Tillämpning av automatiserad bildstyrd patchklem för studie av neuroner i hjärnskivor

Summary

Detta protokoll beskriver hur man utför automatiska bildstyrda patch-clamp-experiment med ett system som nyligen utvecklats för standard in vitro- elektrofysiologiprodukter.

Abstract

Hela cellplåster är standardmetoden för att mäta de enskilda cellernas elektriska egenskaper. In vitro patch clampen är dock en utmanande och låg genomströmningsteknik på grund av dess komplexitet och höga beroende av användarens drift och kontroll. Detta manuskript demonstrerar ett bildstyrt automatiskt patch-klämsystem för in vitro -experiment med helcellsplastklem i akuta hjärnskivor. Vårt system implementerar en datorvisionsbaserad algoritm för att detektera fluorescensmärkta celler och att rikta dem till helautomatisk patching med hjälp av en mikromekanipulator och intern pipetttryckskontroll. Hela processen är mycket automatiserad, med minimala krav på mänsklig intervention. Realtids experimentell information, inklusive elektrisk resistans och internt pipetttryck, dokumenteras elektroniskt för framtida analys och för optimering till olika celltyper. Även om vårt system beskrivs i samband med akut braiN-skivinspelningar kan den också appliceras på den automatiska bildstyrda patchklemmen av dissocierade neuroner, organotypa skivkulturer och andra icke-neuronala celltyper.

Introduction

Plåstringstekniken utvecklades först av Neher och Sakmann på 1970-talet för att studera joniska kanaler av excitativa membran ¹ . Sedan dess har patch clamping applicerats på studien av många olika ämnen på cellulär, synaptisk och kretsnivå - både in vitro och in vivo - i många olika celltyper, inklusive neuroner, kardiomyocyter, Xenopus-oocyter och artificiella liposomer ² . Denna process innefattar korrekt identifiering och inriktning av en cell av intresse, invecklad mikromanipulatorkontroll för att flytta patchpipetten i närheten av cellen, appliceringen av positivt och negativt tryck till pipetten vid rätt tidpunkt för att etablera en tät gigasplåster, Och ett inbrott för att upprätta en helcells patch-konfiguration. Patchklämning utförs typiskt manuellt och kräver omfattande träning för att behärska. Även för en forskare som har erfarenhet av plåstretKlämma är framgångsgraden relativt låg. Mer nyligen har flera försök gjorts för att automatisera patch-clamp-experiment. Två huvudstrategier har utvecklats för att åstadkomma automatisering: förstärkning av standard patch clamp utrustning för automatisk kontroll av patchprocessen och utformning av ny utrustning och tekniker från grunden. Den tidigare strategin är anpassningsbar till befintlig hårdvara och kan användas i en mängd olika patch-klämapplikationer, inklusive in vivo blindplastklemma ^{3 , 4 , 5} , in vitro patchklämma av akuta hjärnskivor, organotypa skivkulturer och odlade dissocierade neuroner ⁶ . Det möjliggör förhör av komplexa lokala kretsar genom att samtidigt använda flera mikromomanipulatorer ⁷ . Den plana patchmetoden är ett exempel på den nya utvecklingsstrategin, som kan uppnå den höga genomströmningen samtidigt pAtch clamp av celler i suspension för läkemedelsskärmningsändamål ⁸ . Den plana patchmetoden är dock inte tillämplig på alla celltyper, särskilt neuroner med långa processer eller intakta kretsar som innehåller omfattande anslutningar. Detta begränsar dess tillämpning för att kartlägga den invecklade kretsloppet i nervsystemet, vilket är en viktig fördel med traditionell patch clamp-teknik.

Vi har utvecklat ett system som automatiserar den manuella patch clamp processen in vitro genom att förstärka standard patch clamp hårdvara. Vårt system, Autopatcher IG, tillhandahåller automatisk pipettkalibrering, identifiering av fluorescerande celler, automatisk styrning av pipettrörelse, automatisk helcellsplåtering och dataloggning. Systemet kan automatiskt förvärva flera bilder av hjärnskivor på olika djup; Analysera dem med hjälp av datorsyn Och extrahera information, inklusive koordinaterna för fluorescensmärkta celler. Denna information kan då varaAnvänds för att rikta in och automatiskt patchera celler av intresse. Programvaran är skriven i Python-ett fritt språkprogram med öppen källkod, med flera bibliotek med öppen källkod. Detta säkerställer dess tillgänglighet till andra forskare och förbättrar reproducerbarheten och rigoriteten i elektrofysiologiska experiment. Systemet har en modulär design, så att extra maskinvara enkelt kan kopplas till det nuvarande systemet som visas här.

Protocol

1. Systeminställning

1. Konstruera tryckregulatorn.
   1. Montera tryckregulatorn enligt kretskortet ( Figur 1 ). Löd de nödvändiga delarna på det tryckta kretskortet (PCB) som tillverkats enligt elkretsschemat ( Figur 1b ). Använd standardmotstånd, lysdioder, metalloxidhalvlederfält-Eeffect-transistorer (MOSFET), kondensatorer och kontakter (se materialet ). Löds magnetventiler på PCB. Anslut luftpumpen och lufttrycksgivaren till PCB med elektrisk ledning.
      OBS! Det bör ta cirka 2 timmar att bygga tryckregulatorn med alla nödvändiga delar tillgängliga.
2. Anslut den sekundära datainsamlingskortet (DAQ).
   1. Anslut datautgångar från det kretskort till DAQ-kortet, enligt tabell 1 .
      OBS: DAQ-styrelsen wilJag kör i "Single-ended mode". Portkartan finns i användarmanualen (se materialet ).
   2. Anslut "AIn Pr S" till en av de analoga ingångarna (AI) och "R-Gr" till en av de analoga grunderna på det sekundära DAQ-kortet.
   3. Anslut den primära utgången från förstärkaren till en av AI-kanalerna och marken till den analoga marken på det sekundära DAQ-kortet.
      OBS! En vanlig BNC-kabel kan användas för att ansluta den primära utgången från förstärkaren.
   4. Strip den andra änden och anslut den positiva signalen ( dvs. kopparkärnan) till AI-kanalen och marken ( dvs. den tunna ledningen runt kärnan) till den analoga marken. Upprepa detta steg för en andra kanal om mer än en korrigeringskanal används.
      OBS: Den analoga ingången till DAQ-kortet kommer att konfigureras i senare steg.
   5. Anslut ström till effekten på den sekundära DAQ-kortet. Använd en separat 12 V effekt såUrce för pumpen.
3. Anslut slangen.
   1. Anslut luftpumpen och de två ventilerna enligt tabell 2 . Använd en 3-vägs kontakt för att ansluta mjukröret från ventilens 2 toppport, trycksensorn och pipetthållaren i sista steget.
   2. Lägg till en annan 3-vägs kontakt till röret som är anslutet till pipetthållaren om två pipetter används. Byt manuellt mellan ventilerna och pipetterna som används vid patching.
4. Installera Autopatcher IG.
   OBS! Systemkrav: Autopatcher IG testades endast på en dator som kör Windows 7. Den har inte validerats för andra operativsystem. Det beskrivna förfarandet gäller specifikt för hårdvaran som anges i materialet.
   1. Hämta Autopatcher-IG från GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
   2. Installera Python (se materialet för versionen och hämtningsadressen).
   3. Avinstallera PyQt4Bibliotek genom att skriva "pip avinstallera PyQt4" i en kommandorad terminal.
      OBS! Systemet använder en äldre version av PyQt4-biblioteket för att uppnå kompatibilitet med Qwt och Opencv-biblioteken.
   4. Installera Python-bibliotek från historiska hjulfiler (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Hitta följande filer: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) och Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. För att installera hjulfilerna, gå till katalogen där filerna sparas och skriv "pip install *** wheelfilename ***. Whl." Suppleant "*** wheelfilename ***" med det faktiska namnet på filen.
         OBS: "cp27" i hjulfilnamnet anger Python 2.7 och "win32" anges Windows 32-bit. Om "win32" inte fungerar, försök "win64".
   5. För att styra CCD-kameran, ladda ner och installera installationsprogrammetFör 64-bitars (https://www.qimaging.com/support/software/). Hämta sedan MicroManager för 64-bitars (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) för att styra kameran i Python.
   6. För att styra manipulatorerna och mikroskopsteget, installera styrprogramvara som tillhandahålls av tillverkaren.
      OBS! Genom att göra detta är drivrutinen som är nödvändig för att styra manipulatorerna också installerad. Installationspaketet tillhandahålls vanligtvis på en CD-ROM.
   7. För att styra det sekundära DAQ-kortet installerar du det universella biblioteket från cd-skivan, som levereras med DAQ-kortet.
5. Konfigurera maskinvaran för Autopatcher IG.
   1. Anslut mikroskopsteget och manipulatorns styrenheter till datorn via USB-portar.
   2. Tilldela COM-portnummer till enhet 0: mikroskopsteg, enhet 1: vänster manipulator och enhet 2: höger manipulator, i den här ordningen, i konfigurationsfilen "ports.csv" i mappen "konfiguration". LEave de andra parametrarna i porten.csv-filen ( dvs "SCI" ​​och "1") oförändrad.
      OBS! KOM-portnummerinformationen kan hittas genom att köra mjukvarans konfigurationsprogramvara som tillhandahålls av tillverkaren. Gå till fliken "inställningar", välj "inställningar" och "Motion" -sidan och läs etiketterna för varje flik högst upp. Alternativt kan denna information hittas i PC Enhetshanteraren.
   3. Tilldela analoga ingångskanalsnummer på DAQ-kortet för en tryckgivare och patchkanal 1 och 2 (motsvarande enhet 1 och 2). Ange kanalnumret i filen "DAQchannels.csv" i mappen "konfiguration".
      OBS! Det rekommenderas att öppna .csv-filerna med Notepad-programmet istället för ett kalkylblad, eftersom det kan ändra informationen när ändringarna sparas.
6. Kör Autopatcher IG.
   1. Slå på förstärkaren, mikroskopstyrenheten och manipulatorkontrollern. ensuRe att förstärkarprogrammet körs.
   2. Kör Autopatcher IG med Python från en kommandoradsterminal enligt följande: Först ändra katalogen (kommandot "cd" för de flesta vanliga terminaler) där Autopatcher IG är installerat, skriv "python Autopatcher_IG.pyw" i kommandoradsplinten och tryck på "Enter-tangent.
      OBS! Kör inte manipulatorns styrprogramvara innan du kör Autopatcher IG eftersom den kommer att uppta mikroskopsteget och manipulatorn, vilket gör att Autopatcher IG inte kan hitta hårdvaran. Manipulatorns styrprogramvara kan köras efter att Autopatcher IG är helt igång om det finns ytterligare moduler som ska styras ( t.ex. inline-värmare).
7. Kalibrera den primära pipetten.
   1. Dra patchpipetter som beskrivits tidigare ⁹ . Fyll en glaspipett med intern lösning och lägg den på huvudsteget.
      OBS! Tomma glaspipetter har olika kontraster underMikroskopet och kan leda till felaktig kalibrering.
   2. Flytta pipettspetsen till mikroskopets visningsfält och ta det i fokus. Om knappsatsen används för att flytta manipulatorerna och / eller mikroskopsteget, uppdatera koordinaterna genom att trycka på "z" på tangentbordet.
      OBS: Denna åtgärd är inte nödvändig om tangentbordet (mikroskopsteg: A / D - x-axel, W / S-y-axel, R / F-z-axel, manipulatorer: H / K - x-axel, J-y-axeln, O / L-z-axeln, 1/2-enhetens nummer) används för att styra rörelsen eftersom koordinaterna uppdateras i realtid.
   3. Klicka på knappen "Starta kalibrering" på det grafiska användargränssnittet (GUI) för motsvarande enhet där pipetten är laddad ( Figur 2 ).
      OBS! Ett popup-fönster visas när kalibreringen är klar.
      OBS: Kalibrering utförs automatiskt, vilket tar ca 3,5 min. Klicka på samma knapp (växlad nu till "avbryt kalibrering" avFör att initiera kalibrering) avbryter kalibreringsförsöket.
   4. Spara kalibreringen genom att klicka på "Spara kalibrering" längst ner i huvudgränssnittet (det sparar den aktuella kalibreringen för båda manipulatorerna och kan laddas i framtiden).
      OBS! Fältet för visning med låg (4 eller 10X) och hög (40X) förstoring måste anpassas för sekundärkalibrering för att fungera korrekt. Se användarhandboken för det optiska systemet som används för anpassningsförfarandena.

2. Automatisk patchprocedur

1. Förbered akuta hjärnskivor, som beskrivits tidigare ¹⁰ .
2. Förbered glaspipetter för plåstret.
3. Placera en hjärnskiva i mitten av inspelningskammaren. Stabilisera skivan med en skiva håll ned, eller "harpa."
4. Detektera fluorescerande cellen.
   1. Hitta området av intresse under 4X-objektivet. Flytta mikroskopsteget genom att slå på cliCk-to-move ("CTM") läge och klicka på mitten av det aktuella området. Alternativt, använd knappsatsen för att flytta mikroskopsteget (A / D - x-axeln, W / S-y-axeln, R / F-z-axeln).
   2. Byt till högförstoringslinsen och justera fokus genom att flytta mikroskopet i z-axeln med hjälp av R / F på knappsatsen.
      OBS! Det rekommenderas att justera vattennivået så att fokalplanet under linserna med låg och hög förstoringslins är lika eller liknande i z-axeln.
   3. Klicka på knappen "Upptäck cell" i huvudgränssnittskolumnen, "Enhet 0." Om LED- eller laserljuskällan på inställningen inte kan styras av TTL-signalen, slår du på LED / laser manuellt. Ett popup-fönster visas när celldetektering är klar.
      1. Stäng av LED / laser om det behövs. En lista över cellkoordinater visas i GUI för "Memory positions". Ta bort oönskade celler från listan genom att klicka på knappen "X" bredvid koordinaterna.
      2. Alternativt, om målceller inte är fluorescensmärkta, klickar du på "Musläge" på huvudgränssnittet. Klicka på cellen av intresse; En gul punkt med ett tal kommer att visas på cellen, och koordinaterna för cellen kommer att visas i "Memory positions" GUI.
5. Kalibrera sekundärpipetten.
   1. Fyll 1/3 av en glaspipett med intern lösning. Fyll pipetten på pipetthållaren fäst på huvudsteget.
   2. Använd lågförstoringslinsen. Ta pipetten in i det visuella fältet och justera fokuset med knappsatsen (H / K - x-axeln, U / J-y-axeln, O / L-z-axeln). Använd "1" och "2" för att växla mellan enhet 1 och enhet 2.
   3. Ladda den primära kalibreringen genom att klicka på "Ladda kalibrering". Klicka på knappen "Sekundär kalibrering" på huvudgränssnittet under den enhet som används. Om enheten 2 till exempel används, klickar du på knappen "Sekundär kalibrering" i "Enhet 2" -kolumn. Följ popup-fönsterinstruktionerna för att växla till högförstoringslinsen.
6. Patch en målcell.
   1. Se till att programvaran "MultiClamp" ( dvs. förstärkare) körs. Klicka på "Patch Control" knappen för att öppna "Patch Control" GUI; Det kan ta upp till några minuter att öppna denna GUI.
   2. Använd 40X förstoringslinsen genom att markera "40X" på huvudgränssnittet "Unit 0". Klicka på "gå till" -knappen bredvid cellen av intresse på koordinatlistan i GUI; Mikroskopet flyttas till cellen.
   3. Klicka på CTM-knappen på enheten som används i huvudgränssnittet för att aktivera rörelse efter ett musklick. Klicka på cellen av intresse; Pipettspetsen flyttas till cellen.
   4. Klicka på "Patch" -knappen på "Patch Control" GUI.
      OBS! Automatisk patching börjar och trycket och motståndet kan övervakas"Patch control" GUI.
      1. Använd knappen "Unit 1 selected" för att växla in signalen mellan de två enheterna.
         OBS: Systemet kommer att närma sig målcellen, applicera negativt tryck, matcha cellmembranpotentialen och upptäcka gigasalbildning baserat på en serie tryck- och motståndströsklar och logik.
      2. Manipulera den automatiska processen när som helst genom att klicka på respektive knapp på "Patch Control" GUI. Till exempel klickar du på "Patch" -knappen igen för att avbryta patchprovet och klicka på "Nästa steg" för att fortsätta patchprocessen till nästa steg, oavsett tröskelvärdet.
         OBS! Ett popup-fönster kommer att meddela användaren när en gigaseal har bildats, och alternativet att applicera zap tillsammans med stort negativt tryck presenteras.
   5. Välj "Ja" för att bryta in med kombinerad zap och sugning. Alternativt, välj "Nej" för att bara bryta in med sug.
      
   6. Spara experimentloggloggen.
      OBS! Om en patchprovning misslyckas kommer ett popup-fönster att meddela användaren och patchprocessen återställs.
   7. Gå tillbaka till steg 2.4 och upprepa stegen med en annan cell.
7. Förbättra patchgränserna (valfritt).
   OBS: Trösklar för det ursprungliga pipettmotståndsintervallet, positivt och negativt tryck, gigasal resistans etc. Kan ändras från en konfigurationsfil.
   1. Öppna filen "PatchControlConfiguration.csv" i mappen "Konfiguration" på den destination där systemet är installerat. Ändra siffrorna som motsvarar varje tröskelvärde. Ändra inte värdena på värdena. Detta kommer att resultera i oigenkännliga poster i systemet.
   2. Genomför de nya tröskelvärdena omedelbart genom att trycka på "CtRl + l "utan att starta om programmet, omstart av programmet kommer att implementera det senaste tröskelvärdet från filen.

3. Utföra inspelningar

OBS: Läget i den datorstyrda mikroelektrodeförstärkaren ställs automatiskt in till Current Clamp ("IC") av autopatchers programvara när en lyckad patch har uppnåtts. Full-cell-patch-kläminspelningar kan göras med hjälp av inspelningssoftware som valts (detta system innehåller inte en inspelningsfunktion). Om flera målceller identifierades, efter avslutad inspelning, gå tillbaka till steg 2.4 och prova en annan cell.

1. Utför automatiska lokala läkemedelsapplikationsexperiment med en picospritzer (tillval).
   OBS! Här används ett lokalt läkemedelsapplikationsexperiment som ett exempel för att beskriva hur man använder den extra kommandosekvensfunktionen för att styra extern hårdvara via TTL-signaler.
   1. Anslut port A chaNnel 0 och marken på det sekundära DAQ-kortet till startdriven ingång på digitaliseraren med en avskalad BNC-kabel (som beskrivs i steg 1.2.3). Anslut en digital utgångskanal på digitaliseraren till den externa utlösaren på picospritzer.
   2. Förbered picospritzeren enligt användarhandboken. Anslut picospritzer-luftutgången till pipetthållaren med nålpuffen kopplad till en mikromekanipulator.
   3. Ladda en pipett fylld med ett valfritt läkemedel. Fäst den på pipetthållaren. Kalibrera pipetten, som beskrivs i steg 1.7.
   4. Efter att du lappar en cell enligt beskrivningen i steg 2.6 väljer du önskad plats för läkemedelsleverans genom att klicka med musen i kamerans visnings-GUI under "musläge" (byt från huvudgränssnittet). Alternativt, använd "Grid" GUI för att designa ett rutnät, med varje pixel i rutnätet som en av målplatserna.
      OBS! Rutenettet kan manipuleras i GUI för kameravy genom att dra med musen.
   5. I "Command SequEnce "GUI, välj den manipulator som läkemedelspipetten är monterad på. Klicka på" ladda muspekar "eller" ladda rutnätpunkter "för att importera alla koordinater för läkemedelsleverans.
      1. Klicka på varje koordinatpost för att redigera den specifika kommandot TTL-signalen i den högra kolumnen. I den första kommandotillfället klickar du på den högsta siffran för att ändra den från "0" till "1", och skickar en + 5-V TTL-signal. Ställ in tiden (T) till önskad TTL-signalvariant, i ms.
      2. I den andra kommandotillgången ställer du in alla siffror till "0" och ställer in T till varaktigheten av inspelningslängden för provet. Redigera kommandon för alla koordinatposter. Lägg till kommandoställningar genom att klicka på "+" om flera TTL-signaler är nödvändiga.
         OBS! De 8-siffriga bitarna representerar port A-kanaler 0-7 på sekundära DAQ (portar 1 - 3 upptar av pumpen och två ventiler) kan omkopplas om nödvändigt.
   6. Skapa ett inspelningsprotokoll i datainsamlingsmodulen såAtt starten på ett svep utlöses av den externa starttryckaren. Redigera protokollet för att leverera drogen vid önskad tidpunkt.
   7. I "Kommandosekvens" GUI klickar du på "Kör" till vänster för att köra alla koordinater. Alternativt klickar du på "Kör" till höger för att bara köra den valda sekvensen.
      OBS: Pipetten kommer att flytta till varje koordinat och genomföra TTL-signalen som definierad för att starta inspelningen.

Representative Results

Vårt system har testats på förmågan att patchera celler i akuta hjärnskivor, musinducerade Pluripotenta stamceller (iPSCs) differentierade till neuroner och HEK 293-celler som artificiellt uttrycker kanaler av intresse. Figur 3 visar ett experiment med användning av Thy1-ChR2-YFP-transgena möss (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) inriktning på fluorescensmärkta skikt 5 pyramidala neuroner i den visuella cortexen. Målcellen var en av de automatiskt identifierade gröna fluorescerande positiva cellerna ( Figur 3b ). Figur 3a är DLC-bilden (Differential Interference Contrast) av den patched neuronen. Hela cellkonfigurationen uppnåddes genom det automatiska patchprotokollet i steg 2,5-2,6 och validerades av stegströminjektionsinducerad verkningspotential ( Figur 3c )

1 "> För att visa ytterligare funktionen" Command Sequence ", levererade vi 500 mM KCl i 200 ms till tre platser på en hjärnskiva medan du lappar en cell ( Figur 4 ). Vi valde först 3 platser på hjärnskivan: en nära Till den patched cellkroppen och två långt ifrån den patched cellen. Koordinaterna lagrades i GUI: s "Memory Positions". Koordinaterna laddades till "Command Sequence" GUI under "Unit1", som var manipulatorn som KCl- Vi ställer in kommandon i den vänstra kolumnen för att skicka en + 5-V TTL-signal för 500 ms följt av 0 V i 10 s ( Figur 4a ), från port A kanal 0 på den sekundära DAQ-kortet, Som var ansluten till digitaliserings-start-trigger-ingången. Figur 4c visar att den patcherade cellen var en vanlig spiking-neuron. Droppapplikationspipetten (Enhet 1) traverserade de tre valda platserna aUtomatiskt ( figur 4b ) och vi registrerade 10 s för varje applikation under spänningsklemmen ( figur 4d ). Färgen på spåren i figur 4d motsvarar gränsvärgen i figur 4b . När KCl puffades i cellen observerades en stor inre ström, vilken sakta minskades som KCl diffunderad. Röd fluorescerande färgämne tillsattes till KCl-lösningen för att indikera den rumsliga fördelningen av läkemedelsavgivning och avbildades med användning av kombinerad DIC och epifluorescerande bildbehandling. Detta experiment illustrerade enkelheten och flexibiliteten i vårt system för att styra manipulator / mikroskoprörelse och extern hårdvara genom TTL-signaler.

Figur 1. Tryckkontrollenhet. A: Kretskort (PCB) för anslutning av ventiler, tryckSensor och luftpump. Vänster visar detaljer på PCB, märkningslägen för utdata som nämns i protokollet. Rätten visar kopplingen mellan PCB och luftpump, USB-port och slang. B: Kretskort för PCB. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2. Autopatcher GUI. De knappar som nämns i protokollet visas i röda rutor och är numrerade. 1: Starta kalibrering, 2: Spara kalibrering, 3: Lastkalibrering, 4: Sekundär kalibrering, 5: Upptäck cell, 6: Patchkontroll, 7: Gå till (målcellskoordinat) och 8: Patch. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3. Ett exempel på den patcherade ChR2-YFP-positiva cellen. A: 40X förstoring under DIC optik. B: Epifluorescensbild av samma cell i panel A (LED-belysning vid 488 nm). C: Aktuell-kläminspelningar från den patched cellen under en serie av hyperpolariserande och depolariserande stegströminjektioner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4. Genomföra ett Automated Drug Delivery Experiment. A: Valda platser laddade till "Kommandosekvens" GUI. Den vänstra kolumnen visarListan över koordinater och den högra kolumnen visar listan med kommandon i form av TTL-signaler för varje plats. B: Skärmdumpar under läkemedelsapplikationsexperimentet som motsvarar de tre valda platserna. Enhet 1 var den KCl-innehållande pipetten och enhet 2 var patchpipetten. KCl-lösningen blandades med rött fluorescerande färgämne i syfte att visualisera. Bilder erhölls genom att kombinera DIC och fluorescensavbildning. C: Stegströmsinsprutningar som visar en vanlig spikande neuron. D: Spänningsklem inspelning spårar från den lokala applikationen av 500 mM KCl lösning på tre platser. Det röda spåret med inåtgående strömmen registrerades från försöket när KCl-applikationen var nära den patched cellen. Den röda pilen indikerar tidpunkten för KCl-applikationen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Uttag på PCB	Portnamn på DAQ-styrelsen	Hamn # på DAQ-styrelsen	Anmärkning
DOUT V1	Port A kanal 1	22	Styrventil 1
DOUT V2	Port A kanal 2	23	Styrventil 2
DOUT P	Port A kanal 3	24	Kontrollera luftpumpen
Gr	Jord	29	Jord

Tabell 1. Kretskort (PCB) till konfiguration av sekundär datainsamling (DAQ). Använd den här tabellen för att ansluta PCB-utgångar (första kolumnen från vänster) till portar på DAQ-kortet (andra kolumnen från vänster). Portnamnet och numret på den sekundära DAQ-enheten refererar till single-ended-läget.

Tabell 2. Slanganslutningar från tryckreguleringsenheten till pipetthållaren (erna). För varje anslutning, anslut de motsvarande portarna, markerade med en grå låda, med mjukt slang (se materialet ).

Discussion

Här beskriver vi en metod för automatiska bildstyrda patch clampinspelningar in vitro . Nyckelstegen i denna process sammanfattas enligt följande. Först användes datorvision för att automatiskt känna igen pipettspetsen med hjälp av en serie bilder som förvärvats via ett mikroskop. Denna information används sedan för att beräkna koordinatomvandlingsfunktionen mellan mikroskopet och manipulatorkoordinatsystemen. Datorsyn används för att automatiskt detektera fluorescensmärkta celler och identifiera deras koordinater. Dessa steg är integrerade med pipettinriktning och den automatiska patchalgoritmen med hjälp av öppna Python programmeringsspråk, PyQT och OpenCV-bibliotek.

Jämfört med befintliga in vitro patch clamp metoder, detta system gör betydande förbättringar på flera områden. Det minimerar mänskligt ingripande. Systemet automatiserar de flesta stegen i patch clamp-experimentet, vilket minimerar reqPension för mänskligt ingripande. Några av de återstående manuella stegen, inklusive byte mellan mikroskopens linser med låg / hög förstoring, kan automatiseras med hjälp av extra motoriserad maskinvara.

Patch-clamp-metoden förbättrar genomströmningen. Patch-clamp-experiment som använde detta system uppnådde högre framgångsgrader och kortare tider för varje försök, vilket bidrog till en signifikant ökning av den totala genomströmningen. Datorvisionsalgoritmen för detektering av fluorescerande celler och pipettspetsdetektering är mycket robust och felfrekvensen var mycket låg. Det genomsnittliga felet för pipettspetsdetektering var 1,6 jim och den falskpositiva hastigheten för fluorescerande celldetektering var 4,9% ± 2,25%. En detaljerad jämförelse mellan traditionell manuell patching och automatisk patching har gjorts ⁶ .

Detaljerade dokumentation av experiment är möjlig. Patchloggar för varje försök kan sparas och analyseras efter hoc . Sådana detaljeradDokumentation var inte tidigare tillgänglig för manuell patching. Detta möjliggör systematisk analys av patch-experiment i unika experimentella förhållanden, celltyper, arter och skivberedningar.

Denna metod visar kompatibilitet med standard in vitro- patch-klämutrustning. Vårt system, som det visas i detta manuskript, är utformat för att förstärka befintliga in vitro patch clamp riggar, vilket ger dem kapacitet att genomföra automatisk patching. Till skillnad från det plana patch-tillvägagångssättet är detta system lämpligt för laboratorier som redan utför manuell plåstring för att konvertera sin utrustning till minimal kostnad. Samtidigt finns det fortfarande möjlighet att klistra in manuellt eller halvautomatiskt med samma system.

På grund av anpassningsförmågan hos det ovan nämnda systemet är det nödvändigt att ansluta hårdvaran och konfigurera mjukvaran av experimenteraren när systemet är inställt för första gången. Problem kan uppståFrån felaktig porttilldelning och otillräckliga förarbibliotek för kontroll av viss maskinvara. Se steg 1.2 - 1.4 vid felsökning.

Jämfört med partiell automatisering av befintliga system uppnår detta system den maximala automationsnivån i den konventionella in vitro- patchspänningen av akuta hjärnskivor (och andra in vitro preparat). Detta gäller för alla steg, från celldetektering till pipettkalibrering till patching ^{7 , 11} . Den enda flaskhalsen är den manuella processen att fylla och byta patchpipetterna mellan spåren. Den senaste utvecklingen i återanvändningen av patchpipetter kan eventuellt lösa detta problem ¹² . Förutom kvaliteten på skivberedningen är den vanligaste orsaken till misslyckade försök härrörande från manipulatorns mekaniska fel och rörelsen av skivan i kammaren. Dessa begränsningar ligger utanför vår kontroll iNuvarande system. Det görs ansträngningar för att genomföra närliggande, realtidsdetektering och kontroll av pipettrörelse för att ta hänsyn till detta problem.

För framtida utveckling är vi intresserade av att expandera nuvarande fluorescerande celldetekteringskapacitet till allmän celldetektering under DIC-optik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Camera	QImaging	Rolera Bolt
Electrophysiology rig	Scientifica	SliceScope Pro 2000	Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”.
Amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B	computer-controlled microelectrode amplifier
Digitizer	Molecular Devices	Axon Digidata 1550
LED light source	Cool LED	pE-100	488 nm wavelength
Data acquisition board	Measurement Computing	USB1208-FS	Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Solenoid valves	The Lee Co.	LHDA0531115H
Air pump	Virtual industry	VMP1625MX-12-90-CH
Air pressure sensor	Freescale semiconductor	MPXV7025G
Slice hold-down	Warner instruments	64-1415 (SHD-40/2)	Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm
Python	Anaconda	version 2.7 (32-bit for windows)	https://www.continuum.io/downloads
Screw Terminals	Sparkfun	PRT - 08084	Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)
(2-Pin)
N-Channel MOSFET 60 V 30 A	Sparkfun	COM - 10213
DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin	Sparkfun	PRT-07937
LED - Basic Red 5 mm	Sparkfun	COM-09590
LED - Basic Green 5mm	Sparkfun	COM-09592
DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)	Sparkfun	PRT-12748
Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA	Sparkfun	TOL-09442
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)	Sparkfun	PRT-11367
Locking Male x Female x Female Stopcock	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings	Fisher scientific	14-171-129	Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in.
BNC male to BNC male coaxial cable	Belkin Components	F3K101-06-E
560 Ohm Resistor (5% tolerance)	Radioshack	2711116
Picospritzer	General Valve	Picospritzer II