Summary
Способность точно обнаруживать стенограммы или белков в тканях дрозофилы имеет решающее значение для изучения их изобилие и локализации, связанных с процессом развития. Вот описание простой процедуры для того чтобы рассечь куколки крылья. Эти крылья могут использоваться в качестве образцов в несколько приемов (иммуногистохимии, ПЦР анализа и т.д.).
Abstract
Крыло развитие в Drosophila melanogaster является идеальной моделью для изучения морфогенеза на тканевом уровне. Эти придатках развиваются из группы клеток, названный крыло имагинальных дисков, сформированные в ходе эмбрионального развития. В личиночной стадии имагинальных дисков растут, увеличивая его количество клеток и формирования однослойное эпителиальных структур. Внутри куколки дела имагинальных дисков бутон и сложите в бислоев вдоль линии, которая становится будущее края крыла. В ходе этого процесса продольной primodia вен возникают Вены клетки на перспективных дорсальной и вентральной поверхности крыла. На стадии куколки полосы вен клеток каждой поверхности общаться с целью создания жесткой трубы; в то же время кросс вен начать их формирования.
С помощью соответствующих молекулярных маркеров это возможно для определения основных элементов, составляющих крыла во время его разработки. По этой причине способность точно обнаруживать стенограммы или белков в этой структуре имеет решающее значение для изучения их изобилие и локализации, связанных с процессом развития крыла.
Процедура описана здесь сосредоточена на манипулирование куколки крылья, предоставляя подробные инструкции о том, как анализировать крыло на стадии куколки. Рассечение куколки ткани сложнее, чем их коллеги в третьего возраста личинок. Вот почему этот подход был разработан, чтобы получить быстрое и эффективное высокое качество образцов. Подробная информация о том, как имунноконтраст и горе эти образцы крыло, чтобы позволить визуализации белки или клеточных компонентов, предоставляются в протоколе. С небольшим опытом можно собрать 8-10 высокое качество куколки крылья в короткий промежуток времени.
Introduction
Дрозофилы крылья развиты из имагинальных дисков крыла. Изначального этих дисков крыла отложить в сторону во время эмбрионального развития как небольшие группы 20-30 имагинальных ячеек из эмбриональных эпителия инвагинировать. В то время как личинка растет на третий этап instar, митоз происходит в имагинальных клеток на конкретных характеристические времена, повышение его номера (около 50000 клетки) и формирования крыло диск1,2,3, 4. Как клетки размножаются, они модные трубчатых эпителия, что приводит к самостоятельной раскладной компактный спираль. В ходе Окукливание эпителий диска Телескопы в виде двухслойной крыло и продольные Вены начать как пробелы между ними, которое происходит дважды в течение крыло развития5,6.
Расположение вен всегда имеет идентичные шаблон; возможность легко определить все изменения в пределах вен образования делает мутации чрезвычайно видимым (например отсутствующие или лишние вен, изменения в духе позиции и т.д.). Интересно, что вариации фенотип обычно являются свидетельством мутаций в известных или Роман компонентов сигнальные пути, которые имеют отношение к развитию крыла. Одним из путей, которые играет определенную роль в определении положения и поддержания вен и intervein территорий является ежа (Hh) путь6,,78.
Учитывая важность куколки крыла как модель системы, это будет важно для получения хорошего качества образцов для работы с. В прошлом ученые, которые опубликованы протоколы для того чтобы рассечь дрозофилы крылья не дали соответствующее руководство для достижения реальных образцов. Без руководства исследователь один нельзя четко визуализировать процесс. В этих альтернативных подходов рассечения куколки разделен на два, отделяя крыло от окружающих тканей и многократно промывают для удаления мусора. Такого рода подход претензий оставить бесплатно крыло загрязняет, но из-за предыдущего опыта процесс медленнее и выше вероятность компрометации структуру хрупких крылья9.
Процедуру, описанную здесь был разработан спроса найти быстрый и эффективный метод для получения образцов куколки крыла, подходящих для выявления специфических белков или стенограммы, протоколы immunodetection или полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализов. Чтобы проиллюстрировать это, выражение и локализации заплата (Ptc или канонического рецептор Hh путь) обнаружен в образцах куколки крыла, обеспечивая протокол, который включает в себя соответствующие детали успешно провести полный процедура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 день
1. сбор и культивирования куколок.
- Удалить 0 h после формирования puparium (АТФ) или prepupae, с помощью мокрой кистью из искусственного флаконов и поместить их в новые флаконы для почти полного периода развития (см. 2.1 и 2.2).
Примечание: Здорового населения мух должна поддерживаться с помощью стандартных протоколов культивирования. После трех или четырех дней, в которые откладывает яйца взрослые могут быть удалены из флаконов для оптимальной разработки лиц. Они поддерживаются при постоянной температуре до третьего возраста личинок инициировать окукливание. Личинок/куколки переход характеризуется формирования prepupa, считается 0 h НФА. Prepupa является немобильные белые личинки, имеющий продолговатые, округлой формы с выступающим передней дыхальца.
День 2
2. Передача, рассечение и фиксации.
- До передачи куколки (2 ч перед время разработки завершения) с кистью, микроскопа с двухсторонней ленты присоединились к нему. Расположите куколки в форме строки со спинной стороны, вверх и акушерский заканчивается лицом в одном направлении.
- Возвращение микроскопа в постоянной температуры и позволяют куколок выполнить соответствующее время развития (т.е. 24-30 h НФА).
Примечание: Микроскопа с двухсторонней ленты будет лицевой рассечение платформой для удаления куколки дела (см. ниже). Промежуток времени на микроскопа (вне флакона) помогает сухой куколки дело, что делает его легко разбиваемое пинцетом. - Удалите крышечки из куколки дела с помощью щипцов.
- Сломать дело с щипцами (как показано в видео) делая линию вдоль стороны куколки в хвостовой конец его. С соответствующим освещением можно обнаружить внутреннюю форму куколки, делая очевидным пробелом чуть выше петли куколки крыла. Это место служит руководством для выполнения открытия без повреждения куколки.
- Удаление части дела, поднимая их на открытые границы и проведение их на противоположной стороне, где двухсторонний скотч проведет их. В конце рассечение куколок будет почти «голый», только небольшой кусок этого дела будет охватывать задней оконечности.
Примечание: Оставляя небольшое количество дела на верхнем конце хвостового предназначен для обеспечения гладкой освобождения от дела на слайд с двухсторонней ленты. Обоснование этого действия, это потому что если вы удалить слишком много дела вы значительно риск повреждения куколки. С другой стороны если вы удалите слишком мало, куколки не придет легко бесплатно дела. - Нажмите вниз (с щипцами) остальная часть дела. Это движение будет поднять переднего конца куколки, позволяя головы и грудной клетки, чтобы остаться в состоянии преференциального присоединиться и быть переданы на последующем шаге.
- Возьмите новый слайд с двухсторонней ленты и инвертировать его куколки или строке куколок. Мы рекомендуем этот подход, наблюдая за движениями с помощью стереомикроскопом для предотвращения поломки куколок.
- Слегка нажмите для куколок придерживаться ленты и мягко скользить слайд, чтобы удалить куколки от остальной части дела. Инвертировать микроскопа: куколок будет застрял на спинной стороне на уровне их головы / область грудной клетки.
- Охватывают все голые куколки с параформальдегида 4% и подождите 10 минут. По нашему опыту этот промежуток времени с фиксатором помогает изменить последовательность кутикулы, делая его фирмы, менее липкой и простой в обращении.
Примечание: Для выполнения извлечения рибонуклеиновой кислоты (РНК), замену параформальдегида для фосфат амортизированное saline (PBS) с РНКазы свободной воды и удалить куколки крылья, делая разрез (с помощью ножниц) вблизи шарнира точки каждого придаток. С помощью щипцов, куколки крыло передать microcentrifuge трубка с 1 мл раствора реагента Гуанидиновые тиоцианат и фенола. После сбора в общей сложности 50-80 крылья, Храните пробки microcentrifuge-80 ° c до выполнения РНК добыча10,11. - Сделайте небольшой надрез в регионе петли крыла или вблизи него. Разрешить фиксатором для достижения крыло эпителия. Использование пипетки (p200) флеш фиксирующие над крылом. При промывке заменить загрязненных фиксировать с новым. После промывки, держите крыла в фиксатором для 5 мин.
Примечание: Хотя этот маневр помогает очистить большинство загрязняющих ткани, некоторые hemocytes и тучные капельки могут оставаться в ловушке между дорсальной и вентральной эпителиального слоя крыла (см. рис. 1A). - Разрыв с щипцами от кутикулы границ (как показано в видео) расширение отверстие и включение выпуска крыло эпителия от кутикулы sac. Попав в ткани крыло, оставьте его в параформальдегида решение завершить 30 мин фиксации.
- Передать один 4-навернулись пластиковые блюдо заполнены с PBST фиксированной крылья (Тритон X-100 0,05%). Магазин на ночь при 4 ° C.
День 3
3. основное антитело инкубации.
- Разрушения тканей, инкубации куколки крылья в PBST (Тритон X-100 0,2%) за 15 мин, с использованием качания платформы для облегчения нежные жидкость среднего движения.
Примечание: До монтажа образцов, шаги должны выполняться с помощью качания платформы. - Блокировать образцов, с помощью PBSTA (BSA 3%, Тритон X-100 0,1%) за 1 ч.
- Используйте тот же буфер для разбавления основное антитело (мыши анти Ptc, 1: 100) и инкубировать куколки крылья на ночь при 4 ° C.
День 4
4. Вторичное антитело инкубации.
- Мыть образцы 4 x 10 мин с PBST (Тритон X-100 0,05%)
- Проинкубируйте с вторичных антител (например, анти мыши проспряганное флюрохром) разбавляют до соответствующей концентрации в PBSTA (BSA 3%, Тритон X-100 0,1%) в темноте, втечение 2 ч при комнатной температуре.
Примечание: Если это уместно, используйте 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и/или Фаллоидин к counterstain ткани. Добавьте эти зонды с вторичного антитела, принимая во внимание длина волны излучения флуорохромов для предотвращения дублирования сигналов. - Мыть образцы 4 x 10 мин с PBST (Тритон X-100 0,05%)
5. Монтаж
- Подготовьте образец слайда, поставив 4 точек прозрачный лак на микроскопа, как если бы они были вершины квадрата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол предоставляет простой метод для получения образцов куколки крыла, которые сохраняют знакомые морфология крыла. Из этих препаратов можно получить стеки изображений, которые могут быть спроектированы как 2-D и 3-D, для изучения распределения и/или обогащения белков во время дифференциация крыла. Аналогичный протокол (см. Примечание в 2.9) может использоваться для сбора больших куколки крыла образца (с участием 50-80 куколки крылья) необходимо синтезировать взаимодополняющих дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК), шаблон, используемый в реакциях PCR.
Рисунок 1 : Еж путь гена в Дрозофилы куколки крылья
Заплата (A) , каноническое рецептор пути еж, был визуализирован на 24-30 h НФА с помощью мыши анти - Ptc. ядра были counterstained с DAPI тогда как филаментов актина визуализируются с помощью Фаллоидин Грин люминесцентные. Актин распределение помогает локализовать крыло вен и его связь с исправленными выражением. В то же время Фаллоидин пятно показывает наличие некоторых hemocytes и тучные капельки (большие круги) как загрязнение тканей. 20 x увеличение, передняя — вверх. Масштаб бар, 100 мкм (B) ампликонов актина (переулок 1, 280 bp) и РТС (переулок 2, 236 bp) были получены с помощью cDNA синтезированный из образца крыло матричная РНК (мРНК), порожденных аналогичный протокол вскрытия. МВт, молекулярный вес. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод вскрытия, описанные в этом видео может использоваться для подготовки образцов высокого качества дрозофилы куколки крыльев от развития различных этапов для многих типов методов (например, иммунофлюоресценции, синтез cDNA в анализы ПЦР, в пробирке крыло развития). С точки зрения этот метод участвует ученый использовали 24-30 h НФА. Однако должно быть никаких препятствий в рамках основных шагов в рассечение младше или старше куколки. Изменения могут должны быть сделаны для размещения мелких стадии куколки.
Протокол может быть выполнена для того чтобы рассечь куколки один или несколько куколок в то же время. Это помогает ускорить процедуры, что делает его легче достичь большое количество крылья расчлененный. В этом случае есть возможность удаления строки 4-5 куколки в то же время. Вы можете удалить куколок вместе или если это не возможно, продолжать удалять по отдельности на тот же слайд (см. раздел III видео: «Несколько куколок рассечение»). Чтобы удалить голый куколки открыл дело, важно, что задняя кончик достаточно мал. Это позволяет удалить случае полностью; Хотя это будет сделать передачу быстрее, удаление всего дела является сложным и есть больший риск повреждения куколки.
Опыт диктует, которые важно маневр, чтобы рассмотреть, чтобы оставить (последние 2 h завершить время разработки предусмотрено) куколки придает микроскопа внутри инкубатора, но вне флакона. Этот промежуток времени помогает в сухом случае, что делает его легче сломать. Еще один важный шаг во время вскрытия для иммуногистохимии, является слезает кутикулы, который охватывает крыло эпителия, тем самым предоставление доступа антитела к поверхности всего крыла. Этот шаг следует сделать после фиксации на несколько минут (по крайней мере 5 минут после делать разрез в точке петли) потому что фиксатором стабилизирует тканей и изменяет последовательность кутикулы, что делает его легче чистить.
Во время выполнения всех шагов иммуногистохимии, будьте уверены, что крылья находятся в постоянном движении (качалка платформы). Движение помогает улучшить обмен и проникновения решений во время мойки и инкубаций. Тем не менее важно выполнять их аккуратно во избежание возникновения нежелательных искажений в морфологии этой хрупкой структуры (то есть, достаточно, что колебания платформы слегка перемещать жидкость средних содержащие образцы).
Эта процедура обеспечивает альтернативных и дополнительных подход к уже опубликованных методов для рассечения куколки крыла.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить CSIC за финансовую поддержку этого проекта, Мариана Di Doménico для ее технической помощи конфокальной микроскопии; для Хосе Леонардо Баэс для исправления его рукопись; для Лусиано Корреа за его приверженность созданию видео; для Натальи Rosano для кредитования Блумингтон дрозофилы фондовой центр для обеспечения запасов, используемые в данном исследовании и ее голос для видео. Apa1 моноклонального анти Ptc разработала в Isabel Герреро был получен от развития банка гибридомной исследований (DSHB) под эгидой NICHD и поддерживается университета штата Айова, Отделение биологических наук, Айова-Сити, IA 52242.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Serrano, N., O'Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
