Summary
혈장 막에서 발현 된 단백질의 세포 표면 발현 및 endocytic 속도를 결정하기 위해 고안된 두 가지의 바이오 티 닐화 기반 방법이이 보고서에 제시되어있다.
Abstract
세포 표면 단백질은 다양한 기능을 매개합니다. 많은 경우에, 그들의 활동은 원형질막에서 그들의 수준을 조절하는 endocytic 과정에 의해 조절됩니다. 여기, 우리는 세포 표면 단백질의 biotinylation의 원리를 기반으로 이러한 프로세스의 연구를 용이하게 2 가지 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 첫 번째는 세포 표면에서 특정 단백질의 상대적인 수준의 반 정량 결정을 허용하도록 설계되었습니다. 그것의 세포막 단백질의 라이신 잔기는 먼저 바이오틴 잔기로 표지됩니다. 일단 세포가 용해되면, 이들 단백질은 바이오틴에 대한 후자의 자연 친화력을 이용하여 아가로 오스 고정화 스트렙 타비 딘의 사용을 통해 특이 적으로 침전 될 수있다. 그런 방식으로 단리 된 단백질을 표준 웨스턴 블 랏팅 접근법을 통해 분석 할 수있다. 두 번째 방법은 particul의 endocytic 속도를 결정하는 방법을 제공합니다일정 시간 동안 세포 표면 표적을 감소시킨다. 세포 표면 단백질은 절단 가능한 디설파이드 결합을 포함하는 바이오틴 유도체로 먼저 변형된다. 그런 다음 세포를 정상 배양 조건으로 다시 이동시켜 비오틴 화 단백질의 일부를 엔도 사이토 (endocytic)로 흡수시킵니다. 다음으로, 멤브레인 - 불 침투성 환원제 인 글루타티온을 사용하여 비 내부화 된 바이오틴 그룹의 디설파이드 결합을 감소시킨다. 이 접근법을 통해, endocytosed protein은 분리되어 고도의 특이성으로 정량화 될 수 있습니다.
Introduction
세포 표면의 단백질은 세포 기능을 유지하는 데 중심적인 역할을합니다. 수많은 경우에, 그들의 활동은 endocytic process에 의존적이거나 세포 내 부위에서 일시적으로 sequencing하는 endocytic process에 의해 조절되거나, 분해 경로 1 , 2 , 3 , 4 , 5로 향한다. 여기에서 우리는 2 개의 biotinylation 기반 접근법을 강조하여 사용자가 원형 막에서 발현 된 단백질과 새로 내부화 된 단백질을 특이 적으로 표지하고 분리 할 수 있도록했습니다. 이 방법을 통해 관심있는 모든 단백질의 세포 표면 발현 및 endocytic 속도를 정량화 할 수 있으므로 해당 규정을보다 명확하게 평가할 수 있습니다.
biotinylation에 의한 상대 세포 표면 단백질 발현 측정
Biotin 또는 이전에 비타민 H 6 로 알려진 비타민 B7은 생물학적 분자의 반응성 아민, 설프 하이 드릴 및 카르복시기를 화학적으로 변형시키는 데 사용할 수있는 작은 수용성 분자입니다. 세포 표면 바이오시 닐화 시약의 현재 작물은 주로 표적 단백질의 라이신 잔기의 측쇄에 존재하는 아민과 반응하도록 고안된 비오틴 또는 그 유도체의 막 - 불 투과성 술 폰화 N- 히드 록시 석신이 미드 (술포 -NHS) 에스테르로 구성된다 이들이 염기성 조건 하에서 탈 양성자 화 될 때 세포 표면은 비오틴 부분과 아미드 결합을 형성한다. 따라서 변형 된 세포 표면 단백질은 avidin, biotin에 큰 친 화성을 갖는 66 - 69 kDa의 4 량체 단백질을 사용하여 분리 될 수 있으며, 약 10 -15 의 해리 상수로 후자에 결합하여 가장 강한 비공유 상호 작용 8 , 9 .
이전 연구에서 세포 표면에서 단백질 발현을 정량화하는 여러 가지 대체 방법이 사용되었습니다. 예를 들어, 형광 현미경을 통한 시각화에 이어 관심있는 단백질에 특이적인 형광 태그 항체를 사용하는 비 통과 세포의 표지는 일반적으로 사용되는 방법이지만 세포 외 에피토프에 결합 할 수있는 항체의 유용성에 크게 의존한다. 최근에, 산성 배지에 노출되는 것에 반응하는 pH 민감성 형광 단을 갖는 키메라 단백질의 사용과 관련된 방법도 성공적으로 사용되었다. 그러나, 그러한 분석은 일반적으로 관심 단백질이 본래 발견되지 않는 세포주에서 이러한 구조물의 외인성 발현을 수반한다. 그럼에도 불구하고 이러한 접근법은 세포 내 지방화 및 세포 외 경로에 관한 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다.그러므로 목적에 맞는 도구가 있다면 여기에 기술 된 biotinylation-based approach와 함께 사용해야한다.
전형적인 biotinylation 분석에서, 세포는 먼저 4 ° C PBS에서 철저히 씻어냅니다. 이것은 배양 배지에 의해 도입 된 혈청 단백질의 흔적을 제거하여 다음 단계에서 과량의 바이오틴을 소비하지 않도록합니다. 더 중요한 것은, 온도의 감소는 엔도 사이토 시스 (endocytosis)를 현저하게 감속시키는 것입니다. 이어서, 바이오틴 화 시약을 첨가한다. 다음으로, 세포를 다시 세척 한 다음 글리신 또는 NH4Cl을 포함하는 담금질 완충액 (quenching buffer)과 함께 배양한다.이 목적은 남아있는 미량의 바이오틴 잔여 물을 모두 비활성화시키는 것이다. 세포를 용해시킨 후, 아가로 오스 고정화 된 스트렙 타비 딘을 첨가하여 비오틴 화 단백질을 침전시킨다. 분석은 일반적으로 웨스턴 블 랏팅을 통해 수행되어 다양한 pr정량 될 oteins.
이 분석의 기초 때문에, 그것은 세포 외 환경에 노출 된 부분을 소유 한 단백질에만 사용하기에 적합합니다. 루프 영역 내에 다수의 반응성 라이신을 보유하고있을 가능성이있는 멀티 패스 트랜스 멤브레인 단백질이이 방법에 가장 적합하며 단일 통과 단백질은 비오틴 화에 덜 민감한 경향이있다. 이러한 경우에도, 구조적 변화 또는 분자간 상호 작용이 특정 반응성 부위를 폐쇄하여 예상보다 낮은 바이오틴 일 수율을 초래할 가능성이있다.
biotinylation에 의한 세포 표면 단백질의 internalization 속도 결정
이 분석의 원리는 세포 표면 비 오티 닐화의 원리와 대체로 유사하며, 그 중 가장 중요한 것은 가역성 바이오 티 닐화 시약의 사용이다. Biotin 그룹 (이들 중)은 disu그 구조 내에서 환원제에 민감한 결합을 형성하는 결합; 이것은 분석 기간 동안 세포 내 단백질로만 포획 된 세포 표면 단백질 만 바이오틴 화 된 상태로 유지되도록하기 위해 이용됩니다. 분석은 일반적으로 다음과 같은 방식으로 수행됩니다. 세포를 먼저 세척하고 차가운 시약으로 바이오 티 닐화 한 다음 37 ° C에서 세포 배양 배지를 다시 넣고 배양기로 되돌립니다. 이것은 표식 된 세포 표면 단백질이 엔도 사이토 시스를 일으키는 원인이된다. 막을 통과 할 수없는 환원제 글루타티온을 첨가하여 세포 표면에 남아있는 단백질에 붙어있는 비오틴 부분의 디설파이드 결합을 깨뜨린다. 마지막으로, 파괴 된 디설파이드 결합은 요오도 아세트 아미드와 반응하여 불안정한 티올 그룹을 소비하고 결합이 개질되는 것을 방지한다. 이전과 마찬가지로 세포를 용해시키고 스트렙 타비 딘 - 아가로 오스를 사용하여 표지 단백질을 침전시킵니다.
한계 디스크이전 섹션에서 사용 된 것은 또한 메소드간에 공유되는 유사성 때문에 여기에 적용됩니다. 또한,이 분석에 포함 된 온도 변화가 시간의 각 증대에 대해 얼마나 많은 단백질이 endocytosed되는지를 정확히 결정하는 것을 방지 할 가치가 있습니다. 특히 빠르게 내부화되거나 급속히 재활용되는 단백질의 경우 더욱 그렇습니다. 따라서 분석법은 endocytic rate의 반 정량적 평가만을 제공합니다. 총 내부 반사 형광 현미경 검사는 각로드 된 소포의 섭취를 추적하고 엔도 사이토 시스의 동역학에 대한보다 정확한 측정을 제공하는 데 사용될 수 있습니다. 따라서 관심있는 단백질의 형광 표식 된 키메라 구조가 이용 가능하다고 가정하여이 분석에 매우 유용한 보완 물을 제공 할 수 있습니다 11 .
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Protocol
1. Biotinylation에 의한 astrocytes의 상대 세포 표면 단백질 발현 결정
참고 : 여기, 우리는 물 투과성 채널 aquaporin - 4 (AQP4)의 세포 - 표면 지방화에 세포 외 매트릭스 분자 laminin의 효과 연구에이 biotinylation 기술의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 분석에 필요한 특수 물질에는 sulfo-NHS-LC-biotin 및 streptavidin-agarose 수지가 포함됩니다 ( 표 참조).
- Noel et al. 12 , 분석에 앞서 약 2 주 전에 대뇌 피질의 성상 교세포의 배양 물을 준비하고, 75 cm 2 통기 배양 플라스크에서 성장시킨다. 성상 교세포가 80-90 % 융합 성일 때 0.05 % 트립신을 사용하여 배양 물 표면에서 분리 한 다음 1 : 3으로 통과시킵니다.
- 분석 48 시간 전에, 세포가 다시 80-90 %의 합류가되었을 때, 통과 성상 교세포 1 : 3 (c60 mm 세포 배양 접시에 배양하여 실험을 수행 할 날이> 70 % 이상이되도록하십시오. 세포가 접시 사이에 균등하게 분배되도록하십시오.
- 16 시간 전에, 24nM의 최종 농도로 배양 배지에 피펫 라미네이트를 넣고 37 ° C에서 배양한다.
- CM-PBS (1X PBS에 100mg / L MgCl 2 · 6H 2 O 및 100mg / L CaCl 2 ), 비오틴 완충액 (0.5 (1))을 다음과 같이 준비하고 즉시 냉장하거나 냉장고에 보관한다. CM-PBS 중 50 mM NH4Cl), 완충 완충액 (25 mM Tris, pH 7.4, 25 mM 글리신, 150 mM NaCl 및 5 mM) EDTA, 1 % 트리톤 X-100, 1X 프로테아제 억제제 칵테일), 3X 로딩 버퍼 (150mM 트리스, pH 6.8, 6 % SDS, 30 % 글리세롤, 300mM DTT 및 0.01 % 브로 모 페놀 블루) 트리스 (pH 7.4), 1.5mM EDTA, 150mM NaCl, 1 % 트리톤 X-100, 1X 프로테아제 억제제 칵테일).
- 렘인큐베이터에서 성상 세포 배양 물을 보유하고있는 배불뚝과 접시를 버리고 배지를 폐기하십시오.
- 4 ML 냉장 CM - PBS로 세 번 세포를 씻어서, 짓 눌린 얼음에 요리를 놓습니다.
- 각 잘 2mL 비오틴 버퍼를 피펫과 부드럽게 요리를 앞뒤로 여러 번 전체 범위를 보장하기 위해 기울입니다. 30 분 동안 얼음 위에 두십시오.
- aspirator를 사용하여 biotin 버퍼를 제거하고 4 ML 퀸 치 버퍼로 교체하십시오. 10 분 동안 얼음 위에 두십시오.
- 담금질 완충액을 대기음으로 바꾸고 동등한 부피로 교체하십시오. 다시 얼음에 10 분 동안 두십시오.
- 담금질 완충액을 버리고 4 mL의 냉각 된 CM-PBS로 세 번 세포를 씻는다.
- 셀 리프터를 사용하여 1 ML 냉장 CM - PBS에 세포를 긁어 내고, microcentrifuge 튜브에 현탁액을 전송합니다.
- 100 Xg에서 3 분간 원심 분리하여 펠렛 세포. 뜨는을 폐기하고, 500 μl의 용해 완충액에 세포를 다시 현탁하십시오.
- 얼음 위에 30 분 동안 샘플을 놓고 5 분마다 볼 텍싱하거나 pl4 ° C에서 엔드 오버 (end-over-end) 회 전자에 올려 놓습니다.
- l 세제를 4 ℃에서 14,000 xg으로 10 분간 원심 분리하여 세제에 용해되지 않는 물질을 펠렛으로 만든다. 뜨는 물을 새로운 미세 원심 분리 튜브에 옮긴다.
- 이 용 해물 50 μL를 저장하고 거기에 로딩 완충액을 첨가하십시오. 그런 다음 건조한 배쓰에서 95 ° C로 가열하여 변성시킵니다. 이것은 biotinylated 세포 표면 단백질뿐만 아니라 비 biotinylated cytosolic 단백질을 모두 포함하는 "입력"분수입니다.
- 날카로운 가위를 사용하여 끝 부분에서 약 0.5cm의 재료를 잘라서 피펫 팁을여십시오. 이 피펫 팁을 사용하여 75 μL의 streptavidin-agarose beads (일반적으로 4 ° C에서 보관)를 lysate에 옮기고 4 ° C에서 3 시간 동안 배양기 / 로커에서 배양합니다.
- streptavidin-agarose는 항균 용액에 부피가 50 % 인 슬러리로 자주 판매되므로 슬러리를 분쇄하여 비드균등하게 정지시킨 후 현탁액 150 μL을 각 시료에 피펫 팅합니다.
- 4 ° C에서 30 초 동안 1500 xg에서 원심 분리하여 pellet streptavidin-agarose beads.
- 뜨는 50 μL를 저장 (로딩 버퍼를 추가하고 수 욕조 또는 가열 블록에서 95 ° C에서 변성); 이것은 "세포 내"분획을 나타내며 주로 비 바이오틴 일화 된 세포질 단백질로 구성됩니다.
- 1 ML 세척 버퍼에 pelleted 구슬을 Resuspend, 그리고 4에서 3 분 바위 ° C. 펠렛 구슬 (단계 1.16에서와 같이)을 제거하고 상등액을 버립니다. Nonbiotinylated cytosolic 단백질의 비 특정 결합을 최소화하기 위해이 과정을 4 회 반복하십시오.
- 원심 분리 (4 X에서 30 초 1500 XG)에 의해 구슬을 펠렛, 그리고 overlying 세척 버퍼를 폐기하십시오. 1X 로딩 버퍼 (용해 버퍼를 사용하여 희석) 50 μL를 추가합니다. 95 ℃에서 변성시켜 비드로부터 비오틴 및 스트렙 트 아비딘을 방출; 이 분수uld는 biotinylated 세포 표면 단백질 만 ( "세포 표면"분수)가 포함되어 있습니다.
- SDS-PAGE 13으로 입력, 세포 표면 및 세포 내 분획을 분리하고 Western blotting으로 분석하십시오.
참고 : 우리는 실험에서 4-20 % 프리 캐스트 그라디언트 젤을 사용했지만,이 연구에서 관심있는 단백질에 대해서는 4 % 스태킹 레이어 (각각 0.1 % SDS 함유)가 12-14 %의 분리 겔이면 충분합니다. 적절한 크기 범위의 분자량 표준도 사용해야합니다. 비 오티 닐화 단백질의 겉보기 분자량에서 관찰 가능한 상승 변화가있을 수 있음을 주목하십시오.
- SDS-PAGE 13으로 입력, 세포 표면 및 세포 내 분획을 분리하고 Western blotting으로 분석하십시오.
2. Biotinylation에 의한 astrocytes의 세포 표면 단백질의 내부화 속도 결정
참고 : 다음은 우리가 astrocytes에서 AQP4의 endocytosis를 추적하기 위해이 예제에서 사용되는 일반적인 펄스 체이스 biotinylation 실험을 설명합니다. 이방법은 마드리드 (Madrid) 등 이 사용한 방법을 기반으로합니다 . 15 . 필요한 특수 물질에는 sulfo-NHS-SS- 바이오틴, 스트렙 타비 딘 - 아가로 오스 수지, 환원 글루타티온 및 요오드 아세트 아미드가 포함됩니다 ( 표 참조).
- 이전 섹션에서 설명한 방법을 사용하여 60mm 요리에서 마우스 대뇌 피질 성의 astrocytes의 문화를 준비합니다. 분석 당일 약 70 %의 세포가 합류하는지, 그리고 각 접시에는 같은 수의 세포가 들어 있는지 확인하십시오.
- CM-PBS (1X PBS, pH7.4에 100 mg / L MgCl 2 · 6H 2 O 및 100 mg / L CaCl 2 ), 비오틴 완충액 (0.5 CM-PBS 중 50 mM 요오도 아세트 아미드, 1 % BSA)를 급냉시키는 완충액 (50 mM 환원 된 글루타티온, 75 mM NaCl 및 75 mM NaOH), CM-PBS 중 sulfo-NHS- 용해 완충액 (25 mM Tris, pH 7.4, 25 mM 글리신, 150 mM NaCl 및 5 mM EDTA, 1 % triton X-100, 1X 프로테아제 억제제 칵테일), 3X 로딩 버퍼 (150mM 트리스, pH 6.8, 6 % SDS, 30 % 글리세롤, 300mM DTT 및 0.01 % 브로 모 페놀 블루) 및 세척 완충액 (10mM Tris, pH 7.4, 1.5mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % triton X-100, 1X 프로 테아 제 억제제 칵테일).
- 신선한 세포 배양 배지 (10 % 태아 Bbovine 세럼 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % L - 글루타민으로 보충 DMEM)를 준비하고 37 ° C 수 욕조에 놓으십시오.
- 인큐베이터에서 astrocyte 문화를 제거하고 aspirator를 사용하여 매체를 대기음.
- 4 ML 냉장 CM - PBS로 세 번 세포를 씻어서, 짓 눌린 얼음에 요리를 놓습니다.
- 각 접시에 3 ML 비오틴 버퍼를 피펫, 버퍼가 잘 분산되도록 앞뒤로 요리를 기울이 30 분 동안 얼음에두고.
- 바이오틴 버퍼를 대기음 5 ML 따뜻한 매체로 교체하십시오. 37 ° C에서 문화 요리를 품어 15 분 동안 동일한 온도에서 두 번째 접시 30 분. 4시에 다른 요리를 남겨주세요.6 분, 0 분 샘플로 C.
- 잠복기가 끝나면 배지를 버리고 4 mL의 냉각 된 CM-PBS로 세 번 세포를 씻어 낸다. 세포에 6 mL의 환원 완충액을 피펫에 넣고 15 분 동안 얼음 위에 놓습니다.
- 환원 완충액을 제거한 후 6 mL 신선한 환원 완충액으로 교체하십시오. 추가 15 분 동안 얼음에 놓으십시오.
- 환원 용액을 제거하고 6 mL 급냉 완충액으로 교체하십시오. 15 분 동안 얼음에 두십시오.
- 한번 더 급냉 단계를 반복하십시오.
- 퀀칭 버퍼를 버리고 4 mL의 냉각 된 PBS로 세 번 세포를 씻으십시오.
- 세포 기중 장치를 사용하여 1 ML 냉장 PBS로 세포를 긁어 내고, microcentrifuge 튜브에 현탁액을 전송하십시오.
- 100 Xg에서 3 분간 원심 분리하여 펠렛 세포. 뜨는을 버리고 500 μL 용해 버퍼에 세포를 resuspend.
- 얼음에 30 분 동안두고 5 분마다 와동을 남긴다. 또는이 샘플을 4 ℃에서 end-over-end rotator에 놓습니다.
- 원심 분리기4 ℃에서 10 분간 14,000 xg로 세제 불용성 물질을 펠렛 화 한 후, 상등액을 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮긴다. 이 용 해물 50 μL를 저장하고 로딩 완충액을 넣고 95 ° C에서 건조한 욕조에서 변성시킵니다. 이것은 비 바이오틴 이식 된 단백질뿐만 아니라 비오틴 화 된 엔도 싸이 티드 (endocytosed) 단백질을 모두 포함하는 "입력"분획입니다.
- 컷 피펫 팁을 사용하여 lysate에 streptavidin - 아가로 오스 슬러리 150 μL를 추가하고 4 ° C에서 3 시간 동안 배양기 / 로커에서 배양하십시오. 이 단계에 대한 자세한 내용은 1.15를 참조하십시오.
- 4 ° C에서 30 초 동안 1,500 xg에서 원심 분리하여 pellet streptavidin-agarose beads.
- 1 ML 세척 버퍼에 Resuspend 구슬과 4에서 3 분 동안 바위 ° C. 펠렛 구슬 (단계 2.18에 따라)을 제거하고 상등액을 버린다. Nonbiotinylated cytosolic 단백질의 비 특정 결합을 최소화하기 위해이 과정을 4 회 반복하십시오.
- 4 ° C에서 30 초 동안 1,500 xg에서 원심 분리하여 펠렛 비즈세척 버퍼. 50 μL 1X 로딩 버퍼 (용해 버퍼를 사용하여 희석)를 추가합니다. 95 ℃에서 변성시켜 비드로부터 비오틴 및 스트렙 타비 딘을 방출; 이 분획에는 내부화 된 세포 표면 단백질 만 포함되어야합니다 ( "엔도 사이트 화 된 분획").
- SDS-PAGE 13으로 입력, 세포 표면 및 결합되지 않은 분획을 분리하고, 웨스턴 블 럿팅으로 분석하십시오 14 .
참고 : 우리는 실험에서 4-20 % 프리 캐스트 그라디언트 젤을 사용했지만,이 연구에서 관심있는 단백질에 대해서는 4 % 스태킹 레이어 (각각 0.1 % SDS 함유)가 12-14 %의 분리 겔이면 충분합니다. 적절한 크기 범위의 분자량 표준도 사용해야합니다. 비 오티 닐화 단백질의 겉보기 분자량에서 관찰 가능한 상승 변화가있을 수 있음을 주목하십시오.
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Representative Results
세포 표면 biotinylation을 사용하여 성상 교세포에서 AQP4의 원형질막 발현을 평가
라미닌 - 처리 된 성상 교세포 배양 물 및 미처리 된 대조군 세포를 기술 된 방법을 사용하여 세포 - 표면 바이오틴 일화시켰다. 바이오 티 닐화 된 단백질을 아가 로즈 - 결합 된 스트렙 타비 딘으로 침전시킨 다음, SDS-PAGE로 분리 하였다. 세포 표면 분획을 AQP4와 β-Dystroglycan (β-DG)에 대해 세포 표면 부하 대조군으로 조사하였고, 입력 및 세포 내 분획을 AQP4와 β-actin에 대하여 블로 팅 하였다 ( 도 1A ). 세포 표면 분획에 대한 밴드 강도를 농도계를 통해 정량화하고, 각 세포 세트의 AQP4 수준을 먼저 β-DG 값에 대해 표준화하고, 이들 비를 대조군 세포에 대해 표준화 하였다. 히스토그램 ( 그림 1 B )는 세 번의 독립적 인 실험에 대한 평균값 ± SEM을 나타낸다. 라미닌 치료는 평균적으로 세포 표면에서 발현되는 AQP4가 2 배 가까이 증가합니다.
biotinylation을 사용하여 AQP4의 endocytic 속도를 조사
성상 교세포의 AQP4 엔도 시토 시스는 30 분에 걸쳐 추적되었다. 간략하게, 절단 가능한 바이오틴 유사체를 먼저 성상 교세 (astrocytes) 3 접시에서 표면 단백질을 표지하기 위해 사용 하였다. 세포를 각각 0, 15 및 30 분 동안 37 ℃로 옮겼는데, 그 동안 표지 된 단백질이 내면화되었다. 이어서 표면에 남아있는 표지를 환원제를 사용하여 제거하고, endocytosed protein을 agarose-conjugated streptavidin으로 침전시켰다. SDS-PAGE를 통한 분리 후, 이들을 AQP4에 대해 조사 하였다 ( 도 2A ). AQP4 수준은 농도계를 사용하여 정량화되었으며,15 분 및 30 분의 시간 포인트는 0 분 샘플의 시간 포인트로 표준화되었다. 막대 그래프 ( 그림 2B )는 4 회의 실험에 대한 평균값 ± SEM을 나타냅니다.
그림 1 . 라미닌의 존재하에 세포 표면에서의 AQP4 발현 (A) 24nM laminin - 111 (+ LN)로 치료 한 성상 교세포 (-LN)와 성상 교세포의 세포 표면, 세포 내 및 총 (입력) 분획을 AQP4와 β-DG에 대하여 조사 하였다. (B) AQP4 및 laminin 처리 astrocytes의 세포 표면 수준의 차이를 보여주는 히스토그램. 베타 - DG 수준에 대해 정상화. 값은 표준화 평균 픽셀 강도 ± SEM을 나타내며, 대조군 세포에 대한 값과 관련하여 표시됩니다. 별표는 통계를 나타냅니다.두 꼬리 학생의 t 검사 (n = 3, * p = 0.033)에 의해 결정된 AQP4의 유의 한 증가. 이 수치는 Tham et al. 16 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 . 성상 교세포에서의 AQP4 내재화 (A) 0, 15, 30 분에서 성상 교세포 배양에 의해 내재화 된 단백질을 AQP4에 대해 조사 하였다. (B) 4 분의 독립적 인 실험을위한 AQP4의 내부화 속도를 요약 한 히스토그램. 0 분 시점에 대한 값에 대해 정규화. 별표는 양측 꼬리에 의해 결정된 15 & 30 분 사이에 endocytosed AQP4 양의 통계적으로 의미있는 증가를 나타냅니다학생의 t- 검사 (n = 3, * p = 0.017). (C) 글루타티온이 절단 가능한 바이오틴 유사체의 디설파이드 결합을 파괴하기 위해 사용될 때, 바이오틴 일화 된 분획에 대한 세포 표면 AQP4의 기여는 급격히 감소되어, 0 분 및 15 분 샘플 사이의 명확한 차이가 발생한다 (C, 좌상단 ) . 이 단계를 생략하면 셀 표면 수영장에서 발생한 신호가 두 시간 지점 사이의 변화를 감지 할 수 없게됩니다 (C, 오른쪽 상단) . 이 수치는 Tham et al. 16 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
수정 :
이 방법은 접착 세포에 사용하기 위해 고안 되었기 때문에 100 mg / L MgCl 2 · 6H 2 O를 함유 한 PBS와
100 mg / L CaCl 2 (CM-PBS)를 세척 단계 및 세포가 배양 표면에 부착 된 채로 유지되도록하고 세포 - 세포 접합부가 파괴되지 않도록하기 위해 특정 완충액의 기제로 사용한다. 그러나, 프로토콜은 절차의 각 단계 사이에 세포가 pelleted 경우 nonadherent 세포 유형에 적용 할 수 있습니다. 이 경우, CM-PBS는 PBS로 대체 될 수 있습니다.
또한 여기에 언급 된 각 조건은이 프로토콜에만 해당되므로이 방법을 다른 응용 프로그램에 적용하려면 대략적인 지침으로 간주해야합니다. 특히 세제 추출 절차가 thei에 적합한지를 독자적으로 검증해야합니다r 세포 유형, 그리고 원심 분리기 설정이 세포 유형에 적합하고 스트렙 타비 딘 - 아가로 오스 비드가 사용됨을 의미합니다.
마지막으로, 비특이적 결합 및 / 또는 과도한 배경에 관한 우려가있는 경우, 스트렙 타비 딘을 시장에서 현재 이용 가능한 다양한 다른 아비딘 형태로 대체 할 수있다. 예를 들어, 탈 글리콜 화 된 아비딘은 렉틴 및 DNA와 같은 음으로 하전 된 분자에 대해 상당히 낮은 친화도를 갖는다.
문제 해결 및 제어 :
이 보고서에서 검토 한 절차는 매우 간단하지만 실험 결과에 잠재적으로 영향을 미칠 수있는 몇 가지 중요한 문제에 유의해야합니다. 첫째, 둘 다의 분석은 황산염 화 된 바이오 티 닐화 시약의 멤브레인 - 불 침투성 성질에 크게 의존하지만, 특정 조건은 세포의 원형질막이 파괴되어 특정 세포 내 단백질을 생성시킬 수있다biotinylated되고 있습니다. 이러한 가능성을 제어하기 위해서는 biotinylated fraction을 β-actin과 같은 원형질막에서 발현되지 않는 것으로 알려진 표적에 대해 조사해야한다.
Biotinylation 시약 (보통 4 또는 -20 ° C, 건조의 일부 형태)의 적절한 저장 조건을 준수해야합니다. 그렇지 않으면 매우 민감한 특성으로 인해 실패 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 스트렙 타비 딘 -HRP로 입력, 바이오 티 닐화 및 비 바이오틴 화 분획을 조사하여 바이오틴 화가 실제로 일어 났는지, 바이오틴이 부착 된 단백질이 효율적으로 침전되었는지를 확인하는 것이 우수 실행 (우수성 관행은 비 바이오틴 화 분획). 그렇게하면 불량 시약의 가능성을 제거 할 수 있습니다.
디설파이드 결합 감소는 endocytic biotinylation 과정에서 중요한 단계입니다.내재화 된 단백질 만이 바이오틴 화 분획에서 분리 될 것입니다. 환원 시약이 생략 된 대조군을 통합하면 ( 그림 1 C ) 치료의 효능에 대한 인상을 얻을 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 아무런 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 Canadian Institute of Health Research PG # 20R47867에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
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