Summary
La capacità di rilevare con precisione le trascrizioni o proteine nei tessuti della drosofila è fondamentale per lo studio della loro abbondanza e localizzazione relazionati al processo di sviluppo. Ecco la descrizione di una procedura semplice per dissecare pupale ali. Queste ali possono essere utilizzate come campioni in diverse tecniche (immunohistochemistry, analisi di PCR, ecc.).
Abstract
Lo sviluppo dell'ala in Drosophila melanogaster è un modello ideale per studiare la morfogenesi a livello del tessuto. Queste appendici si sviluppano da un gruppo di cellule che si chiamano dischi immaginali ala formate durante lo sviluppo embrionale. In stadi larvali si sviluppano i dischi immaginali, aumentando il numero delle cellule e formando strutture epiteliali monostrati. All'interno del caso pupal, i dischi immaginali bud fuori e piegare in doppii strati lungo una linea che diventa il futuro margine dell'ala. Durante questo processo, le vene longitudinali primodia provengono vena cellule sulle superfici dorsali e ventrali prospettica dell'ala. Durante la fase di pupa le strisce delle cellule della vena di ogni superficie comunicano al fine di generare tubi stretti; allo stesso tempo, la croce-vene iniziano la loro formazione.
Con l'aiuto di marcatori molecolari appropriati, è possibile identificare gli elementi principali che compongono l'ala durante il suo sviluppo. Per questo motivo, la capacità di rilevare con precisione le trascrizioni o proteine in questa struttura è fondamentale per lo studio della loro abbondanza e localizzazione relazionati al processo di sviluppo dell'ala.
La procedura qui descritta si concentra sulla manipolazione pupale Ali, fornendo istruzioni dettagliate su come sezionare l'ala durante la fase di pupa. La dissezione del tessuto pupal è più difficile da eseguire rispetto alle loro controparti in terzo instar larve. Ecco perché questo approccio è stato sviluppato, per ottenere campioni di alta qualità rapido ed efficiente. Dettagli di come immunostain e Monte questi esempi di ala, per consentire la visualizzazione delle proteine o dei componenti delle cellule, vengono forniti nel protocollo. Con poca esperienza è possibile raccogliere Ali pupal di alta qualità di 8-10 in un breve lasso di tempo.
Introduction
Ali di Drosophila sono sviluppate dai dischi immaginali ala. La primordiale di questi dischi ala vengono messe da parte durante lo sviluppo embrionale come piccoli gruppi di 20-30 cellule immaginale che invaginano dall'epitelio embrionale. Mentre la larva cresce alla terza fase instar, mitosi si verifica nelle cellule immaginale in specifici momenti caratteristici alzando i suoi numeri (circa 50000 cellule) e formando l'ala disco1,2,3, 4. Come le cellule proliferano, essi moda un epitelio tubulare, risultante in una spirale auto-pieghevole compatta. Durante impupamento, l'epitelio disco telescopi fuori all'ala forma i due strati e le vene longitudinali iniziare come lacune tra di loro, che si verifica due volte durante ala dello sviluppo5,6.
La disposizione delle vene sempre ha un modello identico; la capacità di identificare facilmente ogni alterazione all'interno della formazione di vene rende mutazioni estremamente visibile (ad esempio mancanti o aggiuntivi vene, cambiamenti in vena posizioni, ecc.). Interessante, le variazioni di fenotipo sono solitamente le prove delle mutazioni nei componenti noti o romanzo di vie che sono rilevanti per lo sviluppo dell'ala di segnalazione. Una delle vie che svolge un ruolo nella determinazione della posizione e della manutenzione della vena e intervein territori è il pathway di Hedgehog (Hh)6,7,8.
Data l'importanza dell'ala pupal come sistema modello, sarà importante ottenere campioni di buona qualità per lavorare con. In passato, gli scienziati che hanno pubblicato i protocolli per sezionare Drosophila Ali non hanno dato una guida appropriata per raggiungere campioni realizzabili. Senza la Guida di un ricercatore, uno non può visualizzare chiaramente il processo. In questi approcci alternativi per dissezione la pupa è divisa in due, separando l'ala dal tessuto circostante e ripetutamente lavata per rimuovere i detriti. Questo tipo di approccio sostiene di lasciare l'ala libera di contamina, ma a causa di precedenti esperienze il processo è più lento e c'è una maggiore probabilità di compromettere la struttura delle ali fragili9.
La procedura qui descritta è stata sviluppata dall'esigenza di trovare un metodo veloce ed efficiente per ottenere campioni di pupal ala adatti per rilevare specifiche proteine o trascrizioni utilizzando protocolli immunodetection o analisi di reazione a catena (PCR) della polimerasi. Per illustrare questo, l'espressione e la localizzazione di Patched (Ptc o il recettore canonico del pathway di Hh) viene rilevato in campioni di pupal ala, fornendo un protocollo che include dettagli rilevanti per svolgere con successo la completa procedura.
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Protocol
1 ° giorno
1. raccolta e coltura pupe.
- 0 h dopo formazione pupario (APF) o membranose usando un pennello bagnato dai flaconcini colte e adagiatele in new fiale a quasi completa il periodo di sviluppo (Vedi 2.1 e 2.2).
Nota: Una popolazione sana di mosche dovrebbe essere mantenuta utilizzando protocolli standard di coltura. Dopo tre o quattro giorni in cui le uova vengono deposte, gli adulti possono essere rimossi dai flaconcini per consentire uno sviluppo ottimale degli individui. Sono mantenute a temperatura costante fino a quando le larve instar terza avviare impupamento. La transizione larvale/pupa è contrassegnata dalla formazione di prepupa considerato il h 0 APF. La prepupa è una immobile larva bianca che ha un oblungo, di forma rotonda con sporgenti spiracoli anteriori.
2 ° giorno
2. il trasferimento, la dissezione e la fissazione.
- Trasferimento alle pupe (2 h prima che il tempo di sviluppo completi) con un pennello, il vetrino da microscopio con nastro biadesivo aderito ad esso. Posizionare le pupe per formare che una riga con i lati dorsale alto e cefalica finisce rivolte nella stessa direzione.
- Restituire il vetrino a temperatura costante e consentire le pupe completare il tempo di sviluppo appropriato (cioè 24-30 h APF).
Nota: Il vetrino da microscopio con il nastro biadesivo sarà una piattaforma di dissezione transitoria per rimuovere il caso pupal (Vedi sotto). Il lasso di tempo sul vetrino da microscopio (fuori il flaconcino) aiuta ad per asciugare il caso pupal rendendolo facilmente frangibile con il forcipe. - Rimuovere l'opercolo dal caso pupal usando il forcipe.
- Rompere il caso con il forcipe (come mostrato nel video) facendo una linea lungo il lato della pupa all'estremità caudale di esso. Con la giusta illuminazione è possibile rilevare la forma interna della pupa rendendo evidente uno spazio appena sopra la cerniera dell'ala pupal. Questo spazio funge da guida per eseguire l'apertura senza danneggiare la pupa.
- Rimuovere le parti del caso, li raccolga fino al confine aperto e li trasportano verso il lato opposto, dove il nastro biadesivo li terrà. Alla fine della dissezione le pupe sarà quasi "nude", solo un piccolo pezzo del caso sarà che coprono la punta posteriore.
Nota: Lo scopo di lasciare una piccola quantità di caso sull'estremità caudale superiore è quello di garantire un regolare rilascio dalla custodia il vetrino con il nastro biadesivo. Ragionamento alla base di questa azione è perché se si rimuove troppo del caso si notevolmente rischia di danneggiare la pupa. D'altra parte se si rimuove troppo poco, la pupa non facilmente verrà gratuita del caso. - Spingere verso il basso (con forcipe) il resto del caso. Questo movimento sarà sollevare l'estremità anteriore della pupa, consentendo sia la testa e il torace a rimanere in una posizione preferenziale di aderire e di essere trasferiti nel passaggio successivo.
- Prendere una nuova diapositiva con nastro biadesivo e invertire la pupa o una riga di pupe. Si consiglia di eseguire questo approccio osservando i movimenti con l'aiuto dello stereomicroscopio per prevenire rotture delle pupe.
- Premere leggermente per far le pupe attacchi al nastro e far scorrere delicatamente il vetrino al fine di rimuovere le pupe dal resto dei casi. Invertire il vetrino da microscopio: le pupe saranno bloccate dal lato dorsale a livello della loro testa / zona del torace.
- Coprire tutte le pupe nude con paraformaldeide al 4% e attendere 10 min. Nella nostra esperienza, questo lasso di tempo con il fissativo aiuta a cambiare la consistenza della cuticola rendendola costante, meno appiccicoso e facile da gestire.
Nota: Per eseguire l'estrazione di acido ribonucleico (RNA), paraformaldeide sostituto per tampone fosfato salino (PBS) realizzati con RNAsi libera acqua e rimuovere le ali pupale effettuando un taglio (con l'ausilio di forbici) vicino al punto di cerniera di ciascuna appendice. Usando il forcipe, trasferire l'ala pupal ad un tubo del microcentrifuge con 1 mL di reagente fenolo e tiocianato di guanidinium. Dopo aver raccolto un totale di 50-80 Ali, conservare il tubo del microcentrifuge a-80 ° C fino a eseguire il RNA estrazione10,11. - Praticare una piccola incisione alla regione cerniera dell'ala o vicino ad esso. Consentire il fissativo raggiungere l'epitelio dell'ala. Utilizzando una pipetta (p200) a filo fissativa sopra l'ala. Quando lo svuotamento di sostituire i contaminati fissarsi con nuovi. Dopo il lavaggio, mantenere ala in fissativo per 5 min.
Nota: Anche se questa manovra aiuta a sgombrare la maggior parte del tessuto contaminante, alcuni emociti e goccioline di grasso possono rimanere intrappolate tra gli strati epiteliali dorsali e ventrali dell'ala (Vedi Figura 1A). - Strappare con la pinzetta dai confini della cuticola (come mostrato nel video) espandendo il foro e consentire il rilascio dell'epitelio ala dal sac cuticola. Una volta rilasciato il tessuto di ala, lasciarlo nella soluzione di paraformaldeide per completare 30 min di fissazione.
- Trasferire le ali fisse in un uno 4-saldata piatto di plastica riempito con PBST (Triton X-100 0,05%). Archivio durante la notte a 4 ° C.
3 ° giorno
3. incubazione primaria dell'anticorpo.
- Permeabilize il tessuto incubando le ali pupale in PBST (Triton X-100 0,2%) per 15 min usando una piattaforma oscillante per facilitare un movimento medio liquido dolce.
Nota: Fino al montaggio dei campioni, la procedura deve essere eseguita utilizzando una piattaforma a dondolo. - Bloccare i campioni utilizzando PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) per 1 h.
- Utilizzare lo stesso buffer per diluire l'anticorpo primario (topo anti-Ptc, 1: 100) e incubare le ali pupale durante la notte a 4 ° C.
4 ° giorno
4. incubazione anticorpo secondario.
- Lavaggio campioni 4 x 10 min ciascuno con PBST (Triton X-100 0,05%)
- Incubare con anticorpo secondario (ad es., anti-topo coniugato al fluorocromo) diluita a concentrazione appropriata in PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) a temperatura ambiente al buio, per 2 h.
Nota: Se è appropriato, è possibile utilizzare 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e/o falloidina per colorante di contrasto del tessuto. Aggiungi queste sonde con l'anticorpo secondario tenendo conto della lunghezza d'onda di emissione dei fluorocromi per evitare la sovrapposizione dei segnali. - Lavaggio campioni 4 x 10 min ciascuno con PBST (Triton X-100 0,05%)
5. montaggio
- Preparare un vetrino inserendo 4 puntini di smalto trasparente sul vetrino da microscopio come se fossero i vertici di un quadrato.
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Representative Results
Il protocollo offre un metodo semplice per ottenere campioni di pupal ala che conservano la morfologia familiare dell'ala. Da queste preparazioni è possibile ottenere gli stack di immagini che potrebbero essere proiettati all'esterno come 2D o 3D, per studiare la distribuzione e/o l'arricchimento di proteine durante la differenziazione dell'ala. Un protocollo simile (vedere la nota in 2.9) consente di raccogliere il campione di grande ala pupale (che coinvolge 50-80 pupal Ali) necessario sintetizzare acido deossiribonucleico complementare (cDNA), il modello utilizzato nelle reazioni di PCR.
Figura 1 : Gene di pathway di hedgehog in Drosophila ali di pupale
(A) patchato, il recettore canonico della via di Hedgehog, è stato visualizzato a 24-30 h APF utilizzando mouse anti - Ptc. Nuclei erano controcolorati con DAPI considerando che i filamenti dell'actina sono visualizzati usando un falloidina fluorescente verde. Distribuzione di actina aiuta a localizzare le vene ala e la sua relazione con l'espressione patchato . Allo stesso tempo, falloidina macchia rivela la presenza di alcuni emociti e goccioline di grasso (grandi cerchi) come contaminazione del tessuto. 20 ingrandimenti, anteriore sono fino. Scala bar, 100 µm (B) ampliconi all'actina (lane 1, 280 bp) e ptc (corsia 2, 236 bp) sono stati ottenuti mediante cDNA sintetizzato da RNA messaggero (mRNA) ala campione generato da un simile protocollo di dissezione. MW, peso molecolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo della dissezione descritto in questo video può essere utilizzato per preparare campioni di alta qualità di Drosophila pupale ali dalle fasi differenti di sviluppo per molti tipi di tecniche (ad es., immunofluorescenza, sintesi di cDNA per analisi di PCR, in vitro sviluppo di ala). In termini di questo metodo lo scienziato coinvolto hanno usato 24-30 h APF. Tuttavia, non ci dovrebbe essere nessun ostacolo entro i passi essenziali nella dissezione di pupa più giovane o più anziani. Le modifiche potrebbero essere necessario essere fatte per accogliere più piccola pupa di fase.
Il protocollo può essere eseguito per sezionare una pupa o pupe diversi allo stesso tempo. Questo consente di accelerare la procedura, rendendo più facile raggiungere un gran numero di ali dissecato. In questo caso c'è la possibilità di rimuovere una fila di 4-5 pupe allo stesso tempo. È possibile rimuovere le pupe insieme o se non è possibile, continuare a rimuovere singolarmente sulla diapositiva stessa (vedere sezione III del video: "Dissezione più pupe"). Per rimuovere la pupa nuda dal caso aperto, è importante che la punta posteriore è abbastanza piccola. È possibile rimuovere la cassa interamente; anche se sarebbe più veloce il trasferimento, la rimozione di tutta la cassa è impegnativo e c'è un maggior rischio di danneggiare la pupa.
Esperienza di dettami che una manovra importante da considerare è quello di lasciare (l'ultima 2 h per completare il tempo di sviluppo stabilito) la pupa attaccato al vetrino all'interno dell'incubatrice, ma fuori il flaconcino. Questo lasso di tempo aiuta ad per asciugare il caso che lo rende più facile da rompere. Un altro punto critico durante la dissezione per immunoistochimica, è staccare la cuticola che copre l'epitelio dell'ala, quindi concedere l'accesso dell'anticorpo alla superficie intera ala. Questo passaggio dovrebbe essere fatto dopo che fissa, per alcuni minuti (almeno 5 min dopo l'incisione presso il punto di cardine) perché il fissativo stabilizza i tessuti e cambia la consistenza della cuticola, rendendolo più facile da sbucciare.
Durante l'esecuzione di tutti i passaggi di immunohistochemistry, essere sicuri che le ali sono in costante movimento (dondolo piattaforma). Il movimento aiuta a migliorare l'interscambio e la penetrazione delle soluzioni durante i lavaggi e le incubazioni. Tuttavia, è importante eseguire loro delicatamente evitando il verificarsi delle distorsioni indesiderate nella morfologia di questa struttura fragile (cioè, è sufficiente che le oscillazioni della piattaforma spostare leggermente il liquido contenente medio i campioni).
Questa procedura fornisce un approccio alternativo e complementare ai metodi già pubblicati per dissezione pupal ala.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare CSIC per il sostegno finanziario dato a questo progetto, a Mariana Di Doménico per la sua assistenza tecnica con microscopia confocale; per José Leonardo Báez per correzioni suo manoscritto; a Luciano Correa per la sua dedizione alla creazione di video; a Natalia Rosano per prestando la sua voce per il video e Bloomington Drosophila Stock Center per fornire le scorte utilizzate in questo studio. La PA1 monoclonale anti-Ptc sviluppato da Isabel Guerrero è stato ottenuto da inerente allo sviluppo studi Hybridoma Bank (DSHB) sotto l'egida del NICHD e gestito dal dipartimento di scienze biologiche, The University of Iowa, Iowa City, IA 52242.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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