Summary
Bu raporda, plazma membranında eksprese edilen proteinlerin hücre yüzeyi ekspresyonunu ve endositik hızını belirlemek için tasarlanan iki biyotinilasyona dayalı yöntemler sunulmuştur.
Abstract
Hücre yüzey proteinleri çok çeşitli fonksiyonlara aracılık eder. Çoğu durumda, faaliyetleri plazma membranındaki seviyelerini modüle eden endositik işlemlerle düzenlenir. Burada, bu süreçlerin çalışmasını kolaylaştıran 2 yöntem için ayrıntılı protokoller sunuyoruz, her ikisi de hücre yüzeyi proteinlerinin biyotinleştirilmesi ilkesine dayanmaktadır. İlki hücre yüzeyinde belirli bir proteinin göreli düzeylerinin yarı niceliksel olarak belirlenmesine izin vermek için tasarlanmıştır. İçinde hücrelerin plazma membran proteinlerinin lisin artıkları önce bir biotin kısmı ile etiketlenir. Hücreler ayrıldıktan sonra, bu proteinler daha sonra agarozla hareketsiz hale getirilen streptavidin kullanımı ile biyotin için ikinci afinitenin doğal afinitesini istifade ederek spesifik olarak çöktürülebilir. Böyle bir şekilde izole edilen proteinler daha sonra standart bir western blotlama yaklaşımı ile analiz edilebilir. İkinci yöntem, bir partikülün endositik hızını belirleme aracı sağlarAr hücre yüzeyi hedefinin belirli bir zaman süresi boyunca. Hücre yüzey proteinleri, ilk olarak, bölünebilir bir disülfid bağı içeren bir biyotin türevi ile modifiye edilir. Hücreler daha sonra biyotinlenmiş proteinlerin bir kısmının endositik alımına neden olan normal kültür koşullarına geri kaydırılır. Daha sonra, içe geçmemiş biyotin gruplarının disülfür bağları, membrana geçirimsiz redüksiyon maddesi glutatyon kullanılarak indirgenir. Bu yaklaşım vasıtasıyla, endositize proteinler izole edilebilir ve yüksek bir özgüllük derecesi ile nicelleştirilebilir.
Introduction
Hücrenin yüzeyindeki proteinler, hücre işlevini sürdürmek için merkezi rol oynarlar. Birçok durumda, bunların aktiviteleri, onları geçici olarak hücre içi bölgede tutan ya da bozunma yolları 1 , 2 , 3 , 4 , 5'e yönlendiren endositik süreçlere bağlıdır veya modüle edilir. Burada, kullanıcıya, plazma zarında eksprese edilen proteinleri ve yeni içselleştirilen proteinleri özel olarak etiketlemek ve izole etmek için tasarlanmış 2 biyotinilasyon temelli yaklaşımları vurguluyoruz. Bu yöntemlerle, ilgili herhangi bir proteinin hücre yüzeyi ekspresyonu ve endositik oranı nicelleştirilebilir, böylece düzenlenmesinin daha net bir şekilde değerlendirilmesi mümkün olur.
Bağıl hücre yüzeyi protein ekspresyonunun biyotinleme ile belirlenmesi
Eskiden H6 vitamini olarak bilinen biyotin veya vitamin B7, biyolojik moleküllerin reaktif amin, sülfhidril ve karboksil gruplarını kimyasal olarak değiştirmek için kullanılabilen küçük bir suda çözünür moleküldür. Şu anki hücre yüzey biyotinilasyon reaktiflerinin mahsulü, esas itibariyle, eksprese edilen proteinlerin lisin tortularının yan zincirlerinde bulunan aminlerle reaksiyona girmek üzere tasarlanmış biyotinin veya türevlerinin membran geçirmeyen sülfonatlanmış N-hidroksisuksinimid (sülfo-NHS) esterlerini içerir. Bunlar, bazik koşullar altında protonsuz hale geldiğinde, hücre yüzeyi, ikinci durumda, biyotin kısmı 7 ile bir amid bağı oluştururlar. Böylece, modifiye edilmiş hücre yüzeyi proteinleri, daha sonra yaklaşık olarak 10-15'lik bir ayrışma sabitiyle biyoinine bağlanan 66-69 kDa tetramerik bir protein olan avidin'i kullanarak izole edilerek Bilinen en güçlü kovalent olmayan etkileşimler , 9 .
Önceki çalışmalarda, hücre yüzeyinde protein ekspresyonunu nicelendiren bir dizi alternatif yöntem kullanılmıştır. Örneğin, ilgi konusu protein için spesifik olan floresan etiketli antikorları, ardından flüoresan mikroskopisi ile görselleştirmeyi kullanarak, geçirimsiz hale getirilmiş hücrelerin etiketlenmesi yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olmakla birlikte, hücre dışı epitoplara bağlanabilen antikorların bulunabilirliğine büyük ölçüde bağımlıdır. Daha yakın zamanlarda, asidik ortamlara maruz bırakılmaya tepkiyen pH duyarlı florofor taşıyan kimerik proteinlerin kullanılmasını içeren yöntemler de başarılı bir şekilde kullanıldı. Bununla birlikte, bu tür tahliller, genellikle, bu yapıların, ilgi proteininin doğal olarak bulunmadığı hücre çizgilerinde eksojen ifadesini içerir. Bu yaklaşımlar yine de, subselüler lokalizasyon ve ekzositik güzergah ile ilgili değerli bilgiler sağlayabilmektedirHedef protein içerir ve bu nedenle burada açıklanan biyotinilasyon temelli yaklaşımlarla bağlantılı olarak kullanılmalıdır.
Tipik bir biyotinilasyon tahlilinde hücreler ilk olarak 4 ° C PBS'de iyice yıkanır. Bu, kültür ortamı tarafından eklenen serum proteinlerinin izlerini kaldırır ve böylece bir sonraki aşamada bu miktarların fazla miktarda biyotini tüketmesini önler. Daha da önemlisi, sıcaklıktaki düşüş, endositozun önemli ölçüde yavaşlamasına neden olur. Daha sonra biyotinleme reaktifi eklenir. Daha sonra, hücreler yeniden yıkanır ve daha sonra geri kalan tüm biyotin izlerini inaktive etmek amacı olan ya glisin ya da NH4Cl içeren bir söndürme tamponu ile inkübe edilir. Daha sonra hücreler ayrıştırılır ve ardından biyotinlenmiş proteinlerin çökeltilmesi için agaroz-hareketsiz streptavidin ilave edilir. Analiz, yaygın olarak çeşitli prin bağıl hücre yüzeyi ekspresyonuna izin vererek, western blotting yoluyla gerçekleştirilirSayısallaştırılacak oteinler.
Bu tahlilin temeli nedeniyle, sadece hücre dışı çevreye maruz kalan kısımlara sahip olan proteinler ile kullanım için uygundur. Muhtemelen döngü bölgelerinde bir takım reaktif lizinlere sahip olan çok katlı transmembran proteinleri, bu yöntem için en uygun yöntemdir; tek geçişli proteinler ise biyotinilasyona daha az duyarlı olma eğilimindedir. Bu durumlarda dahi, yapısal değişiklikler veya moleküller arası etkileşimlerin belirli reaktif bölgeleri tıkayarak beklenenden düşük bir biyotinilasyon verimi oluşturması olasılığı söz konusudur.
Biyotinleme ile hücre yüzey proteinlerinin içselleştirme oranının belirlenmesi
Bu tahlilin prensipleri, bir takım istisna dışında, hücre yüzeyinde biyotinilasyon ile büyük oranda benzerdir; bunların en önemlisi, tersinir biyotinilasyon reaktiflerinin kullanılmasıdır. Biyotin grupları (bunların) disuYapılarında, indirgeyici ajanlara duyarlı bağlar bağlanır; Bu, tahlil süresi boyunca hücre içi sitelere alınan sadece hücre yüzeyi proteinlerinin biyotinile bırakılmasını sağlamak için kullanılır. Bir analiz genel olarak aşağıdaki şekilde gerçekleşir. Hücreler önce yıkanır ve soğuk reaktiflerle biyotinlenir, daha sonra 37 ° C'de hücre kültürü ortamı yeniden verilir ve hücreler kuluçka makinesine geri gönderilir; Bu etiketli hücre yüzeyi proteinlerinin endositozuna uğramasına neden olur. Zara nüfuz etmeyen indirgeyici madde glutatyon daha sonra hücre yüzeyi üzerinde kalan proteinlere bağlı olan biyotin parçalarının disülfid bağlarını kırmak için eklenir. Sonunda, bozulmuş disülfür bağları, iyodoasetamid ile reaksiyona girerek, labil tiol gruplarını tüketir ve bağların reformasyonunu önler. Daha önce olduğu gibi, hücreler daha sonra lizlenir ve etiketli proteinler streptavidin-agaroz kullanılarak çöktürülür.
Disk sınırlamalarıYöntemler arasında paylaşılan benzerlikler nedeniyle burada da geçerlidir. Buna ek olarak, bu tahlilde yer alan sıcaklık değişimlerinin, özellikle hızlı içselleştirilen veya hızla geri dönüşümlü proteinlerin olması durumunda, her zaman artışı için ne kadar proteinin sitoplazma edildiğinin tam olarak belirlenmesini engellemesi akılda tutulmalıdır. Bu nedenle tahlil, sadece endositik hızların semikantitatif bir kestirimini sağlar. Toplam iç yansıma flüoresan mikroskopisi, yüklü veziküllerin alımını izlemek ve endositoz kinetiğini daha kesin bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bu nedenle, ilgilenilen proteinin floresan etiketli kimerik yapısı bulunduğunu farz ederek, bu tahlil için çok faydalı bir tamamlayıcı madde sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Astrositlerdeki Bağıl Hücre-Yüzey Protein Ekspresyonunun Biyotinleme ile Saptanması
NOT: Burada, bu biyotinleme tekniğinin hücre geçirgen matris molekülünün laminin'in su geçirgen kanal aquaporin-4'ün (AQP4) hücre yüzeyi lokalizasyonu üzerindeki etkisinin incelenmesine uygulanışını göstermektedir. Bu deney için gereken uzmanlık gerektiren materyaller arasında sülfo-NHS-LC-biyotin ve streptavidin-agaroz reçinesi bulunur (bkz . Malzeme Tablosu ).
- Noel ve ark. 12 , tahlilden yaklaşık 2 hafta önce kortikal astrositler kültürleri hazırlayın ve bunları 75 cm2 havaleli kültür şişeleri içinde büyütün. Astrositler% 80-90 konfluent olduklarında kültür yüzeyinden% 0,05 tripsin kullanarak ayırın ve sonra 1: 3'ü geçirin.
- Deneyden 48 saat önce, hücreler tekrar% 80-90 oranında birleştiğinde, geçiş astrositleri 1: 3'ü (cKültür formatında hange) 60 mm hücre kültürü yemekleri üzerine yerleştirin, böylece deneyin gerçekleştiği gün% 70'e yakın konfluent olurlar. Hücrelerin bulaşıklar arasında eşit olarak dağıldığından emin olun.
- Testten 16 saat önce, 24 nM'lik bir nihai konsantrasyona kadar kültür ortamına pipetleyin ve 37 ° C'de inkübe edin.
- Analizden hemen önce aşağıdakileri hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin veya soğutun: CM-PBS (1X PBS, pH 7.4 içinde 100 mg / L MgCl2 · 6H20 ve 100 mg / L CaCl2), biotin tamponu (0.5 Yıkama tamponu (CM-PBS'de 50 mM NH4CI), liziz tamponu (25 mM Tris, pH 7.4, 25 mM glisin, 150 mM NaCl ve 5 mM) içeren süspanse edildi. EDTA,% 1 triton X-100, 1X proteaz inhibitörü kokteyli), 3X yükleme tamponu (150 mM Tris, pH 6.8,% 6 SDS,% 30 gliserol, 300 mM DTT ve% 0.01 bromofenol mavisi) ve yıkama tamponu Tris (pH 7.4), 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCI,% 1 Triton X-100, 1X proteaz inhibitörü kokteyli).
- remAstrosit kültürlerini kuluçka makinesinden tutan yemekler ve ortamı atın.
- Hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile yıkayın ve bulaşıkların üzerine ezilmiş buz koyun.
- Her oyuğa 2 mL biyotin tamponu pipetleyin ve tam kapsama sağlamak için yemekleri birkaç kez öne arkaya doğru yatırın. 30 dakika boyunca buzda bırakın.
- Bir aspiratör kullanarak biyotin tamponunu çıkarın ve 4 mL söndürme tamponu ile değiştirin. 10 dakika boyunca buzda bırakın.
- Söndürme tamponunu aspire edin ve eşdeğer hacim ile değiştirin. Yine buzda 10 dakika bekletin.
- Söndürme tamponunu atın ve hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın.
- Hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri 1 mL soğutulmuş CM-PBS'ye kazın ve süspansiyonu mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 3 dakika süreyle 100 xg'de santrifüj ederek pelet hücreleri. Süpernatantı atın ve hücreleri 500 μL liziz tamponu içinde yeniden süspanse edin.
- Örnekleri buzda 30 dakika bırakın, her 5 dakikada bir vorteksleyin veya plOnları uç uca rotatorda 4 ° C'de sürün.
- Herhangi bir deterjana uygun olmayan maddeleri pelet haline getirmek için lizat 14000 xg'de 10 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Bu lizatın 50 μL'ini kurtarın ve içine yükleme tamponu ekleyin. Sonra kuru bir banyoda 95 ° C'de ısıtarak denatürasyon yapın; Bu, hem biyotinlenmiş hücre yüzeyi proteinlerini hem de biyotinleştirilmemiş sitozolik proteinleri içeren "girdi" fraksiyonudur.
- Keskin bir makas kullanarak yaklaşık 0.5 cm malzeme keserek bir pipet ucunun açılmasını genişletin. Bu pipet ucu kullanarak, 75 μL streptavidin-agaroz boncuklar (normalde 4 ° C'de saklanır) lizata aktarın ve 4 ° C'de çalkalayıcı / rocker üzerinde inkübe edin.
- Streptavidin-agaroz sıklıkla hacim olarak% 50 boncuk içeren bir bulamaç olarak satılmakta, antimikrobiyal bir solüsyon içine asılmaktadır, boncuklarınEşit şekilde süspansiyon haline getirilir ve daha sonra her bir numuneye süspansiyonun 150 uL'si pipetle alınır.
- Pelet streptavidin-agaroz boncuklar, 1500 xg'de 30oC'de 4 ° C'de santrifüje edilerek toplanır.
- Süpernatanın 50 μL'ini saklayın (yükleme tamponu ekleyin ve 95 ° C'de bir su banyosu veya ısıtma bloğunda denatürasyon yapın); Bu, "hücre içi" fraksiyonu temsil eder ve esasen biyotinile edilmemiş sitozolik proteinlerden oluşur.
- 1 mL yıkama tamponunda topak haline getirilmiş boncukları tekrar süspanse edin ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca sallayın. Pellet boncukları (1.16'da olduğu gibi) ve süpernatanı atın. Nonbiotinli sitozolik proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirgemek için bu işlemi 4 kez tekrarlayın.
- Boncukları santrifüjle peletleyin (0 ° C'de 1500 xg, 4 ° C'de) ve üstteki yıkama tamponunu atın. 50 μL 1X yükleme tamponu (liziz tamponu ile seyreltilmiş) ilave edin. 95 ° C'de denatüre ederek boncuklardan biyotin ve streptavidin serbest bırakın; Bu fraksiyon shoUld sadece biyotinlenmiş hücre yüzeyi proteinleri içerir ("hücre yüzeyi" fraksiyonu).
- Giriş, hücre yüzeyi ve hücre içi fraksiyonları SDS-PAGE 13 ile ayırın ve western blot ile analiz edin 14 .
NOT: Denemelerimizde% 4-20 prekast gradyen jel kullanırken,% 4'lük istif tabakası (her biri% 0.1 SDS içeren) ile% 12-14'lük ayırıcı jel, bu çalışmada ilgilenilen proteinler için yeterlidir. Uygun boyut aralığının bir molekül ağırlığı standardı da kullanılmalıdır. Biyotinlenmiş proteinlerin görünür molekül kütlelerinde bazen gözlemlenebilir bir hızlanma olabileceğini unutmayın.
- Giriş, hücre yüzeyi ve hücre içi fraksiyonları SDS-PAGE 13 ile ayırın ve western blot ile analiz edin 14 .
2. Astrositlerdeki Hücre-Yüzey Proteinlerinin Biyotinleme ile İnsülasyon Hızının Belirlenmesi
NOT: Aşağıda, bu durumda astrositlerdeki AQP4 endositozunu izlemek için kullanılan tipik bir pulse-chase biyotinilasyon deneyini açıkladık. BuYöntemi, Madrid ve ark. Tarafından kullanılana dayanmaktadır . 15 . İhtiyaç duyulan özel malzemeler arasında sülfo-NHS-SS-biyotin, streptavidin-agaroz reçinesi, indirgenmiş glutatyon ve iyodoasetamid yer alır ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Bir önceki bölümde özetlenen yöntemleri kullanarak fare kortikal astrosit kültürleri 60 mm yemekler halinde hazırlayın. Hücrelerin, analiz gününde yaklaşık% 70 konfluent olduğundan ve her tablanın eşdeğer sayıda hücre içerdiğinden emin olun.
- Analizden hemen önce aşağıdakileri hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin veya buzdolabında saklayın: CM-PBS (1X PBS, pH 7.4'de 100 mg / L MgCl2 · 6H20 ve 100 mg / L CaCl2), biotin tamponu (0.5 (50 mM indirgenmiş glutatyon, 75 mM NaCl ve 75 mM NaOH), söndürme tamponu (50 mM iyodoasetamid,% 1 BSA, CM-PBS içinde) içeren, CM-PBS içinde% 1 mg / mL sülfo-NHS-SS-biyotin) Lizis tamponu (25 mM Tris, pH 7.4, 25 mM glisin, 150 mM NaCI ve 5 mM EDTA,% 1 triton X-100,1X protaz inhibitörü kokteyli), 3X yükleme tamponu (150 mM Tris, pH 6.8,% 6 SDS,% 30 gliserol, 300 mM DTT ve% 0.01 bromofenol mavisi) ve yıkama tamponu (10 mM Tris, pH 7.4, 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCl,% 1 triton X-100, 1X proteaz inhibitörü kokteyli).
- Taze hücre kültürü ortamı (% 10 Fetal Bbovine Serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş DMEM) hazırlayın ve 37 ° C su banyosu içine yerleştirin.
- Astrosit kültürleri inkübatörden çıkarın ve bir aspiratör kullanarak ortamı aspire edin.
- Hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile yıkayın ve bulaşıkların üzerine ezilmiş buz koyun.
- Her yemeğe 3 mL biyotin tamponu pipetleyin, tamponun iyi dağıldığından emin olmak için yemekleri birkaç kez ileri geri eğin ve 30 dakika boyunca buzda bırakın.
- Biyotin tamponunu aspire edin ve 5 mL sıcak ortamla değiştirin. Bir kültür çanağını 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin ve 30 dakika süreyle aynı sıcaklıktaki ikinci bir çanağı inkübe edin. 4'te bir tabak daha bırak6; C 0 dak.
- Kuluçka döneminin sonunda, orta atın ve hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın. Pipet 6 mL, hücreler üzerinde tamponu azaltır ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bırakın.
- İndirgeyici tamponu çıkarın ve 6 mL taze azaltıcı tamponla değiştirin. 15 dakika daha buzda bırakın.
- İndirgeyen çözeltiyi çıkarın ve 6 mL söndürme tamponuyla değiştirin. 15 dakika boyunca buzda bırakın.
- Söndürme adımını bir kez daha tekrarlayın.
- Söndürme tamponu atın ve hücreleri 4 mL soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın.
- Hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri 1 mL soğutulmuş PBS'ye kazın ve süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 3 dakika süreyle 100 xg'de santrifüj ederek pelet hücreleri. Süpernatantı atın ve hücreleri 500 uL liziz tamponuna tekrar süspanse edin.
- Buz üzerinde 30 dakika bırakın ve her 5 dakikada bir girdap yapın. Alternatif olarak, numuneleri bu süre boyunca 4 ° C'de uçtan uca bir rotasyona yerleştirin.
- Ly'yi santrifüjleyinDeterjana uygun olmayan maddeleri peletlemek için 4 ° C'de 10 dakika süreyle 14.000 xg'de sedye haline getirin, sonra süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu lizatın 50 μL'ini kurtarın, üzerine yükleme tamponu ekleyin ve kuru bir banyoda 95 ° C'de denatürasyon yapın; Bu, hem biyotinlenmiş endositlenmiş proteinleri hem de biyotinleştirilmemiş proteinleri içeren "girdi" fraksiyonudur.
- Kesilmiş bir pipet ucu kullanarak, lizata streptavidin-agaroz bulamacından 150 mcL ekleyin ve çalkalayıcı / rocker üzerinde 3 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Bu adım hakkında ek ayrıntılar için 1.15'e bakın.
- Pelet streptavidin-agaroz boncuklar 1,500 xg'de 4 ° C'de 30 saniye süreyle santrifüje edilerek toplanır.
- Boncukları 1 mL yıkama tamponuna tekrar süspansiyon haline getirin ve 3 dakika boyunca 4 ° C'de sallayın. Pellet boncukları (adım 2.18'e göre) ve süpernatanı atın. Nonbiotinli sitozolik proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirgemek için bu işlemi 4 kez tekrarlayın.
- Topak boncuklar, 30 ° C'de 1,500 xg'de, 4 ° C'de santrifüjlenerek ve ove'yi atınYanan yıkama tamponu. 50 μL 1X yükleme tamponu (liziz tamponu ile seyreltilmiş) ilave edin. 95 ° C'de denatüre ederek boncuklardan biyotin ve streptavidin serbest bırakın; Bu fraksiyon sadece içselleştirilmiş hücre yüzeyi proteinleri içermelidir ("endositoz" fraksiyonu).
- Giriş, hücre yüzeyi ve bağlanmamış fraksiyonları SDS-PAGE 13 ile ayırın ve batı lekelemesi ile analiz yapın 14 .
NOT: Denemelerimizde% 4-20 prekast gradyen jel kullanırken,% 4'lük istif tabakası (her biri% 0.1 SDS içeren) ile% 12-14'lük ayırıcı jel, bu çalışmada ilgilenilen proteinler için yeterlidir. Uygun boyut aralığının bir molekül ağırlığı standardı da kullanılmalıdır. Biyotinlenmiş proteinlerin görünür molekül kütlelerinde bazen gözlemlenebilir bir hızlanma olabileceğini unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Astrositlerdeki AQP4'ün plazma membran ekspresyonunu değerlendirmek için hücre yüzeyi biotinilasyonunun kullanılması
Laminin ile muamele edilmiş astrosit kültürleri ve muamele edilmemiş kontrol hücreleri tarif edilen yöntemler kullanılarak hücre yüzeyi biotinilasyonuna tabi tutuldu. Biyotinlenmiş proteinler, agaroz-konjuge streptavidin ile çöktürüldü ve daha sonra SDS-PAGE vasıtasıyla ayrıldı. Hücre yüzeyi fraksiyonları AQP4 ve β-distroglikan (β-DG) için bir hücre yüzeyi yükleme kontrolü için taranırken giriş ve hücre içi fraksiyonlar bir yükleme kontrolü olarak AQP4 ve β-aktin için bloke edildi (Şekil 1A). Hücre yüzeyi fraksiyonu için bant yoğunlukları dansitometri ile nicelleştirildi ve her hücre seti için AQP4 seviyeleri önce β-DG değerlerine karşı normalize edildi ve bu oranlar kontrol hücreleri için normalize edildi. Histogram ( Şekil 1 B ), üç bağımsız deney için ortalama ± SEM değerini temsil eder. Ortalama olarak laminin tedavisi, hücre yüzeyinde eksprese edilen AQP4'te yaklaşık 2X artışa neden olur.
Biyotinleme kullanarak AQP4'ün endositik hızının araştırılması
Astrositlerdeki AQP4 endositozu 30 dakikalık bir süre boyunca takip edildi. Kısaca, 3 bölünmüş astrositler içerisinde yüzey proteinlerini etiketlemek için ilk olarak bir bölünebilir biotin analoğu kullanılmıştır. Hücreler, etiketli proteinlerin içselleştirildiği sırasıyla sırasıyla 0, 15 ve 30 dakika boyunca 37 ° C'ye kaydırıldı. Yüzeyde kalmış olan etiketleme, daha sonra, bir indirgeyici madde kullanılarak kaldırıldı ve endositleştirilmiş proteinler, agaroz-konjüge streptavidin ile çöktürüldü. SDS-PAGE yoluyla ayrıldıktan sonra, bunlar AQP4 için araştırılmıştır ( Şekil 2A). AQP4 seviyeleri, yoğunluk ölçümü kullanılarak nicelleştirildi ve15 ve 30 dakikalık zaman noktaları, 0 dakikalık örneklem için normalize edildi. Histogram ( Şekil 2 B ), bu tür dört deney için ortalama ± SEM değerini temsil etmektedir.
Şekil 1 . Laminin Varlığında Hücre Yüzeyinde AQP4 Ekspresyonu. (A) 24 nM laminin-111 (+ LN) ile muamele edilmiş, muamele edilmemiş astrositlerden (-LN) ve astrositlerden alınan hücre yüzeyi, hücre içi ve toplam (Giriş) fraksiyonları, AQP4 ve β-DG için araştırılmıştır. (B) AQP4 ile muamele edilmemiş ve laminin ile muamele edilmiş astrositlerdeki hücre yüzeyi düzeylerindeki farklılıkları gösteren, β-DG seviyelerine göre normalleştirilmiş histogram. Değerler, normalleştirilmiş ortalama piksel yoğunluklarını ± kontrol hücrelerinin değerlerine göre ifade edilen SEM'i temsil etmektedir. Yıldız işareti bir istatistikayı belirtirİki uçlu Student's t- testi (n = 3, * p = 0.033) ile belirlendiği gibi, AQP4'te belirgin bir artış var. Bu rakam Tham ve diğerleri tarafından değiştirildi . 16 Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 . Astrositlerdeki AQP4 İçselleştirmesi (A) AQP4 için 0,15 ve 30 dakika astrosit kültürleri tarafından içerileştirilen proteinler araştırılmıştır. (B) 4 bağımsız deney için AQP4'ün içselleştirme oranlarını özetleyen histogram, 0 dakikalık zaman noktası için değerlere normalize edildi. Yıldız işareti, AQP4 miktarında, iki kuyruklu bir kuyruk tarafından belirlendiği üzere, 15 ila 30 dakika arasında endositize edilen istatistiksel olarak önemli bir artışa işaret etmektedirEd Öğrencinin t- testi (n = 3, * p = 0.017). (C) Glutatyon, bölünebilir biotin analogundaki disülfür bağı kırmak için kullanıldığında, hücre yüzeyi AQP4'ün biyotinlenmiş fraksiyona katkısı keskin bir şekilde azaltılır ve 0 ile 15 dakika arasındaki örnekler arasında (C, sol üstte) net bir fark oluşur ) . Bu adım atlandığında, hücre yüzeyi havuzundan kaynaklanan sinyal, 2 zaman noktası arasındaki farkı algılanmaz (C, sağ üst) gösterir . Bu rakam Tham ve diğerleri tarafından değiştirildi . 16 Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Değişiklikler:
Bu yöntemler yapışık hücrelerle birlikte kullanılmak üzere tasarlandığından, 100 mg / L MgCl2 · 6H20 ve
Yıkama basamakları için ve hücrelerin kültür yüzeyine yapışmış olmasını ve hücre-hücresi bağlantılarının bozulmamasını sağlamak için belirli tamponların tabanı olarak, 100 mg / L CaCI2 (CM-PBS). Bununla birlikte, protokoller, hücreler prosedürünün her bir adımı arasında pelet yapılıyorsa, yapışkan olmayan hücre tiplerine de uygulanabilir. Bu gibi durumlarda, CM-PBS PBS ile değiştirilebilir.
Ayrıca, burada belirtilen koşulların her biri bu protokole özgü olduğunu ve yöntemlerin diğer uygulamalar için kullanılması durumunda sadece kaba kılavuz olarak düşünülmesi gerektiğini unutmamak gerekir. Özellikle, deterjan özütleme prosedürünün kendisi için uygun olduğunu bağımsız olarak doğrulamalıdırR hücre tipinde olduğu ve santrifüj ayarlarının hücre türüne ve streptavidin-agaroz boncuklarının kullanılması için uygun olduğunu açıkladı.
Son olarak, spesifik olmayan bağlanma ve / veya aşırı geçmiş hakkında endişeler varsa, şu anda piyasada bulunan çeşitli avidin formlarıyla streptavidin yerini alabilir. Örneğin, glikosilatlanmış avidin, lektinlere ve DNA gibi negatif yüklü moleküllere karşı belirgin olarak düşük afiniteye sahiptir.
Sorun giderme ve kontroller:
Bu raporda incelenen prosedürler oldukça basit olmasına rağmen, deneyin sonucunu potansiyel olarak etkileyebilecek bir takım kritik konulara dikkat etmeliyiz. Öncelikle, her iki deney de sülfatlı biyotinleme reaktiflerinin membrana sızdırmaz nitelikte olmasına rağmen, bazı koşullar hücrelerin plazma membranının bozulmasına ve dolayısıyla bazı hücreiçi proteinininIns biyotinile edilmiştir. Bu olasılığı kontrol etmek için, biyotinlenmiş fraksiyonların plazma zarında ifade edilmeyen, β-aktin gibi hedefler için araştırılması önerilmektedir.
Biotinleme reaktifleri için uygun saklama koşullarına (tipik olarak 4 veya -20 ° C, bazı kuruma şekli ile) dikkat etmeniz gerekir, aksi takdirde yüksek duyarlılıkları nedeniyle bunlar başarısız olabilir. Bununla birlikte, biyotinilasyonun gerçekten gerçekleştiğini ve biyotinlenmiş proteinlerin etkin bir şekilde çökeltildiğini (ki bu da bir sinyalin yokluğundan anlaşılacağı üzere) girişi, biyotinlenmiş ve biyotinleştirilmemiş fraksiyonları streptavidin-HRP ile saptamak iyi bir uygulamadır Biyotin olmayan kısım). Bunu yapmak, hatalı reaktiflerin imkânsız olmasını sağlamalıdır.
Disülfid bağ indirgenmesi, endositik biyotinilasyon prosedürünün önemli bir adımıdır;Sadece içe uyarlanmış proteinlerin biyotinlenmiş fraksiyonda izole edileceğini belirtti. İndirgeyici reaktifin atlandığı kontrollerin birleştirilmesi ( Şekil 1 C ), tedavinin etkinliğini gösteren bir izlenim bırakır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu proje, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü PG # 20R47867 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
