Summary
В этом протоколе описывается, как проводить автоматические эксперименты по патч-зажимам с использованием изображений с использованием системы, недавно разработанной для стандартного электрофизиологического оборудования in vitro .
Abstract
Цельноклеточный патч-зажим является золотым стандартным методом для измерения электрических свойств отдельных клеток. Тем не менее, патч-фиксатор in vitro остается сложной и малопроизводительной техникой из-за ее сложности и высокой зависимости от работы и управления пользователем. В этой рукописи демонстрируется автоматическая система патч-фиксации, управляемая ими, для экспериментов с целыми клеточными зажимами in vitro в острых срезах мозга. Наша система реализует алгоритм, основанный на компьютерном зрении, для обнаружения флюоресцентно меченых ячеек и нацеливания на их полностью автоматическое исправление с использованием микроманипулятора и внутреннего контроля давления пипетки. Весь процесс очень автоматизирован, с минимальными требованиями к вмешательству человека. Экспериментальная информация в режиме реального времени, включая электрическое сопротивление и внутреннее давление пипетки, документируется в электронном виде для будущего анализа и оптимизации для разных типов ячеек. Хотя наша система описывается в контексте острого braiN, она также может быть применена к автоматизированному патч-клипу с ориентацией на изображение диссоциированных нейронов, органотипических культур срезов и других типов нейнерональных клеток.
Introduction
Техника патч-зажима была впервые разработана Нехером и Сакманом в 1970-х годах для изучения ионных каналов возбудимых мембран 1 . С тех пор патч-зажим был применен к изучению многих разных субъектов на клеточном, синаптическом и контурном уровне - как in vitro, так и in vivo - во многих разных типах клеток, включая нейроны, кардиомиоциты, ооциты Xenopus и искусственные липосомы 2 , Этот процесс включает в себя правильную идентификацию и нацеливание ячейки, представляющей интерес, сложное управление микроманипулятора для перемещения пипетки патча в непосредственной близости от клетки, применение положительного и отрицательного давления к пипетке в надлежащее время для создания плотного гигасеального пластыря, И взлом, чтобы установить конфигурацию патчей цельной ячейки. Зажим патча, как правило, проводится вручную и требует обширного обучения. Даже для исследователя, испытывающего патчЗажим, уровень успеха относительно низок. Совсем недавно было предпринято несколько попыток автоматизировать эксперименты по патч-зажимам. Для достижения автоматизации были разработаны две основные стратегии: расширение стандартного оборудования для зажима патчей для обеспечения автоматического контроля процесса исправления и разработки нового оборудования и технологий с нуля. Бывшая стратегия адаптируется к существующим аппаратным средствам и может использоваться в различных приложениях патч-зажима, в том числе in vivo слепой патч-зажим 3 , 4 , 5 , патч-зажим in vitro острых срезов головного мозга, органотипические срезы кусочков и культивированные диссоциированные нейроны 6 , Это позволяет проводить опрос сложных локальных схем с одновременным использованием нескольких микроманипуляторов. 7 . Метод планарных патчей является примером новой стратегии разработки, которая может обеспечить одновременное выполнение высокопроизводительной pФиксация клеток в суспензии для скрининга наркотиков 8 . Однако метод планарных пятен не применим ко всем типам клеток, особенно к нейронам с длинными процессами или целыми цепями, содержащими обширные соединения. Это ограничивает его применение для картирования сложных схем нервной системы, что является ключевым преимуществом традиционной технологии патч-зажима.
Мы разработали систему, которая автоматизирует процесс ручного патч-клеща in vitro , дополняя стандартное аппаратное обеспечение патча. Наша система, Autopatcher IG, обеспечивает автоматическую калибровку пипетки, идентификацию целевых ячеек флуоресцентных клеток, автоматическое управление перемещением пипетки, автоматическое клонирование целых ячеек и регистрацию данных. Система может автоматически получать множественные изображения срезов мозга на разных глубинах; Анализировать их с помощью компьютерного зрения; И извлекают информацию, включая координаты флюоресцентно меченных клеток. Затем эта информация может бытьИспользуется для таргетинга и автоматического исправления интересующих ячеек. Программное обеспечение написано на Python - свободном языке программирования с открытым исходным кодом - с использованием нескольких библиотек с открытым исходным кодом. Это обеспечивает его доступность для других исследователей и улучшает воспроизводимость и строгость экспериментов по электрофизиологии. Система имеет модульную конструкцию, так что дополнительное оборудование может быть легко сопряжено с текущей системой, продемонстрированной здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Настройка системы
- Постройте блок управления давлением.
- Соберите блок управления давлением в соответствии с картой схемы ( рис. 1 ). Припаяйте необходимые детали к печатной плате (PCB), изготовленной в соответствии с схемами электрических схем ( рис. 1b ). Используйте стандартные резисторы, светодиоды, полупроводниковые транзисторы с полевым эпитаксием (MOSFET), конденсаторы и разъемы (см. Таблицу материалов ). Припаяйте электромагнитные клапаны к печатной плате. Подключите воздушный насос и датчик давления воздуха к печатной плате с помощью электрического провода.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для создания блока управления давлением необходимо сделать около 2 часов со всеми необходимыми деталями.
- Соберите блок управления давлением в соответствии с картой схемы ( рис. 1 ). Припаяйте необходимые детали к печатной плате (PCB), изготовленной в соответствии с схемами электрических схем ( рис. 1b ). Используйте стандартные резисторы, светодиоды, полупроводниковые транзисторы с полевым эпитаксием (MOSFET), конденсаторы и разъемы (см. Таблицу материалов ). Припаяйте электромагнитные клапаны к печатной плате. Подключите воздушный насос и датчик давления воздуха к печатной плате с помощью электрического провода.
- Подключите плату вторичного сбора данных (DAQ).
- Подключите выходные данные данных от печатной платы к плате DAQ, следуя таблице 1 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Плата DAQ wilЯ работаю в режиме «Односторонний». Карту порта можно найти в руководстве пользователя (см. Таблицу ). - Подключите «AIn Pr S» к одному из каналов аналогового входа (AI) и «R-Gr» к одному из аналоговых оснований на вторичной плате DAQ.
- Подключите первичный выход усилителя к одному из каналов AI и заземлению к аналоговому заземлению вторичной платы DAQ.
ПРИМЕЧАНИЕ. Стандартный кабель BNC можно использовать для подключения первичного выхода усилителя. - Слейте другой конец и соедините положительный сигнал ( например, медный сердечник) с каналом AI и землей ( т. Е. Тонким проводом вокруг сердечника) с аналоговым заземлением. Повторите этот шаг для второго канала, если используется более одного канала патча.
ПРИМЕЧАНИЕ. Аналоговый вход на плату DAQ будет настроен на следующих этапах. - Подключите питание к выходной мощности вторичной платы DAQ. Используйте отдельную мощность 12 В, поэтомуДля насоса.
- Подключите выходные данные данных от печатной платы к плате DAQ, следуя таблице 1 .
- Подключите трубку.
- Подсоедините воздушный насос и два клапана в соответствии с таблицей 2 . Используйте 3-контактный разъем для соединения мягкой трубки с верхним портом клапана 2, датчиком давления и держателем пипетки на последнем шаге.
- Добавьте еще один 3-контактный разъем к трубке, подключенной к держателю пипетки, если используются две пипетки. Вручную переключайтесь между клапанами и пипетками, которые используются при патче.
- Установите Autopatcher IG.
ПРИМЕЧАНИЕ. Системное требование: Autopatcher IG тестировался только на ПК под управлением Windows 7. Он не был проверен для других операционных систем. Описанная процедура применяется конкретно к аппаратным средствам, перечисленным в Таблице материалов.- Загрузите Autopatcher-IG из GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
- Установите Python (см. Таблицу материалов для версии и адреса загрузки).
- Удалите PyQt4Библиотеки, набрав «pip uninstall PyQt4» в терминале командной строки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для обеспечения совместимости с библиотеками Qwt и Opencv система использует устаревшую версию библиотеки PyQt4. - Установите библиотеки Python из исторических файлов колес (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Найдите следующие файлы: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) и Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
- Чтобы установить файлы колес, перейдите в каталог, где хранятся файлы, и введите «pip install *** wheelfilename ***. Whl.». Замените «*** wheelfilename ***» с фактическим именем файла.
ПРИМЕЧАНИЕ: «cp27» в названии файла колеса указывает Python 2.7, а «win32» указывает на 32-битную Windows. Если «win32» не работает, попробуйте «win64».
- Чтобы установить файлы колес, перейдите в каталог, где хранятся файлы, и введите «pip install *** wheelfilename ***. Whl.». Замените «*** wheelfilename ***» с фактическим именем файла.
- Чтобы управлять камерой CCD, загрузите и установите установщикДля 64-битного (https://www.qimaging.com/support/software/). Затем загрузите MicroManager для 64-битного (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) для управления камерой в Python.
- Чтобы управлять манипуляторами и ступенью микроскопа, установите программное обеспечение для управления, предоставленное производителем.
ПРИМЕЧАНИЕ. При этом также устанавливается драйвер, необходимый для управления манипуляторами. Пакет установки обычно предоставляется на компакт-диске. - Чтобы управлять вторичной платой DAQ, установите Universal Library с компакт-диска, при условии покупки платы DAQ.
- Настройте аппаратное обеспечение для Autopatcher IG.
- Подключите ступени микроскопа и манипуляторы к компьютеру через USB-порты.
- Назначьте номера COM-порта на единицу 0: ступень микроскопа, блок 1: левый манипулятор и блок 2: правый манипулятор в этом порядке в конфигурационном файле «ports.csv» в папке «Конфигурация». LСохраняйте остальные параметры в файле portss.csv ( т.е. «SCI» и «1») без изменений.
ПРИМЕЧАНИЕ. Информацию о номере COM-порта можно найти, запустив программное обеспечение конфигурации манипулятора, предоставленное производителем. Перейдите на вкладку «Настройки», выберите «Настройки» и страницу «Движение» и прочитайте метки для каждой вкладки вверху. В качестве альтернативы эту информацию можно найти в диспетчере устройств ПК. - Назначьте номера аналоговых входных каналов на плате DAQ для датчика давления и патч-канала 1 и 2 (соответствует единицам 1 и 2). Введите номер канала в файле «DAQchannels.csv» в папке «Конфигурация».
ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуется открыть файлы .csv с помощью приложения «Блокнот» вместо электронной таблицы, так как это может изменить информацию при сохранении изменений.
- Запустите Autopatcher IG.
- Включите усилитель, контроллер микроскопа и контроллер манипулятора. EnsuЧто программное обеспечение усилителя работает.
- Запустите Autopatcher IG с Python из терминала командной строки следующим образом: сначала измените каталог (команда «cd» для большинства распространенных терминалов), где установлен Autopatcher IG, введите «python Autopatcher_IG.pyw» в терминале командной строки и нажмите "Введите ключ.
ПРИМЕЧАНИЕ. Не запускайте управляющее программное обеспечение манипулятора перед запуском Autopatcher IG, потому что он будет занимать стадию микроскопа и манипулятор, в результате чего Autopatcher IG не сможет найти аппаратное обеспечение. Программное обеспечение управления манипуляторами можно запускать после полного запуска IGP-автомата, если есть дополнительные модули для управления ( например, встроенный нагреватель).
- Откалибруйте основную пипетку.
- Вытяните пипетки, как описано выше 9 . Заполните выталкиваемую стеклянную пипетку внутренним раствором и загрузите ее на голову.
ПРИМЕЧАНИЕ. Пустые стеклянные пипетки имеют разные контрасты подМикроскоп и может привести к неточной калибровке. - Переместите наконечник пипетки в поле зрения микроскопа и сфокусируйте его. Если панель управления используется для перемещения манипуляторов и / или микроскопа, обновите координаты, нажав «z» на клавиатуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это действие не требуется, если клавиатура (ступень микроскопа: A / D - ось x, ось W / S - y, ось R / F - z, манипуляторы: H / K - ось x, U / J - ось y, O / L - ось z, 1/2 - номер единицы) используется для управления перемещением, поскольку координаты будут обновляться в реальном времени. - Нажмите кнопку «Начать калибровку» на главном графическом пользовательском интерфейсе (GUI) для соответствующего устройства, на котором загружена пипетка ( рисунок 2 ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Когда калибровка закончится, появится всплывающее окно.
ПРИМЕЧАНИЕ. Калибровка будет выполняться автоматически, что займет около 3,5 минут. Нажатие на ту же кнопку (теперь переключается на «отменить калибровку» afTer инициирует калибровку) прервет попытку калибровки. - Сохраните калибровку, нажав «сохранить калибровку» внизу основного графического интерфейса (он сохраняет текущую калибровку для обоих манипуляторов и может быть загружен в будущем).
ПРИМЕЧАНИЕ. Поле зрения при низком (4 или 10X) и высоком (40X) увеличении должно быть выровнено для нормальной калибровки вторичной калибровки. Пожалуйста, обратитесь к руководству пользователя оптической системы, используемой для процедур выравнивания.
- Вытяните пипетки, как описано выше 9 . Заполните выталкиваемую стеклянную пипетку внутренним раствором и загрузите ее на голову.
2. Автоматическая процедура зажима патча
- Подготовьте острые срезы головного мозга, как описано ранее 10 .
- Подготовьте стеклянные пипетки для патч-клещей.
- Поместите один срез мозга в центр камеры записи. Стабилизируйте срез с удержанием ломтика или «арфа».
- Обнаружение флуоресцентной ячейки.
- Найдите интересующую область под объективом 4X. Переместите ступень микроскопа, включив cliCk-to-move («CTM») и щелкните центр интересующей области. В качестве альтернативы, используйте клавиатуру для перемещения ступени микроскопа (A / D - ось x, W / S - ось y, R / F - ось z).
- Переключитесь на объектив с высокой степенью увеличения и отрегулируйте фокус, перемещая микроскоп по оси z, используя R / F на клавиатуре.
ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуется регулировать уровень водяной бани так, чтобы фокальная плоскость под объективами с низкой и высокой увеличением была одинаковой или похожей на оси z. - Нажмите кнопку «Detect Cell» в главном столбце GUI, «Unit 0.» Если светодиодный или лазерный источник света не может управляться сигналом TTL, вручную включите светодиод / лазер; При обнаружении ячейки появится всплывающее окно.
- При необходимости выключите светодиод / лазер; В графическом интерфейсе «Позиции памяти» появится список координат ячейки. Удалите нежелательные ячейки из списка, нажав кнопку «X» рядом с координатами.
- Альтернативно, если целевые ячейки не помечены флуоресцентно, нажмите «Режим мыши» в главном графическом интерфейсе. Нажмите на интересующую ячейку; В ячейке появится желтая точка с номером, а координаты ячейки появятся в графическом интерфейсе «Позиции памяти».
- Откалибруйте вторичную пипетку.
- Заполните 1/3 стеклянной пипетки с внутренним раствором. Загрузите пипетку на держатель пипетки, прикрепленный к головной ступени.
- Используйте объектив с малым увеличением. Принесите пипетку в поле зрения и отрегулируйте фокус с помощью клавиатуры (H / K - ось x, ось U / J - y, ось O / L - z). Используйте «1» и «2» для переключения между блоком 1 и блоком 2.
- Загрузите основную калибровку, нажав «Загрузить калибровку». Нажмите кнопку «Вторичная калибровка» в главном графическом интерфейсе под используемым устройством. Например, если используется блок 2, нажмите кнопку «Вторичная калибровка» в «Unit 2» column. Следуйте инструкциям всплывающего окна, чтобы переключиться на объектив с высоким увеличением.
- Исправить целевую ячейку.
- Убедитесь, что программное обеспечение «MultiClamp» ( т.е. усилитель) работает. Нажмите кнопку «Patch control», чтобы открыть графический интерфейс «Patch control»; Для открытия этого графического интерфейса может потребоваться до нескольких минут.
- Используйте объектив увеличения 40X, проверив «40X» в главном столбце «Единица 0». Нажмите кнопку «идти» рядом с ячейкой, представляющей интерес, в списке координат в графическом интерфейсе «Позиция памяти»; Микроскоп переместится в ячейку.
- Нажмите кнопку CTM устройства, используемого в главном графическом интерфейсе, чтобы включить движение после щелчка мышью. Нажмите на интересующую ячейку; Наконечник пипетки будет перемещаться в ячейку.
- Нажмите кнопку «Patch» в графическом интерфейсе «Patch control».
ПРИМЕЧАНИЕ. Автоматическое исправление начнется, и давление и сопротивление могутГрафический интерфейс «Patch control».- Используйте кнопку «Unit 1 selected» для переключения входного сигнала между двумя блоками.
ПРИМЕЧАНИЕ. Система будет приближаться к целевой ячейке, применять отрицательное давление, соответствовать потенциалу клеточной мембраны и обнаруживать гигазальное образование на основе серии порогов давления и сопротивления и логики. - Манипулируйте автоматическим процессом в любой момент, щелкнув соответствующие кнопки в графическом интерфейсе «Patch control». Например, нажмите кнопку «Патч» еще раз, чтобы отменить пробную версию патча и нажать «Следующий этап», чтобы продвинуть процесс исправления на следующий шаг, независимо от порога.
ПРИМЕЧАНИЕ. Всплывающее окно уведомляет пользователя о появлении гигаселя, а также возможность применения zap наряду с большим отрицательным давлением.
- Используйте кнопку «Unit 1 selected» для переключения входного сигнала между двумя блоками.
- Выберите «Да», чтобы разбить комбинированный запястье и всасывание. В качестве альтернативы, выберите «Нет», чтобы входить только с отсосом.
- Сохраните журнал патча эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если пробная версия исправления не удалась, всплывающее окно уведомит пользователя, и процесс исправления будет сброшен. - Вернитесь к шагу 2.4 и повторите шаги с другой ячейкой.
- Уточните пороговые значения (необязательно).
ПРИМЕЧАНИЕ. Пороговые значения для диапазона сопротивления пипетки, положительного и отрицательного давления, гигасеального сопротивления и т . Д. Могут быть изменены из файла конфигурации.- Откройте файл «PatchControlConfiguration.csv» в папке «Конфигурация» в пункте назначения, где установлена система. Измените числа, соответствующие каждому пороговому значению. Не изменяйте имена значений; Это приведет к неузнаваемым записям в системе.
- Внесите новые пороговые значения немедленно, нажав «CtRl + L "без перезапуска программы, перезапуск программы будет реализовывать новейшее пороговое значение из файла.
3. Выполнение записей
ПРИМЕЧАНИЕ. Режим в управляемом компьютером микроэлектродном усилителе автоматически устанавливается на текущий зажим («IC») с помощью программного обеспечения автозапуска после успешного завершения патча. Записи цельного клеточного зажима могут быть сделаны с использованием выбранного программного обеспечения для записи (эта система не включает функцию записи). Если было идентифицировано несколько целевых ячеек, после завершения записи вернитесь к шагу 2.4 и попробуйте другую ячейку.
- Проведите автоматические местные эксперименты по применению лекарств с использованием пикоприцера (необязательно).
ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь в качестве примера используется локальный эксперимент по применению лекарств для описания того, как использовать дополнительную функцию «Command Sequence» для управления внешним оборудованием через TTL-сигналы.- Подключить порт A chaNnel 0 и заземление на вторичной плате DAQ на вход триггерного запуска на цифровом преобразователе с использованием отсоединенного BNC-кабеля (как описано в шаге 1.2.3). Подключите один цифровой выходной канал на цифровом преобразователе к внешнему триггеру на пикоприцере.
- Подготовьте пикоприцеп в соответствии с руководством пользователя. Подключите выход воздуха picospritzer к держателю пипетки с наркотиками, прикрепленному к микроманипулятору.
- Загрузите пипетку, наполненную препаратом выбора. Прикрепите его к держателю пипетки. Откалибруйте пипетку, как описано на шаге 1.7.
- После исправления ячейки, как описано на шаге 2.6, выберите желаемое место доставки лекарственного средства, щелкнув мышью в графическом интерфейсе камеры в режиме «мыши» (переключившись с основного графического интерфейса). В качестве альтернативы, используйте графический интерфейс «Grid» для создания сетки, причем каждый пиксель в сетке является одним из целевых местоположений.
ПРИМЕЧАНИЕ. Сетка можно манипулировать в графическом интерфейсе камеры, перетаскивая мышью. - В «Command Sequ»Ence ", выберите блок манипулятора, на котором смонтирована пипетка. Нажмите« загрузить точки мыши »или« загрузить точки сетки », чтобы импортировать все координаты для доставки лекарств.
- Нажмите на каждую запись координат, чтобы отредактировать конкретную команду TTL-сигнала в правом столбце. В первой записи команды нажмите на самую цифровую цифру, чтобы перевести ее с «0» на «1», отправив сигнал TTL + 5-V TTL. Установите время (T) на желаемую длительность сигнала TTL, в мс.
- Во второй команде введите все цифры в «0» и установите значение T на длительность записи. Редактируйте команды для всех записей координат. Добавьте записи команд, нажав «+», если необходимо несколько сигналов TTL.
ПРИМЕЧАНИЕ. 8-разрядные биты представляют собой каналы A-канала 0-7 на вторичном DAQ (порты 1 - 3 заняты насосом и двумя клапанами) могут быть переключены, если необходимо.
- Создайте протокол записи в модуле сбора данных, чтобыЧто начало развертки запускается внешним триггером запуска. Отредактируйте протокол для доставки препарата в нужное время.
- В графическом интерфейсе «Command Sequence» нажмите «Запустить» слева, чтобы запустить все координаты. Кроме того, нажмите «Запустить» справа, чтобы запустить только выбранную последовательность.
ПРИМЕЧАНИЕ. Пипетка будет перемещаться в каждую координату и выполнять TTL-сигнал, как определено для начала развертки записи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наша система была проверена на ее способность исправлять клетки в острых срезах головного мозга, мышиные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), дифференцированные в нейроны, и клетки HEK 293, искусственно выражающие интересующие каналы. На фиг.3 показан эксперимент с использованием трансгенных мышей Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J), предназначенных для флуоресцентно меченных пирамидальных нейронов 5-го слоя в зрительной коре. Целевая ячейка была одной из автоматически идентифицированных зеленых флуоресцентно-позитивных клеток ( фиг. 3b ). Рисунок 3a - изображение контрастного контраста (DIC) патч-нейрона. Конфигурация целых ячеек была достигнута с помощью протокола автоматического паттинга на этапах 2.5-2.6 и была подтверждена действительными потенциалами действия, вызванными потоком тока ( рис. 3в )
1 "> Чтобы продемонстрировать дополнительную функцию« Command Sequence », мы поставили 500 мМ KCl в течение 200 мс в три места на срезе мозга, исправляя ячейку ( рис. 4 ). Сначала мы выбрали 3 места на срезе мозга: один близко К исправленному телу ячейки и двум вдали от исправленной ячейки. Координаты были сохранены в графическом интерфейсе «Memory Positions». Координаты были загружены в графический интерфейс «Command Sequence» под «Unit1», который был манипулятором, который KCl- Содержащую пипетку. Мы установили команды в левом столбце, чтобы отправить сигнал TTL + 5-V за 500 мс, а затем 0 В в течение 10 с ( рис. 4а ), от порта А канала 0 на вторичной плате DAQ, Который был подключен к входному сигналу «пускового запуска» дигитайзера. На рисунке 4c показано, что исправленная ячейка является обычным пиковым нейроном. Пипетка для приема лекарств (блок 1) пересекала три выбранных местоположения a( Рисунок 4b ), и мы записали 10 с для каждого приложения под напряжением ( рис. 4d ). Цвет следов на рисунке 4d соответствует цвету границы на рисунке 4b . Когда KCl был вздут в клетке, наблюдался большой внутренний ток, который медленно уменьшался при рассеянии KCl. Красный красный флуоресцентный краситель добавляли к раствору KCl для указания пространственного распределения доставки лекарственного средства и визуализировали с использованием комбинированной DIC и эпифлуоресцентной визуализации. Этот эксперимент продемонстрировал легкость и гибкость нашей системы для управления движением манипулятора / микроскопа и внешнего оборудования через сигналы TTL.
Рисунок 1. Блок управления давлением. A: Печатная плата (PCB) для подключения клапанов, давлениеДатчик и воздушный насос. На левой панели показаны детали на печатной плате, обозначенные местами выходов, которые указаны в протоколе. На правом рисунке показано соединение между печатной платой и воздушным насосом, портом USB и трубкой. B: Карта цепи для печатной платы. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Графический интерфейс Autopatcher. Кнопки, указанные в протоколе, показаны на красных квадратах и нумеруются. 1: Начальная калибровка, 2: Сохранение калибровки, 3: Калибровка нагрузки, 4: Вторичная калибровка, 5: Обнаружение ячейки, 6: Управление исправлениями, 7: Переход (координата ячейки-мишени) и 8: Патч. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого рисунка,
Рисунок 3. Пример запатентованной ChR2-YFP-позитивной клетки. A: 40-кратное увеличение под оптикой DIC. B: Эпифлуоресцентное изображение той же ячейки в панели A (светодиодная подсветка при 488 нм). C: Записи токового зажима из исправленной ячейки во время серии гиперполяризующих и деполяризующих ступенчатых инъекций. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Проведение эксперимента по автоматизированной доставке лекарств. A: Выбранные местоположения загружены в графический интерфейс «Command Sequence». В левом столбце показаноСписок координат, а правый столбец отображает список команд в виде сигналов TTL для каждого местоположения. B: Скриншоты во время эксперимента применения препарата, соответствующие трем выбранным местоположениям. Единицей 1 была пипетка, содержащая KCl, а блок 2 - патч-пипетка. Раствор KCl смешивали с красным флуоресцентным красителем с целью визуализации. Изображения были получены путем комбинирования DIC и флуоресцентной визуализации. C: Наличные инъекции, показывающие регулярный нейронов. D: Напряжение-фиксация регистрирует следы от локального применения раствора 500 мМ KCl в трех местах. Красная трасса с внутренним током регистрировалась из испытания, когда приложение KCl было близко к исправленной ячейке. Красная стрелка указывает время применения KCl. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Выход на печатную плату | Имя порта на плате DAQ | Порт # на плате DAQ | замечание |
| DOUT V1 | Порт A канала 1 | 22 | Управляющий клапан 1 |
| DOUT V2 | Порт A канала 2 | 23 | Управляющий клапан 2 |
| DOUT P | Канал порта А 3 | 24 | Воздушный насос управления |
| Gr | земля | 29 | земля |
Таблица 1. Печатная плата (PCB) для конфигурации соединения платы с дополнительными данными (DAQ). Используйте эту таблицу для подключения выходов PCB (первый столбец слева) к портам на плате DAQ (второй столбец слева). Имя и номер порта на вторичном DAQ относятся к несимметричному режиму.
Таблица 2. Трубные соединения от блока управления давлением до держателя (ов) пипетки. Для каждого соединения подключите соответствующие порты, выделенные серым ящиком, используя мягкие трубки (см. Таблицу материалов ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем метод автоматической записи патч-зажима с использованием изображений in vitro . Основные этапы этого процесса суммируются следующим образом. Во-первых, компьютерное зрение используется для автоматического распознавания наконечника пипетки с помощью серии изображений, полученных с помощью микроскопа. Эта информация затем используется для вычисления функции преобразования координат между микроскопом и системами координат манипулятора. Компьютерное зрение используется для автоматического обнаружения флюоресцентно меченых клеток и для определения их координат. Эти шаги интегрированы с таргетингом на пипетки и алгоритмом автоматического исправления с использованием языка программирования Python с открытым исходным кодом, PyQT и библиотек OpenCV.
По сравнению с существующими методами патч-клещей in vitro эта система значительно улучшает работу в нескольких областях. Это сводит к минимуму вмешательство человека. Эта система автоматизирует большинство шагов в эксперименте с зажимами патчей, сводя к минимуму reqДля вмешательства человека. Некоторые из оставшихся шагов управления, включая переключение между объективами с микроскопом с низким или высоким увеличением, могут быть автоматизированы с использованием дополнительного моторизированного оборудования.
Метод patch-clamp повышает пропускную способность. Эксперименты с патч-зажимами с использованием этой системы обеспечили более высокие показатели успеха и более короткие времена для каждого испытания, что способствовало значительному увеличению общей пропускной способности. Алгоритм компьютерного зрения для обнаружения флуоресцентных клеток и обнаружения наконечника пипетки очень надежный, и частота ошибок была очень низкой. Средняя ошибка обнаружения наконечника пипеток составляла 1,6 мкм, а ложноположительная скорость обнаружения флуоресцентных клеток составляла 4,9% ± 2,25%. Сделано подробное сравнение между традиционным ручным исправлением и автоматическим исправлением 6 .
Возможна подробная документация экспериментов. Патч-журналы каждого испытания могут быть сохранены и проанализированы post hoc . Такие подробныеДокументация ранее не была доступна для ручного исправления. Это позволяет проводить систематический анализ экспериментов по пакетированию в уникальных экспериментальных условиях, типах клеток, видах и срезах.
Этот метод демонстрирует совместимость со стандартным оборудованием для патч-зажима in vitro . Наша система, как продемонстрировано в этой рукописи, предназначена для увеличения существующих установок патч-клещей in vitro , что дает им возможность проводить автоматическое исправление. В отличие от планарного патч-подхода, эта система подходит для лабораторий, которые уже проводят ручной патч-клип, чтобы преобразовать свое оборудование с минимальными затратами. В то же время по-прежнему существует возможность исправления вручную или полуавтоматически с использованием одной и той же системы.
Из-за адаптируемости системы, упомянутой выше, подключение оборудования и настройка программного обеспечения требуется экспериментатором, когда система настроена в первый раз. Проблемы могут возникнутьОт неправильного назначения портов и неадекватных библиотек драйверов для управления определенным оборудованием. При устранении неполадок см. Шаги 1.2 - 1.4.
По сравнению с частичной автоматизацией существующих систем эта система достигает максимального уровня автоматизации в традиционном патч-фиксации in vitro острых срезов головного мозга (и других препаратов in vitro ). Это справедливо для всех этапов: от обнаружения ячеек до калибровки пипетки до исправления 7 , 11 . Единственным узким местом является ручной процесс заполнения и изменения пипетки паттерна между тропами. Недавние события в повторном использовании пипетки-патча могут потенциально решить эту проблему 12 . Помимо качества подготовки срезов, наиболее распространенная причина неудачных испытаний связана с механическими ошибками манипулятора и движением среза в камере. Эти ограничения находятся вне нашего контроля втекущая система. Предпринимаются усилия по внедрению тесного цикла, обнаружению в реальном времени и контролю перемещения пипетки для учета этой проблемы.
Для будущего развития мы заинтересованы в расширении возможностей обнаружения текущих флуоресцентных ячеек для общего обнаружения ячеек в оптике DIC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Неограниченная патентная заявка «СИСТЕМЫ И МЕТОДЫ АВТОМАТИЗИРОВАННОЙ ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИИ АВТОМАТИЗИРОВАННЫХ ИЗОБРАЖЕНИЙ В ВИТРО», № US 15 / 353,719, была подана 16 ноября 2016 года, Ref. №: PRF 67270-02.
Acknowledgments
Мы благодарны за финансовую поддержку Фонда Уайтхолла. Мы хотели бы поблагодарить Самуэля Т. Киссинджера за ценные замечания.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD Camera | QImaging | Rolera Bolt | |
| Electrophysiology rig | Scientifica | SliceScope Pro 2000 | Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”. |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | computer-controlled microelectrode amplifier |
| Digitizer | Molecular Devices | Axon Digidata 1550 | |
| LED light source | Cool LED | pE-100 | 488 nm wavelength |
| Data acquisition board | Measurement Computing | USB1208-FS | Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf |
| Solenoid valves | The Lee Co. | LHDA0531115H | |
| Air pump | Virtual industry | VMP1625MX-12-90-CH | |
| Air pressure sensor | Freescale semiconductor | MPXV7025G | |
| Slice hold-down | Warner instruments | 64-1415 (SHD-40/2) | Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm |
| Python | Anaconda | version 2.7 (32-bit for windows) | https://www.continuum.io/downloads |
| Screw Terminals | Sparkfun | PRT - 08084 | Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin) |
| (2-Pin) | |||
| N-Channel MOSFET 60 V 30 A | Sparkfun | COM - 10213 | |
| DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin | Sparkfun | PRT-07937 | |
| LED - Basic Red 5 mm | Sparkfun | COM-09590 | |
| LED - Basic Green 5mm | Sparkfun | COM-09592 | |
| DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) | Sparkfun | PRT-12748 | |
| Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA | Sparkfun | TOL-09442 | |
| Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) | Sparkfun | PRT-11367 | |
| Locking Male x Female x Female Stopcock | ARK-PLAS | RCX10-GP0 | |
| Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings | Fisher scientific | 14-171-129 | Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in. |
| BNC male to BNC male coaxial cable | Belkin Components | F3K101-06-E | |
| 560 Ohm Resistor (5% tolerance) | Radioshack | 2711116 | |
| Picospritzer | General Valve | Picospritzer II |
References
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
- Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
- Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
- Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
- Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630 (2013).
- Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
- Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).
