's 3 keer (voor 5 minuten elk) met DPBS. Voer DAB detectie onder een microscoop uit.
- Was de dia's met DPBS 3 keer (2 min elk). Contrasteer de celkernen door de dia's in hematoxyline gedurende 1-2 minuten te dompelen. Dehydreren met een gegradeerde ethanol serie (25, 50, 75, 90, 95, 100 en 100%; 3 minuten elk) gevolgd door drie opeenvolgende stappen van verduidelijking met xyleen. Tenslotte, monteer de dia's en visualiseer ze onder de microscoop.
- Ontdek sGAG-inhoud.
- Digg chondrogeenpellets in papainoplossing bij 60 ° C gedurende 2 uur.
- Bepaal het DNA-gehalte met behulp van de dsDNA assay kit en fluorometer systeem. Meet de sGAG-inhoud door het te mengen met DMMB-kleurstofoplossing bij het meten van absorptie bij 525 nm 8 .
- Bereken de concentratie van sGAG tegen een standaardkromme vanHaai chondroitine sulfate.
- Voer de real-time PCR analyse van de chondrogeen differentiatie markers in hiPSC-Chon pellets uit.
- Oogst 3-4 van dezelfde chondrogeenpellets door 500 μL ijskoud extractie reagens toe te voegen aan één buis. Vortex grondig. Incubeer het monster gedurende 5 minuten bij RT.
- Voeg 0,1 ml chloroform toe. Vortex het monster gedurende 15 s en incubeer het bij 3 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 12.000 xg en 4 ° C. Breng de bovenste waterfase (ongeveer 250 μl) over in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg 25 μl natriumacetaat en 1 μl glycogeen toe aan het monster. Precipiteer het RNA door hem te mengen met 250 μl isopropylalcohol. Meng grondig. Incubeer het monster bij RT gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 xg en 4 ° C. Verwijder de supernatant volledig. Was de RNA-pellet tweemaal met 500 μl 75% ethanol.
- Centrifuge gedurende 5 minutenBij 7.500 xg en 4 ° C. Verwijder alle resterende ethanol en laat de RNA-pellet 5-10 minuten drogen. Los het RNA op in 10 μL nuclease-vrij water.
- Zet het RNA om in cDNA met behulp van een reverse transcriptase systeem. Onderwerp de cDNA-monsters in real-time PCR met behulp van qPCR kit master mix (2x) en een real-time PCR systeem 9 .
OPMERKING: De primer sequenties zijn:
H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
H ß-ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
H -ACTIN- R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
H SOX9 -F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chondrogen Differentiatie van hiPSCs:
EB formatiemedium en basaal cultuurmedium werden gebruikt om de hiPSC's te differentiëren in de mesenchymale afstamming. Een multi-step cultuur methode werd gebruikt ( Figuur 1 ). Ten eerste werden de hiPSC's spontaan gedifferentieerd via EB-vorming gedurende 10 dagen (D10; Figuur 2A ). Ten tweede kwamen cellen nog 10 dagen uit de EB's uit (D10 + 10). Tijdens deze twee stappen verloren de iPSC's hun oorspronkelijke morfologieën en verkregen spindelvormige morfologieën ( Figuur 2B ), die vervolgens na een doorgang naar een fibroblastische vorm veranderd werden. Ten derde werden cellen in monolaag na subcultuur uitgebreid ( Figuur 2C ). Resterende ongedifferentieerde cellen werden tijdens deze stap uitgesloten. Vervolgens werden de cellen uitgebreid en toegewijd aan fibroblast-achtige cellen na5-7 dagen in monolayer cultuur (D10 + 10 + 7). Ten vierde, wanneer de hiPSC-fibroblastachtige cellen (hiPSC-F) ongeveer 90% samenvloeiing bereiken, werden ze geïnduceerd om te differentiëren in chondrocyten via een 3D-pelletkweek ( Figuur 2D ) 10 .
Karakterisering van hiPSC-Chon Pellets:
HiPSC-F werden gekweekt in 15 ml polypropyleenbuizen in pellet gedurende 21 dagen. Chondrogeencellen kunnen in vitro assembleren en een karakteristieke extracellulaire matrix produceren wanneer ze in een hoge dichtheidscultuur worden gebruikt. Aan het eind van de cultuur konden we een dicht, kraakbeenachtig aggregaat zien, de hiPSC-Chon-pellet, die tot 2-3 mm lang en 3 mm dik was ( Figuur 2D ). De cellen waren positief voor alcianblauw ( Figuur 3A ) en toluidineblauw ( Figuur 3B ) kleuring, wat de successfout aangeeftUl chondrogenic differentiatie van hiPSC pellets. Immunohistochemie analyse voor collageen II ( Figuur 3C ) en collageen X ( Figuur 3D ) bleek verder dat de hiPSC-Chon pellets een chondrocyt-achtig fenotype ontwikkelden. Negatieve controles van immunohistochemie voor collageen II en collageen X werden uitgevoerd om de positieve kleuring beter te bewijzen (gegevens niet getoond) 5 .
SGAG analyse werd ook uitgevoerd na chondrogeen differentiatie ( Figuur 3E ). SGAG-inhoud werd gedetecteerd in hiPSC-Chon pellets, hiPSC-F, EBs en de ongedifferentieerde hiPSCs. De inhoud van sGAG werd significant verbeterd in hiPSC-Chon pellets dan in de andere groepen ( P <0,05). Bij de positieve controle van hMSC-Chon werd de sGAG-inhoud ook aanzienlijk verhoogd ( P <0,05) in vergelijking met hMSCs. Echter, de sGAG inhoudTussen hMSC pellets en hiPSC-Chon pellets bleek geen verschil ( P > 0,05).
Gene Expressie van Chondrogen Differentiatie Markers:
Gene-expressie van de differentieringsmarkers voor de chondro-progenitor lineage ( SOX9 en COL2 ) en volledig gedifferentieerde chondrocyten ( AGGRECAN en COL10 ) werden gebruikt om het fenotype van de chondrogeenpellets te karakteriseren ( Figuur 4 ). In vergelijkingen tussen hiPSCs, hiPSC-F en hiPSC-Chon pellets werden expressies van COL2 , COL10 , SOX9 en AGGRECAN significant verhoogd in hiPSC-Chon dan in de andere groepen ( P <0,05). Bij de positieve controle van hMSC-Chon werd de expressie van deze markers ook aanzienlijk verbeterd dan in hMSC's ( P <0,05). Echter, de genuitdrukking tussen hMSC pellets en hiPSC-Chon pellets aangetoond geen verschillen ( P > 0,05). Al deze resultaten suggereren een succesvol chondrogeen differentiatie proces van menselijke iPSCs.
Figuur 1: Schematisch overzicht van het protocol. Een multi-step cultuurmethode gebruikt om menselijke iPSC's in chondrocyten te onderscheiden, waaronder : 1) spontane differentiatie via EB-vorming, 2) celuitgroei van EB's, 3) monolaagcelcultuur na subcultuur en 4) 3D-pelletkweek. Het chondrocytfenotype wordt beoordeeld door histologische analyse, biochemische analyse en chondrogeen genuitdrukking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Generatie van chondrocyten uit hiPSCs. ( A ) EB-vorming op D10. Schaalbalk = 100 μm. ( B ) Celluitgroei van EB's op D10 + 10. Schaalbalk = 100 μm. ( C ) Monolaagcelcultuur op D10 + 10 + 7. Schaalbalk = 100 μm. ( D ) 3D-pelletkweek. Dit cijfer is gewijzigd uit onze vorige studie 5 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van hiPSC-Chon Pellets. ( A ) Alcian blauwkleuren en ( B ) toluidineblauwvlek van glycosaminoglycanen en proteoglycanen. Schaalbalk = 100 μm. ( C en D ) Immunohistochemie voor collageen II en collageen X. Schaalbalk = 100 μm. ( E ) Biochemische karakterisering van hiPSC-Chon pellets versus hiPSCs, EBs en hiPSC-F vergeleken met hMSC-Chon versus hMSCs. SGAG per DNA. De balk vertegenwoordigt de gemiddelde ± SEM. N = 3, * P <0,05. Dit cijfer is gewijzigd uit onze vorige studie 5 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gene Expressie Analyse. RT-qPCR genexpressie analyse van chondrogeen differentiatie markers ( COL2 , COL10 , SOX9 en AGGRECAN ) in hiPSC-Chon versus hiPSCs en hiPSCF vergeleken met hMSC-Chon versus hMSCs. De balk vertegenwoordigt de gemiddelde ± SEM. N = 3, * P <0,05. Dit cijfer is gewijzigd uit onze vorige studie 5 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier leveren we een protocol om chondrocyten van PBC's te genereren via iPSCs. Omdat PBC's meer voorkomend zijn en veel gebruikt worden op het klinisch gebied, worden ze gepresenteerd als een mogelijk alternatief voor herprogrammering. In deze studie werden episomale vectoren (EV) gebruikt om PBC's in iPSC's te herprogrammeren, volgens de methode die door Zhang et al werd vastgesteld. 11 . Deze integratievrije aanpak houdt in dat er geen virusgeassocieerde genotoxiciteit bestaat, die een breed effect heeft op het klinisch gebied 12 , 13 . De herprogrammeringsefficiëntie van het genereren van integratievrije iPSC's uit bloedcellen in deze studie was tevreden. Meer dan 30 iPSC's kunnen geproduceerd worden uit 2 ml perifeer bloed. Daarom hebben PBC's de mogelijkheid om de zaadcellen die worden gebruikt om iPSC's te genereren voor kraakbeentechniek en andere klinische toepassingen, te kunnen gebruiken.
De belangrijkste stappen van chondrogeen verschillenNtiation van hiPSCs opgenomen: EB-vorming, celuitgroei van EB's, monolaagse cultuur en 3D-pelletkweek. Niet-gedifferentieerde hiPSC kolonies worden in kleinere stukken gedissend met behulp van een met vuur getrokken glazen naald. De mechanische methode, hoewel technischer, is beter dan enzymatische spijsvertering (zoals dispase of collagenase) door de verminderde schade en de specifieke grootte (50 - 100 μm in diameter) bij de overname. Bovendien kan mechanische vertering handmatig de voedercellen verwijderen, die de hiPSC-differentiatie onderdrukken. HiPSCs onderscheiden zich spontaan om EB's te vormen, die gekenmerkt worden als de driedimensionale, multi-cellulaire aggregaten met gladde grenzen. Verschillende EB's kunnen samen clusteren om onregelmatige vormen te vormen. Om de EB's onder goede condities te onderhouden, worden minder dan 100 EB's gekweekt in een 100 mm non-adherent Petri schotel, met 10 ml EB formatiemedium. Ongeveer 50 EB's in één 100 mm schotel wordt beschouwd als de beste concentratie. EB's worden dan gezaaid Tot 10 cm, gelatine-gecoate gerechten met basaal kweekmedium. De dichtheid van de verdeling van EB's is belangrijk voor de voldoende uitgroei van EB's. Minder dan 100 EB's worden gekweekt op een 100 mm schotel. Binnen 10 dagen na de cultuur worden fibroblastische cellen geleidelijk uitgegroeid en uit de EB's uitgebreid. De monolaagstap wordt uitgevoerd om resterende niet-gedifferentieerde cellen die aanwezig zijn in de EB's te uitsluiten, evenals cellen die zijn toegewijd aan de mesenchymale afstamming uit te breiden. 0,5-1 x 10 6 cellen worden gezaaid in een 100 mm schaal van monolaag celcultuur. De expressie van celoppervlakmarkers op hiPSC-F werden geanalyseerd door middel van flowcytometrische analyse in onze vorige studie 5 . De resultaten toonden aan dat de meerderheid van hiPSC-F CD73 (81,81 ± 2,05%) en CD105 (endoglin, 81,90 ± 1,61%) uitsteekte, die bekend staan als de positieve humane mesenchymale markers. Bovendien zijn zes verschillende iPSC's en één menselijke embryonale stamcel (ESC) gebruikt om deze methoden te reproduceren.
Ve_content "> De geïnduceerde chondrogene differentiatie van pluripotente cellen is ook een complex sleutelproces. In dit verband werd klassiek chondrogeen medium gebruikt voor de inductie van chondrogenese uit hiPSCs. TGF-beta1 en dexamethason worden aangevuld in het pelletkweekmedium. Is aangetoond dat ze een significante invloed op chondrogeenpotentiaal hebben 14. Een ander verschil dan andere protocollen was de concentratie van 10% ITS, wat veel hoger is dan de typisch gerapporteerde 1% ITS 15 , 16. 1% ITS plus 10% FBS verbeterd Kraakbeenvorming in andere methoden 17 , 18. ITS als serum substitutie kan chondrocyt proliferatie en vorming bevorderen en de chondrogeen fenotypen behouden. Om de diercomponenten van FBS te vervangen, hebben we de concentratie van ITS tot 10% verbeterd, die is bewezen Efficiënt promoTe chondrocyt differentiatie 7 .Een celcultuur met hoge dichtheid is een andere essentiële factor voor chondrogeen differentiatie. Er zijn veel andere celcultuurmethoden die kunnen worden gebruikt om chondrogeen differentiatie te induceren, zoals micromass cultuur, co-cultuur met andere cellen, biomaterial-gebaseerde cultuur en genetische manipulatie 1 , 19 , 15 . De 3D-pelletkweek in onze studie, die resulteert in een hoge celdichtheid en een hoge cel-celinteractie, is makkelijker zonder andere cellen of materialen te verrichten. Aangezien het in de 15 ml centrifugebuizen wordt uitgevoerd, is één beperking dat het alleen kan worden gebruikt in een kleinschalige chondrogene differentiatiebepaling. 96-putjes met ronde bodems kunnen echter als veelbelovend alternatief gebruikt worden 7 . Daarom kan andere verbetering van de kweekmethoden de efficiëntie van chondrogeen bevorderenDifferentiatie in vitro . In onze studie werd de chondrogeeninductie gedurende 21 dagen gedaan onder serumvrije en xeno-vrije conditie waarbij alle diergerelateerde componenten werden verwijderd. Daarom is de procedure in onze studie aangepast voor toekomstige klinische toepassingen.
Er wordt aangenomen dat autologe stamcellen de ideale keuze zouden zijn voor kraakbeenherstel, omdat ze niet alleen afwijzing kunnen verminderen, maar ook weefselregeneratie kunnen bereiken door gebruik te maken van de natuurlijke gang van embryonale ontwikkeling 20 , 21 . Zij bleken echter in vitro te beschikken over een beperkte proliferatiepotentieel 22 . Daarom kan een integratievrije methode voor het genereren van chondrocyten van PBC's via iPSC's een meerbelovende aanpak zijn voor kraakbeenweefselingenieurswese. Met onze methode kan 2 ml bloed voldoende zijn om de patiëntspecifieke chondrocyten die nodig zijn voor kraakbeendefecten inducerents. Bovendien hebben we ook hMSC's gebruikt als een positieve controle om te vergelijken met cellen die afkomstig zijn van iPSCs, wat voorstelde dat iPSCs goede chondrogeen differentiatiepotentia hebben.
Ten slotte bleek dat deze studie bleek dat PBC's kunnen worden gebruikt als kandidaten voor chondrocytegeneratie. Dit zou een toekomstige richting kunnen weerspiegelen om zaadcellen voor kraakbehandeling te genereren in een patiëntspecifieke en kosteneffectieve benadering van regeneratieve geneeskunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Xiaobin Zhang bedanken voor zijn plasmide. We bedanken ook Shaorong Gao en Qianfei Wang voor hun vriendelijke hulp tijdens het experiment. Deze studie wordt ondersteund door de Nationale Natuurwetenschappenstichting van China (nr.81101346, 81271963, 81100331), het Beijing 215 hoogwaardige talentproject (nr.2014-3-025) en het Beijing Chao-Yang Hospital Fund (nr. . CYXX-2017-01) en de Youth Innovation Promotion Association van de Chinese Academie voor Wetenschappen (YL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | TMS-002-C | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| 2-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
References
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
- Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
- Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5'-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
- Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
