Summary
Zwei biotinylierungsbasierte Verfahren zur Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen, die an der Plasmamembran exprimiert werden, sind in diesem Bericht dargestellt.
Abstract
Zelloberflächenproteine vermitteln eine Vielzahl von Funktionen. In vielen Fällen wird ihre Aktivität durch endozytische Prozesse reguliert, die ihre Niveaus an der Plasmamembran modulieren. Hier stellen wir detaillierte Protokolle für 2 Methoden vor, die das Studium solcher Prozesse erleichtern, die beide auf dem Prinzip der Biotinylierung von Zelloberflächenproteinen basieren. Die erste ist so konzipiert, dass sie die semi-quantitative Bestimmung der relativen Ebenen eines bestimmten Proteins an der Zelloberfläche ermöglicht. In ihr werden die Lysinreste der Plasmamembranproteine der Zellen zunächst mit einer Biotineinheit markiert. Sobald die Zellen lysiert sind, können diese Proteine dann spezifisch durch die Verwendung von Agarose-immobilisiertem Streptavidin ausgefällt werden, indem sie die natürliche Affinität der letzteren für Biotin ausnutzen. Die so isolierten Proteine können dann über einen Standard-Western-Blotting-Ansatz analysiert werden. Die zweite Methode liefert ein Mittel zur Bestimmung der endozytischen Rate einer PartikelAr Zell-Oberfläche Ziel über einen Zeitraum von Zeit. Zelloberflächenproteine werden zuerst mit einem Biotinderivat modifiziert, das eine spaltbare Disulfidbindung enthält. Die Zellen werden dann wieder auf normale Kulturbedingungen verschoben, was die endozytische Aufnahme eines Anteils an biotinylierten Proteinen bewirkt. Als nächstes werden die Disulfidbindungen von nicht internalisierten Biotin-Gruppen unter Verwendung des membranundurchlässigen Reduktionsmittels Glutathion reduziert. Über diesen Ansatz können damit endozytierte Proteine mit hohem Spezifitätsgrad isoliert und quantifiziert werden.
Introduction
Proteine an der Zelloberfläche spielen eine Vielzahl von Rollen, die zentral für die Aufrechterhaltung der Zellfunktion sind. In zahlreichen Fällen ist ihre Aktivität von endozytischen Prozessen abhängig oder moduliert, die sie entweder vorübergehend in intrazellulären Stellen sequestrieren oder sie auf abgebrochene Wege 1 , 2 , 3 , 4 , 5 richten. Hier heben wir 2 Biotinylierungs-basierte Ansätze hervor, die es dem Anwender ermöglichen, die an der Plasmamembran ausgedrückten Proteine spezifisch zu markieren und zu isolieren, und diejenigen, die neu verinnerlicht sind. Über diese Methoden kann die Zelloberflächenexpression und die endozytische Rate eines beliebigen Proteins von Interesse quantifiziert werden, so dass eine klarere Beurteilung seiner Regulation erreicht werden kann.
Bestimmung der relativen Zelloberflächen-Proteinexpression durch Biotinylierung
Biotin oder Vitamin B7, früher bekannt als Vitamin H 6 , ist ein kleines wasserlösliches Molekül, das zur chemischen Modifizierung von reaktiven Amin-, Sulfhydryl- und Carboxylgruppen biologischer Moleküle verwendet werden kann. Die gegenwärtige Ernte von Zelloberflächen-Biotinylierungsreagenzien besteht hauptsächlich aus membranimpermenden sulfonierten N-Hydroxysuccinimid (Sulfo-NHS) -estern von Biotin oder seinen Derivaten, die so konstruiert sind, dass sie mit den Aminen reagieren, die an den Seitenketten von Lysinresten von Proteinen, die in Die Zelloberfläche, wenn diese unter basischen Bedingungen deprotoniert werden, was dazu führt, dass letztere eine Amidbindung mit dem Biotinrest 7 bildet . So können modifizierte, Zelloberflächenproteine dann über die Verwendung von Avidin, einem 66 - 69 kDa tetrameren Protein, das eine große Affinität für Biotin besitzt, isoliert werden, wobei die Bindung an diese mit einer Dissoziationskonstante von etwa 10 & supmin; & sup5; & supmin; & sup5; Stärkste nichtkovalente Wechselwirkungen bekannt 8 , 9
Eine Reihe von alternativen Verfahren zur Quantifizierung der Proteinexpression an der Zelloberfläche wurden in früheren Studien verwendet. Die Etikettierung von nichtpermeabilisierten Zellen unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die für das interessierende Protein spezifisch sind, gefolgt von der Visualisierung über Fluoreszenzmikroskopie, ist zum Beispiel ein allgemein angewandter Ansatz, ist aber stark abhängig von der Verfügbarkeit von Antikörpern, die an extrazelluläre Epitope binden können. In jüngerer Zeit wurden auch Verfahren, die die Verwendung von chimären Proteinen mit pH-empfindlichen Fluorophoren einschließen, die auf saures Medium ausgesetzt sind, erfolgreich eingesetzt worden 10 . Jedoch beinhalten solche Assays gewöhnlich die exogene Expression dieser Konstrukte in Zelllinien, in denen das Protein von Interesse nicht nativ gefunden wird. Diese Ansätze sind dennoch in der Lage, wertvolle Informationen über die subzelluläre Lokalisierung und exozytische Route derZiel-Protein und sollte daher in Verbindung mit den hier beschriebenen biotinylierungsbasierten Ansätzen verwendet werden, wenn die Werkzeuge verfügbar sind.
In einem typischen Biotinylierungsassay werden die Zellen zunächst gründlich in 4 ° C PBS gewaschen. Dadurch werden Spuren von Serumproteinen, die durch das Kulturmedium eingeführt werden, entfernt, wodurch sichergestellt wird, dass diese im nächsten Schritt keine überschüssigen Mengen an Biotin verbrauchen werden. Noch wichtiger ist, dass die Verringerung der Temperatur die Endozytose deutlich verlangsamt. Das Biotinylierungsreagenz wird dann zugegeben. Als nächstes werden die Zellen wieder gewaschen und dann mit einem Quenchpuffer, der entweder Glycin oder NH & sub4; Cl enthält, inkubiert, wobei der Zweck darin besteht, alle verbleibenden Spuren von nicht umgesetztem Biotin zu inaktivieren. Die Zellen werden dann lysiert, wonach Agarose-immobilisiertes Streptavidin zugegeben wird, um die biotinylierten Proteine auszufällen. Die Analyse wird üblicherweise über Western-Blotting durchgeführt, was die relative Zelloberflächen-Expression verschiedener pr ermöglichtOteins zu quantifizieren.
Aufgrund der Basis dieses Assays eignet es sich nur für die Verwendung von Proteinen, die Teile aufweisen, die der extrazellulären Umgebung ausgesetzt sind. Multipass-Transmembranproteine, die wahrscheinlich eine Anzahl reaktiver Lysine innerhalb ihrer Schleifenregionen besitzen, sind für diese Methode am geeignetsten, während Single-Pass-Proteine dazu neigen, weniger anfällig für biotinyliert zu sein. Auch in diesen Fällen besteht die Möglichkeit, dass Konformationsänderungen oder intermolekulare Wechselwirkungen bestimmte reaktive Stellen verschließen können, was zu einer niedrigeren als erwarteten Biotinylierungsausbeute führt.
Bestimmung der Internalisierungsrate von Zelloberflächenproteinen durch Biotinylierung
Die Prinzipien dieses Assays ähneln weitgehend denen der Zelloberflächen-Biotinylierung mit einer Anzahl von Ausnahmen, wobei die wichtigste davon die Verwendung von reversiblen Biotinylierungsreagenzien ist. Die Biotin-Gruppen (davon) besitzen disuLfide Bindungen, in ihren Strukturen, die anfällig für Reduktionsmittel sind; Dies wird ausgenutzt, um sicherzustellen, dass nur Zelloberflächenproteine, die während der Testphase in intrazelluläre Stellen aufgenommen wurden, biotinyliert bleiben. Ein Assay findet in der Regel auf folgende Weise statt. Die Zellen werden zuerst gewaschen und mit kalten Reagenzien biotinyliert, dann wird das Zellkulturmedium bei 37 ° C wieder eingeführt und die Zellen werden in den Inkubator zurückgeführt; Dies bewirkt, dass die markierten Zelloberflächenproteine einer Endozytose unterliegen. Das Reduktionsmittel Glutathion, das die Membran nicht durchdringen kann, wird dann zugegeben, um die Disulfidbindungen der Biotinreste zu brechen, die an Proteinen gebunden sind, die auf der Zelloberfläche verbleiben. Schließlich werden die gebrochenen Disulfidbindungen mit Iodacetamid umgesetzt, wobei die labilen Thiolgruppen verbraucht werden und die Bindungen daran gehindert werden, sich zu reformieren. Wie zuvor werden die Zellen dann lysiert und die markierten Proteine werden unter Verwendung von Streptavidin-Agarose ausgefällt.
Die BeschränkungsscheibeIm vorangegangenen Abschnitt gelten auch hier wegen der Ähnlichkeiten, die zwischen den Methoden geteilt werden. Darüber hinaus lohnt es sich zu bedenken, dass die an diesem Assay beteiligten Temperaturverschiebungen die genaue Bestimmung verhindern, wieviel Protein für jedes Zeitintervall endozytiert wird, insbesondere bei schnell verinnerlichten oder schnell recyclierenden Proteinen. Der Assay liefert daher nur eine semiquantitative Schätzung der endozytischen Raten. Total interne Reflexions-Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um die Aufnahme jedes geladenen Vesikels zu verfolgen und eine genauere Messung der Kinetik der Endozytose zu liefern. Es kann daher eine sehr nützliche Ergänzung zu diesem Assay liefern, vorausgesetzt, dass ein fluoreszenzmarkiertes chimäres Konstrukt des Proteins von Interesse verfügbar ist 11 .
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Protocol
1. Bestimmung der relativen Zelloberflächen-Protein-Expression in Astrozyten durch Biotinylierung
HINWEIS: Hier veranschaulichen wir die Anwendung dieser Biotinylierungstechnik auf die Untersuchung der Effekte des extrazellulären Matrixmoleküls Laminin auf die Zelloberflächenlokalisierung des wasserdurchlässigen Kanals aapaporin-4 (AQP4). Spezielle Materialien, die für diesen Assay erforderlich sind, umfassen Sulfo-NHS-LC-Biotin und Streptavidin-Agarose-Harz (siehe Tabelle der Materialien ).
- Unter Verwendung der in Noel et al. 12 , kultivieren kultikale Astrozyten etwa 2 Wochen vor dem Assay und wachsen sie in 75 cm 2 belüfteten Kulturkolben. Wenn Astrozyten 80 - 90% konfluent sind, lösen sie sie von der Kulturoberfläche mit 0,05% Trypsin, und dann passieren sie 1: 3.
- Bei 48 h vor dem Assay, wenn die Zellen wieder 80 - 90% konfluent sind, passieren die Astrozyten 1: 3 (für die cHängen im Kulturformat) auf 60 mm Zellkulturschalen, so dass sie> 70% konfluent am Tag des Experiments stattfinden. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig zwischen den Speisen verteilt sind.
- Bei 16 h vor dem Assay pipettieren Sie Laminin in das Kulturmedium auf eine Endkonzentration von 24 nM und inkubieren bei 37 ° C.
- Unmittelbar vor dem Assay wird folgendes vorbereitet und dann auf Eis gelegt oder gekühlt: CM-PBS (100 mg / L MgCl 2 ∙ 6H 2 O und 100 mg / l CaCl 2 in 1X PBS, pH 7,4), Biotinpuffer (0,5 Mg / ml Sulfo-NHS-LC-Biotin in CM-PBS), Quenchpuffer (50 mM NH 4 Cl in CM-PBS), Lysepuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM Glycin, 150 mM NaCl und 5 mM) EDTA, 1% Triton X-100, 1X Protease-Inhibitor-Cocktail), 3X-Beladungspuffer (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% Glycerin, 300 mM DTT und 0,01% Bromphenolblau) und Waschpuffer (10 mM Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1X Protease-Inhibitor-Cocktail).
- RemOve Speisen, die die Astrozytenkulturen aus dem Inkubator halten und das Medium verwerfen.
- Waschen Sie die Zellen dreimal mit 4 ml gekühltem CM-PBS und legen Sie das Geschirr auf zerkleinertes Eis.
- Pipettieren Sie 2 mL Biotin Puffer in jede Vertiefung, und sanft kippen Gerichte hin und her ein paar Mal, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten. Verlassen auf Eis für 30 min.
- Entfernen Sie den Biotin-Puffer mit einem Aspirator und ersetzen Sie ihn mit 4 mL Quenching-Puffer. Auf Eis für 10 min verlassen.
- Aspirieren Sie den Quench-Puffer und ersetzen Sie mit einem gleichwertigen Volumen des gleichen. Wieder auf 10 Minuten auf Eis gehen.
- Verwerfen Sie den Quenchpuffer und waschen Sie die Zellen dreimal mit 4 ml gekühltem CM-PBS.
- Kratzen Sie Zellen in 1 ml gekühlte CM-PBS unter Verwendung eines Zelllifters und übertragen Sie die Suspension in das Mikrozentrifugenröhrchen.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 100 xg für 3 min. Verwerfen Sie den Überstand und re-suspendieren Sie Zellen in 500 & mgr; l Lysepuffer.
- Lassen Sie die Proben auf Eis für 30 min, Vortexen alle 5 min, oder plSie bei einem umlaufenden Rotator bei 4 ° C aufnehmen.
- Das Lysat bei 14.000 xg für 10 min bei 4 ° C zentrifugieren, um jegliches Detergens-unlösliche Material zu pelletieren. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
- Sparen Sie 50 μl dieses Lysats und fügen Sie Ladepuffer hinzu. Dann durch Erhitzen auf 95 ° C im Trockenbad denaturieren; Dies ist die "Input" -Fraktion, die sowohl biotinylierte Zelloberflächenproteine als auch nicht-biotinylierte zytosolische Proteine enthält.
- Erweitern Sie die Öffnung einer Pipettenspitze, indem Sie etwa 0,5 cm Material von seinem Ende mit einer scharfen Schere abschneiden. Unter Verwendung dieser Pipettenspitze werden 75 & mgr; l Streptavidin-Agarose-Perlen (normalerweise bei 4 ° C gelagert) zum Lysat gegeben und bei 4 ° C für 3 h bei Schüttler / Wippe inkubiert.
- Da Streptavidin-Agarose häufig als eine Aufschlämmung verkauft wird, die 50% Perlen pro Volumen enthält, in einer antimikrobiellen Lösung suspendiert ist, trituriert die Aufschlämmung, um sicherzustellen, daß die KügelchenWerden gleichmäßig suspendiert und dann 150 μl der Suspension in jede Probe pipettiert.
- Pellet-Streptavidin-Agarose-Kügelchen durch Zentrifugation bei 1500 xg für 30 s bei 4 ° C.
- Sparen Sie 50 μl des Überstandes (fügen Sie den Ladungspuffer hinzu und denaturieren ihn bei 95 ° C in einem Wasserbad oder Heizblock); Dies stellt die "intrazelluläre" Fraktion dar und besteht hauptsächlich aus nicht-biotinylierten cytosolischen Proteinen.
- Die Pelletperlen in 1 ml Waschpuffer resuspendieren und 3 min bei 4 ° C schneiden. Pelletperlen (wie in Schritt 1.16) und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4x, um die unspezifische Bindung von nichtbiotinylierten zytosolischen Proteinen zu minimieren.
- Die Perlen durch Zentrifugation (1500 xg für 30 s bei 4 ° C) pelletieren und den darüber liegenden Waschpuffer verwerfen. 50 μl 1X Ladepuffer (verdünnt mit Lysepuffer) zugeben. Freisetzung von Biotin und Streptavidin aus Perlen durch Denaturierung bei 95 ° C; Diese fraktion shoSollte nur biotinylierte Zelloberflächenproteine enthalten ("Zelloberflächen" -Fraktion).
- Separate Input-, Zell-Oberfläche und intrazelluläre Fraktionen durch SDS-PAGE 13 , und analysieren durch Western Blotting 14 .
HINWEIS: Während wir in unseren Experimenten ein 4 - 20% iges Fertigteilgelenk verwendet haben, sollte ein 12 - 14% Trenngel mit einer 4% Stapelschicht (jeweils 0,1% SDS) für die in dieser Studie interessanten Proteine ausreichen. Es sollte auch ein Molekulargewichtsstandard des entsprechenden Größenbereichs verwendet werden. Beachten Sie, dass es manchmal ein beobachtbares Hochschalten in den scheinbaren Molekülmassen von biotinylierten Proteinen geben kann.
- Separate Input-, Zell-Oberfläche und intrazelluläre Fraktionen durch SDS-PAGE 13 , und analysieren durch Western Blotting 14 .
2. Bestimmung der Internalisierungsrate von Zelloberflächenproteinen in Astrozyten durch Biotinylierung
HINWEIS: Im Folgenden beschreiben wir ein typisches Puls-Chase-Biotinylierungsexperiment, das in diesem Fall verwendet wird, um die Endozytose von AQP4 in Astrozyten zu verfolgen. DiesMethode basiert auf der von Madrid et al. 15 Zu den spezialisierten Materialien gehören Sulfo-NHS-SS-Biotin, Streptavidin-Agarose-Harz, reduziertes Glutathion und Iodacetamid (siehe Tabelle der Materialien ).
- Bereiten Sie Kulturen von Mauskortikalen Astrozyten in 60-mm-Gerichten mit den Methoden vor, die im vorigen Abschnitt beschrieben wurden. Sicherstellen, dass Zellen am Tag des Assays etwa 70% konfluent sind und dass jede Schale eine äquivalente Anzahl von Zellen enthält.
- Unmittelbar vor dem Assay, folgendes vorbereiten und auf Eis geben oder kühlen: CM-PBS (100 mg / l MgCl 2 ∙ 6H 2 O und 100 mg / l CaCl 2 in 1X PBS, pH 7,4), Biotinpuffer (0,5 Mg / ml Sulfo-NHS-SS-Biotin in CM-PBS), reduzierender Puffer (50 mM reduziertes Glutathion, 75 mM NaCl und 75 mM NaOH), Quenchpuffer (50 mM Iodacetamid, 1% BSA, in CM-PBS) Lysepuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM Glycin, 150 mM NaCl und 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1X-Protease-Inhibitor-Cocktail), 3facher Beladungspuffer (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% Glycerin, 300 mM DTT und 0,01% Bromphenolblau) und Waschpuffer (10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1X Protease-Inhibitor-Cocktail).
- Bereiten Sie frisches Zellkulturmedium vor (DMEM, ergänzt mit 10% Fetal Bbovine Serum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin und 1% L-Glutamin) und legen Sie es in ein 37 ° C Wasserbad.
- Entfernen Sie Astrozytenkulturen aus dem Inkubator und saugt das Medium mit einem Aspirator an.
- Waschen Sie die Zellen dreimal mit 4 ml gekühltem CM-PBS und legen Sie das Geschirr auf zerkleinertes Eis.
- Pipettieren Sie 3 ml Biotin Puffer in jedes Gericht, neigen Sie Gerichte hin und her ein paar Mal, um sicherzustellen, dass Puffer ist gut verteilt, und lassen Sie diese auf Eis für 30 min.
- Aspirieren Sie Biotinpuffer und ersetzen Sie ihn mit 5 mL warmem Medium. Inkubieren Sie eine Kulturschale bei 37 ° C für 15 min und eine zweite Schale bei der gleichen Temperatur für 30 min. Lassen Sie ein anderes Gericht bei 46, C als 0 min Probe.
- Am Ende der Inkubationszeit, verwerfen Sie Medium und waschen Sie die Zellen dreimal mit 4 ml gekühltem CM-PBS. Pipette 6 ml reduzieren Puffer über Zellen, und verlassen auf Eis für 15 min.
- Den reduzierenden Puffer entfernen und dann mit 6 mL frischem Reduktionspuffer ersetzen. 10 Minuten auf Eis geben.
- Entfernen Sie die reduzierende Lösung und ersetzen Sie sie mit 6 mL Quenching Puffer. 15 Minuten auf Eis verlassen.
- Wiederholen Sie den Löschschritt noch einmal.
- Verwerfen Sie den Quenchpuffer und waschen Sie die Zellen dreimal mit 4 ml gekühltem PBS.
- Die Zellen in 1 ml gekühlte PBS unter Verwendung eines Zelllifters kratzen und die Suspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 100 xg für 3 min. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie Zellen in 500 μl Lysepuffer.
- Lassen Sie diese auf Eis für 30 min und vortex alle 5 min. Alternativ legen Sie die Proben auf einen End-Over-End-Rotator bei 4 ° C für diese Dauer.
- Zentrifuge die lySate bei 14.000 xg für 10 min bei 4 ° C, um die Detergenz-unlöslichen Materialien zu pelletieren, dann den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Sparen Sie 50 & mgr; l dieses Lysats, fügen Sie Ladepuffer hinzu und denaturieren bei 95 ° C in einem Trockenbad; Dies ist die "Input" -Fraktion, die sowohl biotinylierte endozytose Proteine als auch nichtbiotinylierte Proteine enthält.
- Unter Verwendung einer geschnittenen Pipettenspitze werden 150 & mgr; l der Streptavidin-Agarose-Aufschlämmung dem Lysat zugesetzt und bei 4 ° C für 3 h bei Shaker / Rocker inkubiert. Weitere Einzelheiten zu diesem Schritt finden Sie unter 1.15.
- Pellet-Streptavidin-Agarose-Kügelchen durch Zentrifugation bei 1.500 xg für 30 s bei 4 ° C.
- Resspend Perlen in 1 ml Waschpuffer und Fels für 3 min bei 4 ° C. Pelletperlen (nach Schritt 2.18) und verwerfen den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4x, um die unspezifische Bindung von nichtbiotinylierten zytosolischen Proteinen zu minimieren.
- Pelletperlen durch Zentrifugation bei 1500 xg für 30 s bei 4 ° C und entsorgenLiegenden Waschpuffer 50 μL 1X Ladepuffer (verdünnt mit Lysepuffer) zugeben. Freisetzung von Biotin und Streptavidin aus Perlen durch Denaturierung bei 95 ° C; Diese Fraktion sollte nur verinnerlichte Zelloberflächenproteine enthalten ("endozytierte" Fraktion).
- Separate Eingabe, Zelloberfläche und ungebundene Fraktionen durch SDS-PAGE 13 und analysieren durch Western Blotting 14 .
HINWEIS: Während wir in unseren Experimenten ein 4 - 20% iges Fertigteilgelenk verwendet haben, sollte ein 12 - 14% Trenngel mit einer 4% Stapelschicht (jeweils 0,1% SDS) für die in dieser Studie interessanten Proteine ausreichen. Es sollte auch ein Molekulargewichtsstandard des entsprechenden Größenbereichs verwendet werden. Beachten Sie, dass es manchmal ein beobachtbares Hochschalten in den scheinbaren Molekülmassen von biotinylierten Proteinen geben kann.
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Representative Results
Mit der Zelloberflächen-Biotinylierung zur Beurteilung der Plasmamembran-Expression von AQP4 in Astrozyten
Laminin-behandelte Astrozytenkulturen und unbehandelte Kontrollzellen wurden unter Verwendung der beschriebenen Verfahren einer Zelloberflächen-Biotinylierung unterworfen. Biotinylierte Proteine wurden mit Agarose-konjugiertem Streptavidin ausgefällt und dann über SDS-PAGE getrennt. Zelloberflächenfraktionen wurden für AQP4 und β-Dystroglycan (β-DG) als Zelloberflächen-Ladungsregelung untersucht, während die Input- und Intrazellulärfraktionen für AQP4 und β-Actin ( Abbildung 1 A ) als Beladungssteuerung geblottet wurden. Die Bandintensitäten für die Zelloberflächenfraktion wurden mittels Densitometrie quantifiziert und die AQP4-Werte für jeden Satz von Zellen wurden zunächst gegen β-DG-Werte normalisiert, und diese Verhältnisse wurden dann gegenüber denen der Kontrollzellen normalisiert. Das Histogramm ( Abbildung 1 B ) stellt die Mittelwerte ± SEM für drei unabhängige Experimente dar. Die Lamininbehandlung bewirkt im Durchschnitt einen nahezu 2fachen Anstieg der AQP4, ausgedrückt an der Zelloberfläche.
Untersuchung der endozytischen Rate von AQP4 mittels Biotinylierung
Die AQP4-Endozytose bei Astrozyten wurde über einen Zeitraum von 30 min verfolgt. Kurz gesagt wurde zuerst ein spaltbares Biotin-Analogon verwendet, um Oberflächenproteine in 3 Speisen von Astrozyten zu markieren. Die Zellen wurden auf 37 ° C für 0, 15 und 30 min verschoben, wobei die markierten Proteine internalisiert wurden. Die Markierung, die auf der Oberfläche verblieb, wurde dann unter Verwendung eines Reduktionsmittels entfernt, und endozytierte Proteine wurden mit Agarose-konjugiertem Streptavidin gefällt. Nach der Trennung über SDS-PAGE wurden diese dann für AQP4 untersucht ( Abbildung 2 A ). Die AQP4 - Werte wurden mittels Densitometrie quantifiziert und die Werte entsprechen der15 & 30 min Zeitpunkte wurden auf diejenigen für die 0 min Probe normalisiert. Das Histogramm ( Abbildung 2 B ) repräsentiert die gemittelten Werte ± SEM für vier solcher Experimente.
Abbildung 1 AQP4-Expression an der Zelloberfläche in Gegenwart von Laminin. (A) Die Zelloberflächen-, Intrazellulär- und Gesamt- (Input-) Fraktionen aus unbehandelten Astrozyten (-LN) und mit 24 nM Laminin-111 (+ LN) behandelten Astrozyten wurden für AQP4 und β-DG untersucht. (B) Histogramm, das die Unterschiede in den Zelloberflächen von AQP4-unbehandelten und mit Laminin behandelten Astrozyten veranschaulicht, die gegenüber β-DG-Werten normalisiert sind. Werte repräsentieren normalisierte mittlere Pixelintensitäten ± SEM, ausgedrückt in Bezug auf die Werte für die Kontrollzellen. Das Sternchen zeigt eine statistica anLt signifikante Zunahme der AQP4, wie durch einen zwei-tailed Student's t- test (n = 3, * p = 0,033) bestimmt. Diese Figur wurde von Tham et al. 16 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 AQP4 Internalisierung in Astrozyten (A) Proteine, die von Astrozytenkulturen bei 0, 15 und 30 min internalisiert wurden, wurden nach AQP4 untersucht. (B) Histogramm, das die Internalisierungsraten von AQP4 für 4 unabhängige Experimente zusammenfasst, normiert auf Werte für den 0-min-Zeitpunkt. Das Sternchen zeigt eine statistisch signifikante Erhöhung der AQP4-Menge an, die zwischen 15 und 30 min endozytiert wurde, wie durch ein Zwei-Schwanz bestimmtDer t- test (n = 3, * p = 0,017). (C) Wenn Glutathion verwendet wird, um die Disulfidbindung im spaltbaren Biotinanalogon zu brechen, wird der Beitrag der Zelloberfläche AQP4 zur biotinylierten Fraktion stark reduziert, was zu einem deutlichen Unterschied zwischen den 0 & 15 min Proben (C, oben links) führt ) . Wenn dieser Schritt weggelassen wird, macht das vom Zellenoberflächen-Pool ausgehende Signal die Änderung zwischen den 2 Zeitpunkten nicht nachweisbar (C, oben rechts) . Diese Figur wurde von Tham et al. 16 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Änderungen:
Da diese Verfahren für die Verwendung mit adhärenten Zellen entworfen wurden, haben wir die Verwendung von PBS mit 100 mg / l MgCl 2 ∙ 6H 2 O und angegeben
100 mg / l CaCl 2 (CM-PBS) für die Waschschritte und als Basis von bestimmten Puffern, um sicherzustellen, dass die Zellen an der Kulturoberfläche gebunden bleiben und dass Zell-Zell-Übergänge nicht unterbrochen werden. Jedoch können die Protokolle auch auf nichtadhärente Zelltypen angewendet werden, wenn die Zellen zwischen jedem Schritt des Verfahrens pelletiert werden. In diesen Fällen kann CM-PBS durch PBS ersetzt werden.
Darüber hinaus ist zu beachten, dass jede der hier genannten Bedingungen für dieses Protokoll spezifisch ist und nur als grobe Richtlinien betrachtet werden sollte, wenn die Methoden für andere Anwendungen eingesetzt werden sollen. Insbesondere sollte man selbstständig überprüfen, ob das Waschmittel-Extraktionsverfahren für die Anwendung geeignet istR-Zelltyp, und dass die Zentrifugeneinstellungen für den Zelltyp geeignet sind und für die verwendeten Streptavidin-Agarose-Perlen verwendet werden.
Schließlich, wenn es Bedenken hinsichtlich der unspezifischen Bindung und / oder des übermäßigen Hintergrunds gibt, kann man Streptavidin durch die verschiedenen anderen Avidinformen, die derzeit auf dem Markt verfügbar sind, ersetzen. Deglycosyliertes Avidin hat zum Beispiel eine signifikant geringere Affinität für Lektine und für negativ geladene Moleküle wie DNA.
Fehlersuche und Bedienelemente:
Während die in diesem Bericht überprüften Verfahren ziemlich einfach sind, sollte man sich einer Reihe von kritischen Fragen bewusst sein, die das Ergebnis des Experiments potenziell beeinflussen können. Erstens, während beide Assays stark von der membranendurchlässigen Natur der sulfatierten Biotinylierungsreagenzien abhängen, können bestimmte Bedingungen dazu führen, dass die Plasmamembran der Zellen gestört wird, was zu einem gewissen intrazellulären Protein führtIns biotinyliert Um diese Möglichkeit zu kontrollieren, wird vorgeschlagen, dass biotinylierte Fraktionen für Targets untersucht werden sollen, von denen bekannt ist, dass sie nicht an der Plasmamembran, wie β-Actin, exprimiert werden.
Man sollte darauf achten, die richtigen Lagerbedingungen für die Biotinylierungsreagenzien (typischerweise 4 oder -20 ° C, mit irgendeiner Form des Austrocknens) einzuhalten, da diese aufgrund ihrer hochsensiblen Natur sonst nicht ausfallen können. Trotzdem ist es gut, die eingabe-, biotinylierten und nichtbiotinylierten Fraktionen mit Streptavidin-HRP zu untersuchen, um festzustellen, dass die Biotinylierung tatsächlich stattgefunden hat und dass die biotinylierten Proteine effizient ausgefällt wurden (was aus der Abwesenheit eines Signals in der Nicht-biotinylierte Fraktion). Dies sollte die Beseitigung der Möglichkeit defekter Reagenzien ermöglichen.
Die Disulfidbindungsreduktion ist ein entscheidender Schritt im endozytischen Biotinylierungsverfahren, wie es sicherstelltDass nur internalisierte Proteine in der biotinylierten Fraktion isoliert werden. Die Einbeziehung von Kontrollen, bei denen das reduzierende Reagenz weggelassen wird ( Abbildung 1 C ), ermöglicht es, einen Eindruck von der Wirksamkeit der Behandlung zu gewinnen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde vom kanadischen Institut für Gesundheitsforschung PG # 20R47867 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
