Summary
Здесь мы описываем инновационный метод определения полиморфизмов длины комплемента рецепта 1 (CR1) для использования в нескольких применениях, в частности, для оценки восприимчивости к таким заболеваниям, как болезнь Альцгеймера (AD). Этот метод может быть полезен для лучшего понимания роли изоформ CR1 в патогенезе AD.
Abstract
Рецептор комплемента 1 (CR1), трансмембранный гликопротеин, который играет ключевую роль в врожденной иммунной системе, выражается во многих типах клеток, но особенно на эритроцитах (эритроцитах). В качестве рецептора для компонентов комплемента C3b и C4b CR1 регулирует активацию каскада комплемента и способствует фагоцитозу иммунных комплексов и клеточного мусора, а также амилоид-бета (Aβ) пептид при болезни Альцгеймера (AD). В нескольких исследованиях подтверждены связанные с АД однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), а также вариация количества копий (CNV) в гене CR1 . Здесь мы опишем инновационный метод определения полиморфизма длины CR1-рецептора. Рецептор включает три домена, называемые длинными гомологичными повторами (LHR) -LHR-A, LHR-C и LHR-D- и n-домен, LHR-B, где n представляет собой целое число от 0 до 3. Используя одну пару Специфических праймеров, генетический материал используется для амплификации первого фрагмента домена LHR-B (thE variant amplicon B) и второй фрагмент домена LHR-C (инвариантный ампликон). Вариант ампликона В и инвариантный ампликон проявляют различия на пяти нуклеотидах вне областей гибридизации указанных праймеров. Числа вариантов ампликонов B и инвариантных ампликонов выводятся с использованием количественного инструмента (кривые плавления высокого разрешения (HRM)), а отношение вариационного ампликона B к инвариантному ампликону отличается в зависимости от полиморфизма длины CR1. Этот метод дает несколько преимуществ по сравнению с методом канонического фенотипа, поскольку он не требует свежего материала и дешевле, быстрее и, следовательно, применим к более крупным популяциям. Таким образом, использование этого метода должно быть полезно для лучшего понимания роли изоформ CR1 в патогенезе таких заболеваний, как AD.
Introduction
AD, самая распространенная причина деменции, затрагивает более 30 миллионов человек во всем мире и является одной из основных проблем общественного здравоохранения 1 . Клинически AD характеризуется нейрокогнитивными нарушениями, приводящими к постепенной потере автономии 2 . AD характеризуется двумя невропатологическими признаками, а именно внеклеточными амилоидными отложениями и внутриклеточными нейрофибриллярными клубочками 3 .
Традиционно, согласно возрасту начала заболевания, АД подразделяется на две формы. Во-первых, это раннее начало AD (EOAD), где начало чаще всего происходит до 65 лет; Эта форма составляет менее 5% случаев AD. Это редкая аутосомно-доминантная форма AD, которая приводит к полному проникновению мутаций либо в белок-предшественник амилоида ( APP) 4 , пресенилин 1 ( PSEN1 ) 5 , либо пресенилин 2 ( PSEN2 )> 6 генов. Во-вторых, более распространенная форма заболевания (> 90% случаев AD) называется «спорадической» поздней AD (НАГРУЗКА) и чаще всего встречается у лиц в возрасте 65 лет и старше. Это связано с многочисленными генетическими и экологическими факторами риска 7 . В LOAD 4 аллеля гена аполипопротеина E ( APOE ) является основным фактором генетического риска 8 , 9 . Кроме того, более 20 генных локусов были идентифицированы с помощью исследований по объему генома (GWAS) как связанного с риском AD, один из которых является геном 10 рецептора 1 ( CR1 ) комплемента (компонента) комплемента (3b / 4b), который расположен на Хромосомы 1q32 в кластере связанных с комплементом белков. Ген CR1 кодирует белок комплемента рецептора 1 (CR1), являющийся компонентом регуляторов активности комплемента.
CR1 (рецептор C3b / C4b, CD35), трансмембранный гликопротеин аппроксимата200 кДа 11 , связывается с C3b, C4b, C3bi, C1q, маннансвязывающим лектином (MBL) и белками комплемента фиколина 12 . Биологическая функция CR1 зависит от типов клеток, в которых она выражена. У людей 90% общего циркулирующего CR1 содержится в эритроцитах (эритроцитах) 13 . На поверхности эритроцитов CR1 связывается с C3b- или C4b-опсонизированными микроорганизмами или иммунными комплексами, что облегчает их очищение от кровообращения. Комплексы, связанные с CR1, действительно передаются фагоцитам, когда эритроциты проходят через печень и селезенку 11 , 14 . Ограничивая осаждение C3b и C4b, CR1 может предотвратить чрезмерную активацию комплемента. Поэтому экспрессия CR1 на эритроцитах считается важным элементом защиты тканей, таких как церебральная нервная система, от осаждения иммунных комплексов и возникающих в результате заболеваний. CR1 на эритроцитах также известенИграют важную роль в патогенной инфекции 15 , 16 . Кроме того, CR1, как ключевой игрок в врожденном иммунитете, участвует в регулировании каскада комплемента и в транспортировке и очистке иммунных комплексов. CR1 проявляет эту активность путем связывания фрагментов C3b и C4b и диссоциации классических и альтернативных конвертаз (диссоциация C2a из комплекса C4b2a и диссоциация C3b из комплекса C3bBb). В качестве кофактора фактора сериновой протеазы плазмы I (FI) CR1 ингибирует классические и альтернативные пути комплемента путем увеличения расщепления C4b и C3b на FI, свойства, известного как активность кофактора (CA), и путем ингибирования цикла амплификации C3 , В свою очередь, предотвращая дополнительную активацию комплемента. Роджерс и его коллеги доказывают, что пептид Aβ может связывать и активировать путь комплемента в отсутствие антител 17 и предположить, что пептид Aβ представляет собой clУходящих из кровообращения посредством дополнения, зависящего от комплемента, к CR1, выраженного на эритроцитах 18 .
CR1 проявляет три типа полиморфизмов: структурные или длинные полиморфизмы, полиморфизмы плотности и полиморфизмы групп крови Knops 11 , 19 . Структурный полиморфизм связан с изменением числа длинных гомологичных повторов (LHR) и, таким образом, определяет четыре изоформы. Фактически, внеклеточный домен белка CR1 состоит из серии повторяющихся единиц, называемых короткими консенсус-повторами (SCR) или повторами контроля комплемента (CCP). Эти СКВ были продемонстрированы из комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК), кодирующей CR1. SCR расположены в тандемных группах по семь, известных как LHR. CR1 состоит из четырех LHR, обозначенных как LHR-A, -B, -C и -D, возникающие в результате дублирования блока 19 , 20 с 7 SCR ,21 .
В порядке увеличения частоты эти изоформы CR1, определяемые вестерн-блоттингом (WB), представляют собой CR1 * 1 (A / F) (быстрая миграция на гель-электрофорезе), CR1 * 2 (B / S) (медленная миграция на гель-электрофорезе), CR1 * 3 (C / F`) и CR1 * 4 (D). Две наиболее распространенные изоформы CR1 * 1 (A / F) и CR1 * 2 (B / S) состоят из четырех и пяти LHR соответственно, тогда как CR1 * 3 (C / F`) и CR1 * 4 (D ) Состоят из 3 и 6 LHR, соответственно. Наиболее распространенная изоформа (CR1 * 1), состоящая из 30 SCR, содержит три сайта связывания C4b (SCR 1-3, 8-10 и 15-17) и два сайта связывания C3b (SCR 8-10 и 15-17) , Тогда как SCR 22-28 связывают C1q, фиколины и MBL 12 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . Таким образом, CR1 * 2 содержит один дополнительный сравнительный сайт C3b / C4bD до CR1 * 1. На рисунке 1 показаны структуры, номенклатуры и молекулярные массы четырех различных изоформ CR1.
Полиморфизм плотности соответствует устойчивому фенотипу, который представляет собой уровень конститутивной экспрессии CR1 на эритроцитах. У здоровых кавказских субъектов было показано, что количество молекул CR1 на RBC может варьироваться в десять раз (от 150 до 1200 молекул на клетку) 26 . RBC фенотипа Helgeson имеют очень низкую плотность CR1, которая, как было показано, составляет менее 150 молекул на клетку 27 , 28 . Плотность CR1 на эритроцитах генетически связана с аутосомной кодоминантной биаллельной системой на гене CR1 , коррелированной с полиморфизмом длины рестрикционного фрагмента Hin dIII (RFLP) 29 . Одноточечная мутация в Intron 27 гена CR1 между экзонами, кодирующими вторуюSCR в LHR-D, приводит к получению полиморфного сайта Hin dIII в этой области 30 . Геномные Hin dIII фрагменты 7,4 и 6,9 кДа идентифицируют аллели, связанные с высокой (H аллель) или низкой (L аллель) CR1-плотностью на эритроцитах соответственно. Однако не было обнаружено корреляции между концентрацией CR1 на эритроцитах и полиморфизмами Hin dIII в некоторых популяциях Западной Африки 31 , 32 . Механизм, связывающий регуляцию плотности CR1 с некодирующим полиморфизмом Hin dIII, остается неизвестным. Сообщается, что среди нескольких полиморфизмов Q981H в SCR16 и P1786R в SCR28 связаны с плотностью CR1 на эритроцитах 30 , 33 .
Полиморфизм Knops (KN), согласно международной номенклатуре, - это 22-я группа групп крови, которая будет проиндексирована Международным обществом переливания крови. Он содержит 9 антигенных спецификацийВыраженные CR1 на эритроцитах, включая три антитромные антигенные пары, KN1 / KN2, KN3 / KN6 и KN4 / KN7, а также 3 изолированных антигена KN5, KN8, KN9. Антигенами KN1, KN3, KN4 и KN5 являются высокочастотные антигены KN-системы ( т.е. выражены более чем в 99% от общей популяции). Однако роль этого полиморфизма в AD еще предстоит определить 13 .
Протокол, описанный в этой работе, был разработан для определения генотипов полиморфизма длины CR1, связанных с восприимчивостью к нескольким заболеваниям, таким как AD, системная красная волчанка и малярия. Наш метод определения полиморфизма длины CR1 использует количество LHR-B, содержащих изоформы CR1, и разности последовательностей между LHR-B и LHR-C ( рисунок 2 ).
Protocol
Протокол сбора и обработки крови человека был рассмотрен и одобрен Региональным комитетом по этике (CPP Est II), а номер протокола - 2011-A00594-37.
ПРИМЕЧАНИЕ. В следующем протоколе описывается обращение с кровью человека. Пожалуйста, следуйте институциональным принципам при утилизации биологически опасных материалов. Следует носить лабораторное оборудование для обеспечения безопасности, такое как лабораторные халаты и перчатки. Блок-схема, описывающая протокол, показана на рисунке 3 .
1. Извлечение ДНК крови и тела
- Нанесите 20 мкл протеиназы K (15 мкг / мкл) на дно 1,5-миллилитровой трубки.
- Добавьте 200 мкл образца в пробирку объемом 1,5 мл. Используйте до 200 мкл цельной крови, плазмы, сыворотки, охристого слоя или жидкостей организма или до 5 × 10 6 лимфоцитов в 200 мкл PBS.
- Добавить 200 мкл буфера для лизиса в образец. Смешайте импульсным ворсингом в течение 15 с.
- Инкубируйте при 56 ° C в течение 10 минут на водяной бане.
- Кратко центрифугируйте пробирку объемом 1,5 мл, чтобы удалить капли изнутри крышки.
- Добавьте 200 мкл этанола (96-100%) к образцу и снова перемешайте импульсным встряхиванием в течение 15 с. После смешивания кратковременно центрифугируйте пробирку объемом 1,5 мл, чтобы удалить капли изнутри крышки.
- Тщательно нанесите смесь с шага 1.6 на мембранную колонку (в сборную трубку объемом 2 мл). Без смачивания обода закрыть колпачок и центрифугу при 6000 мкг в течение 1 мин. Поместите мембранную колонку в чистую сборную трубку объемом 2 мл и выбросьте трубку, содержащую фильтрат.
- Осторожно откройте мембранную колонку и добавьте 500 мкл промывочного буфера 1 без смачивания обода. Закройте колпачок и центрифугу при 6000 xg в течение 1 мин. Поместите мембранную колонку в чистую сборную трубку объемом 2 мл и выбросьте пробирку, содержащую фильтрат.
- Осторожно откройте мембранную колонку и добавьте 500 мкл промывочного буфера 2 без смачиванияE обод. Закройте колпачок и центрифугу на полной скорости (20 000 xg) в течение 3 минут.
- Поместите мембранную колонку в новую сборную трубку объемом 2 мл и отбросьте собирающую трубку с фильтратом. Центрифуга при 20 000 мкг в течение 1 мин.
- Поместите мембранную колонку в чистую пробирку объемом 1,5 мл и выбросьте трубку для сбора, содержащую фильтрат.
- Осторожно откройте мембранную колонку и добавьте 200 мкл дистиллированной воды. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем центрифугируйте при 6000 × g в течение 1 мин.
- Перейдите к определению стадии концентрации ДНК или замораживайте образцы ДНК при -20 ° C
2. Определение концентрации ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ. См. Рисунок 4 .
- Нажмите 1, чтобы выбрать режим ДНК на спектрофотометре. Выберите длину пути 5 мм, используя стрелки влево и вправо. Выберите коэффициент разбавления 1, используя стрелки влево и вправо.
- Выберите устройство (мкг / мл), используяE стрелки влево и вправо. Выберите коэффициент 50, используя стрелки влево и вправо. Нажмите OK .
- Нанесите 10 мкл дистиллированной воды в кювету. Поместите кювету в спектрофотометр. Нажмите кнопку OA / 100% T.
- Пипеткой 10 мкл образца ДНК (1/4 разведения в дистиллированной воде) в кювету. Поместите кювету в спектрофотометр. Нажмите зеленую кнопку (чтение / запуск). Обратите внимание на концентрацию.
- Заморозьте образец ДНК при -20 ° C.
3. Протокол HRM-PCR
- Оттепель образцов ДНК. Разбавьте образцы ДНК в 1,5 мл пробирках водой, чтобы довести их до концентрации 10 нг / мкл
ПРИМЕЧАНИЕ. Общий объем разбавленной ДНК должен составлять от 2 до 10 мкл. - Оттепель праймеров. Разбавьте растворы праймеров в 1,5-миллилитровых пробирках водой, чтобы довести их до той же концентрации 6 мкМ.
ПРИМЕЧАНИЕ. Последовательности праймеров и условия реакции представлены в TСпособный 1.
Таблица 1: Грунты и параметры, используемые в анализе плавления с высоким разрешением.
- Оттереть решения набора HRM-PCR и тщательно перемешать путем завихрения, чтобы обеспечить восстановление всего содержимого. Кратко закрутите три флакона, содержащие ферментативную смесь с ДНК-связывающим красителем, MgCl 2 и водой в микроцентрифуге перед их открытием. Храните их при комнатной температуре.
- В пробирке объемом 1,5 мл при комнатной температуре готовят смесь ПЦР для одной реакции 20 мкл путем добавления следующих компонентов в порядке, указанном ниже:
- 10 мкл ферментативной смеси с ДНК-связывающим красителем;
- 2 мкл 25 мМ MgCl 2 ;
- 1 мкл праймера 1, 6 мкМ (конечная концентрация: 300 нМ);
- 1 мкл праймера 2, 6 мкМ (конечная концентрация: 300нМ); а также
- 5 мкл воды.
ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы приготовить смесь ПЦР для более чем одной реакции, умножьте объемы выше на количество реакций, которые будут выполняться, плюс одна дополнительная реакция.
- Тщательно перемешайте, встряхивая.
- Нанесите 19 мкл ПЦР-смеси, приготовленной выше, в каждую лунку белой многолуночной пластины.
- Добавьте 1 мкл шаблона ДНК, скорректированного на концентрацию, подготовленного на этапе 3.1.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для реакций управления всегда выполняйте отрицательный контроль с образцами. Чтобы подготовить отрицательный контроль, замените матричную ДНК водой. - Уплотните белую многолуночную пластину уплотняющей фольгой.
- Поместите белую многолуночную пластину в центрифугу и сравните ее с подходящим противовесом ( т. Е. Другой многолуночной пластиной). Центрифуга в течение 1 мин при 1500 мкг в стандартной центрифуге с поворотным ковшом, содержащей ротор для многолуночных пластин с подходящими адаптерами.
- Загрузите белую многолуночную пластину в прибор HRM-PCR.
- Запустите программу HRM-PCR со следующими условиями ПЦР:
Денатурация: 95 ° С в течение 10 мин; 1 цикл.
Амплификация: 95 ° С в течение 10 с, 62 ° С в течение 15 с и 72 ° С в течение 20 с; 47 циклов.
Кривая плавления: 95 ° С; Скорость рампы: 0,02 ° C / с; 25 приобретений за 1С; 1 цикл.
Охлаждение: 40 ° C в течение 30 с; Скорость рампы 2,2 ° C / с; 1 цикл.
4. Анализ HRM для определения полиморфизма длины CR1
ПРИМЕЧАНИЕ. Описанная методология ( рисунок 5 ) относится к нашему программному обеспечению (см. Таблицу ), хотя могут использоваться другие программные пакеты.
- Откройте программное обеспечение для сканирования генов, чтобы выполнить анализ сканирования полиморфизма длины CR1.
- Откройте эксперимент, содержащий программу усиления и программу кривой плавления.
- Нажмите « Редактор образца» на панели « Модуль», а затем выберите « S»Непрерывный рабочий процесс .
- Определите свойства образцов ( т. Е. Имя, неизвестный или отрицательный контроль).
- Нажмите « Анализ» в панели « Модуль» .
- В списке « Создать новый анализ» выберите « Сканирование гена».
- Перейдите на вкладку « Нормализация », чтобы нормализовать кривые плавления.
- Перейдите на вкладку « Смещение температуры », чтобы сбросить температурную ось (ось х) кривых плавления.
ПРИМЕЧАНИЕ. На нижнем графике показаны кривые плавления, которые как нормализованы, так и сдвинуты по температуре. - Нажмите кнопку « Вычислить» , чтобы проанализировать результаты и определить группировку.
- Перейдите на вкладку « Разностный график » в области диаграмм, чтобы просмотреть нормализованные и сдвинутые кривые плавления и нормализованный график с измененной температурой .
Representative Results
Рисунок 6 A отображает фенотипирование полиморфизма длины CR1 WB. На рисунке 6 B и C показаны кривые, полученные при анализе HRM-PCR, что позволяет определить полиморфизм длины CR1. Анализ кривых слияния с использованием программного обеспечения после плавления с высоким разрешением ампликонов, полученных из ПЦР из геномной ДНК субъектов с различными изоформами CR1, дает кривые, которые различают субъекты в соответствии с их аллотипическими фенотипами экспрессии CR1.
На рисунке 6B показан первый режим представления, называемый «Нормализованные и сдвинутые кривые плавления», а на рисунке 6 C показан второй режим представления, называемый «Нормализованный и сдвинутый по температуре график разностей».
рисунке 6 A : (CR1 * 3, CR1 * 1); (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; И (CR1 * 2, CR1 * 4). Это позволяет генотипировать полиморфизм длины CR1 с использованием этого нового метода молекулярной биологии.
Рисунок 1: Схематическое представление структуры и полиморфизмов белка рецептора комплемента 1. Каждый короткий консенсусный повтор (SCR) или контрольный белок комплемента (CCP) представлен кружком. SCR сгруппированы в повторяющиеся структуры более высокого порядка, называемые LHR. Из внеклеточного домена в клеточную мембрану LHR представляют собой: LHR-A, -B, -C, -D и -S (дополнительный или дополнительный LHR). В наиболее распространенной изоформы CR1(CR1 * 1) сайт связывания с ускоряющей активностью C4b / распада (DAA) расположен на LHR-A (SCR 1-3, зеленые круги), сайт связывания C3b / C4b / кофактор (CA) расположен в 3 N-концевые SCR LHR-B (SCR 8-10, красные круги) и LHR-C (SCR 15-17, пурпурные круги) и сайт связывания для C1q / MBL и фиколина находятся в LHR-D (SCRs) 22-28, синие круги). Гомологические структуры окрашены одинаково. Изоформа CR1 * 2 (S) представляет собой дополнительный LHR (LHR-S) и, таким образом, содержит дополнительный сайт связывания C3b / C4b. KDa, килодалтон. NRC, несмещенные условия. RC, уменьшенные условия. TM, трансмембранный домен. Эта фигура была адаптирована из Brouwers et al. 36 с разрешения издательской группы Nature. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
"/files/ftp_upload/56012/56012fig2.jpg" />
Рисунок 2 : Схематическое представление структуры изоформы CR1 с положением ампликонов последовательностей, полученными HRM-PCR. Каждая коробка представляет собой SCR. SCR сгруппированы в LHR: LHR-A, -B, -C и -D. Гомологические структуры окрашены одинаково. Изоформы CR1 * 2 и CR1 * 4 представляют собой дополнительные LHR (LHR-B) и, следовательно, содержат дополнительную область ампликона (ампликон B, красный). CR1 * 3 не содержит LHR-B и содержит меньшую площадь ампликона (без ампликона B). Нуклеотидные различия между ампликоном B (196 bp) и инвариантным ампликоном (197 bp) изображены соответственно красным и синим цветом. Различия в соотношении: (ампликон B, красный / инвариантный ампликон, синий) между каждой изоформой CR1 определяются HRM-PCR, что позволяет генотипировать. Последовательности праймеров CN3 и CN3re подчеркнуты. TM, трансмембранный домен. CYT, цитоплазматический хвост.Pg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Блок-схема протокола для генотипирования полиморфизма длины CR1 из образцов крови человека. Соберите образец ДНК человека. Извлеките ДНК, чтобы получить образец ДНК-ДНК. Определить концентрацию ДНК и разбавить, чтобы получить концентрацию ДНК при 10 нг / мкл. Используйте HRM-PCR для получения генотипа полиморфизма длины CR1. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 : Скриншоты спектрофотометра Чтобы определить концентрацию ДНК. Нажмите 1 ( A ), чтобы выбрать режим ДНК на спектрофотометре. Выберите длину пути 5 мм ( B ), используя стрелки влево и вправо ( C ). Выберите устройство (мкг / мл) ( D ), используя стрелки влево и вправо ( C ). Выберите коэффициент разбавления 1 ( E ), используя стрелки влево и вправо ( C ). Выберите коэффициент 50 ( F ), используя стрелки влево и вправо. Нажмите OK ( G ). Нанесите 10 мкл дистиллированной воды в кювету. Поместите кювету в спектрофотометр ( H ). Нажмите кнопку OA / 100% T ( I ). Внесите 10 мкл образца ДНК (1/4 разведения в дистиллированной воде) в кювету. Поместите кювету в спектрофотометр ( K ). Нажмите зеленую кнопку (чтение / старт) ( L ). Обратите внимание на концентрацию ( M ).Es / ftp_upload / 56012 / 56012fig4large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Скриншоты графического интерфейса программного обеспечения, используемого в шаге 4 протокола. ( A ) Откройте программное обеспечение для сканирования генов. ( B ) Программа усиления и программа кривой плавления. ( C ) Нажмите « Редактор образца» на панели « Модуль» . ( D ) Выберите Сканирование . ( E ) Определить свойства образцов. ( F ) Нажмите « Анализ» на панели « Модуль» . ( G ) Щелкните на вкладке Нормализация, чтобы нормализовать кривые плавления. ( H ) Нажмите вкладку « Смещение температуры », чтобы отобразить кривые плавления, которые обаНормированные и сдвинутые по температуре. ( I ) Нажмите кнопку « Вычислить» , чтобы проанализировать результаты и определить группировку. ( J ) Нажмите вкладку « Разница », чтобы просмотреть нормализованные и сдвинутые кривые плавления и нормализованный график с измененной температурой . ( K ) Цветная группировка образцов по генотипам длины CR1. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Фенотипирование полиморфизмов длины CR1, наблюдаемых в WB, и их соответствующих кривых профиля, полученных HRM-PCR. ( A ) Фенотипирование полиморфизмов длины CR1 с использованием WB. ( B C ) Генотипирование полиморфизмов длины CR1 с использованием HRM-PCR-анализа. Анализ кривых HRM ампликонов ПЦР, полученных из геномной ДНК субъектов, отображающих различные изоформы CR1, привел к идентификации специфических профилей кривой: (CR1 * 3, CR1 * 1) (фиолетовый); (CR1 * 1, CR1 * 2) (синий); CR1 * 1 (зеленый); CR1 * 2 (красный); И (CR1 * 2, CR1 * 4) (серый). Они соответствуют аллелям полиморфизма длины CR1. Как показано в двух режимах представления: «Нормализованные и сдвинутые кривые плавления» (B) и «Нормированный и сдвинутый по температуре разностный график» (C) - профили кривой распределены в соответствии с (CR1 * 3, CR1 * 1) ; (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; И (CR1 * 2, CR1 * 4). Эта фигура была адаптирована из Махмуди и др. 38 с разрешения Elsevier. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Здесь мы описываем широкодоступную методологию изучения полиморфизма длины CR1. Методы молекулярной биологии для амплификации или сегментарной гибридизации никогда не были в состоянии дать удовлетворительные результаты, которые позволяют определять полиморфизмы длины CR1 у всех людей. Это происходит из-за повторяющейся структуры гена CR1 ( т. Е. Сильно повторяющихся SCR CR1). Описанный здесь метод молекулярной биологии использует количественное распределение LHR-B в молекуле CR1. Молекула CR1 включает в себя n доменов LHR-B, где n представляет собой число от 0 до 3 и только один домен LHR-C, как описано и проиллюстрировано на рисунке 2 . Количественное обнаружение доменов B позволяет отлично различать один дополнительный или отсутствующий домен B.
Из экстрагированного генетического материала первый фрагмент ДНК из LHR-B амплифицируют с помощью ПЦР с использованием одной пары конкретных праймеров, представляющихТипичный вариант LHR-B, называемый «вариант ампликона B.», Второй фрагмент ДНК, называемый «инвариантным ампликоном» и принадлежащий к LHR-C, также усиливается. Этот второй фрагмент ДНК представляет собой фрагмент LHR-C, но также может быть использован еще один инвариантный фрагмент LHR-A или -D.
Два фрагмента ДНК, вариант ампликона B и инвариантный ампликон, амплифицируются одними и теми же праймерами и имеют пять отличий в нуклеотидных последовательностях. Эта характеристика позволяет на следующем этапе определить количество вариабельного ампликона В и количество инвариантных ампликонов с использованием метода количественной молекулярной биологии, HRM, который был адаптирован для этой цели. Соотношение между количеством ампликона B и инвариантным ампликоном (отношение: ампликон B / инвариантный ампликон) изменяется в зависимости от длины молекулы CR1. Действительно, CR1 * 4 отображает 3 единицы ампликона B в 1 инвариантный ампликон, CR1 * 2 отображает 2 блока ампликона B на 1 инвариантный ампликон, CR1 * 1 отображает 1 ампликон B в 1 инвариантный ампликон, а CR1 * 3 отображает 0 единиц ампликона B на 1 инвариантный ампликон ( рисунок 2 ). Таким образом, этот метод HRM-PCR позволяет генотипировать полиморфизм длины CR1.
Тем не менее, в начале исследования этот метод требует использования эталонных испытуемых, чьи фенотипы CR1 уже известны ( т. Е. Ранее установленные WB), чтобы иметь возможность установить генотипирование CR1 в соответствии с эталонным профилем полученных кривых HRM-PCR. Доступны два типа представления: «Нормализованные и сдвинутые кривые плавления» и «Нормализованный и сдвинутый по температуре график разностей». Они показывают отдельные группы профилей кривой, окрашенных в соответствии с фенотипированием полиморфизма длины CR1, полученным WB ( рис. 6 ). Из шага «Нормализованные и сдвинутые кривые плавления» наш метод позволяет различатьЕ различные группы кривых, соответствующие изоформам CR1, сгруппированные по цвету. Однако «нормализованный и сдвинутый по температуре разностный график», который соответствует другому математическому представлению, позволяет легче визуализировать отдельные группы кривых. Хотя программное обеспечение производителя регулярно использовалось в этом исследовании, другое программное обеспечение (например, uANALYSE) можно было использовать в качестве программы извлечения данных для анализа кривой.
На сегодняшний день метод анализа ВБ является исходным методом, позволяющим идентифицировать различные полиморфизмы длины CR1 на уровне белка. Однако этот метод имеет ряд недостатков. В частности, анализ белков WB может быть осуществлен только после извлечения клеточных мембран. В результате это сложное и очень трудоемкое время. Более того, для этого метода требуется получение образца свежей крови в соответствующих условиях в начале процедуры для достижения полезного значенияULTS. Напротив, HRM-PCR, выполняемая на ДНК, позволяет использовать даже сухие пятна крови или образцы после длительного хранения. HMR-PCR требует специализированного инструмента для извлечения расплава ДНК, либо специализированного инструмента, либо термоциклера HMR-емкости с программным обеспечением HRM. Обнаружение SNP зависит от нескольких факторов: i) SNP, включенные в большие фрагменты ПЦР, более трудно обнаружить, чем те же SNP в небольших фрагментах ПЦР; Ii) SNP, принадлежащие к классам III и IV, более трудно обнаружить, чем для классов I и II 34 ; И iii) SNP, которые фланкированы базовой симметрией ближайших соседей ( например, 5'-G (G / C) C-3 '), не могут быть отсортированы путем плавления независимо от мощности разрешения платформы HMR. Может быть полезно протестировать предсказанные фрагменты ПЦР, содержащие интересующий SNP, с программным обеспечением uMELT 35 для оценки достоверности анализа. Наконец, HMR-PCR является аналоговым методом, что означает, что схожесть кривых плавленияWeen ссылка и шаблон не обязательно подразумевают, что последовательность шаблонов идентична ссылке, так как последовательность шаблонов может отличаться от ссылки, но термодинамически эквивалентна. Однако эти ограничения не относятся к описанному здесь методу, который основан на плавлении смеси ампликонов, которые отличаются в терминах 5 нуклеотидных последовательностей.
Кроме того, описанная здесь методика, основанная на анализе HRM, имеет много преимуществ. Во-первых, полиморфизмы длины CR1 определяются быстрее, поскольку результаты получены примерно через 2 часа после того, как была выполнена экстракция генетического материала. Напротив, традиционные биохимические методы, основанные на анализе белков WB, требуют этапов, которые являются относительно длинными: электрофорез клеточных мембран экстрагирует через акриламидный гель, стадию переноса белков на мембрану нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида (PVDF) и стадию идентификации ИзоформыCR1 с помощью иммуногемилюминесценции. Во-вторых, метод HRM-PCR также имеет то преимущество, что он не слишком дорогостоящий, что особенно важно для метода, который может быть применен ко многим людям ( т. Е. Крупномасштабным) для определения их восприимчивости к развитию патологий, таких как болезнь Альцгеймера, Волчанка или малярия.
Недавно мы и другие показали, что изоформа CR1 * 2, которая содержит один дополнительный сайт связывания C3b / C4b, была связана с AD 36 , 37 , 38 . В нашем ранее опубликованном исследовании полиморфизмы длины CR1 на уровне гена и белка были устойчивыми у 98,9% пациентов 38 . Диссонирующие результаты, полученные при сравнении полиморфизмов длины, полученных HRM-PCR, с результатами, полученными WB, соответствовали субъектам с профилем генотипа (CR1 * 1, CR1 * 2), определяемым HRM (ген), но exПрессование только изоформы CR1 * 1 на поверхности эритроцита в соответствии с WB (белок). В нашем исследовании отсутствие экспрессии изоформы CR1 * 2 (индивидуумы, несущие тихую аллель) было воспроизводимым, когда WB выполнялось с более длительным временем воздействия и могло быть объяснено наличием тихой CR1-аллели (CR1 * 2), описанной В литературе Helgeson 39 . Тем не менее, для подтверждения этой гипотезы необходимы дальнейшие исследования более крупных групп населения.
Следует отметить, что частные SNP (SNPs, встречающиеся только в небольшой семейной группе или даже в одном отдельном случае) приводили к различным профилям кривой, которые должны быть дешифрованы с использованием эталонного определения фенотипа (WB), но это нельзя путать с каноническим профилем, чтобы избежать Любое неправильное толкование генотипа полиморфизма длины CR1.
Disclosures
Авторы являются изобретателями патента, принадлежащего Университету Реймса Шампань-Арденны (URCA) (номер заявки WO 2015166194)
Acknowledgments
Мы благодарим всех членов Plateforme Régionale de Biologie Innovante, сотрудников Департамента иммунологии и сотрудников Департамента внутренней медицины и гериатрии, которые внесли вклад в оптимизацию и проверку протокола. Эта работа финансировалась больницами Университета Реймса (номер гранта AOL11UF9156). Мы также благодарим Фиона Экарно (EA3920, Университетская больница Безансон, Франция) за редакционную помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab coat | protection | ||
| SensiCareIce powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 0,5-10µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 20-100µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 100-1000µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| TipOne 10µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| TipOne 1-100µL bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| ART 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
| QIAamp DNA Mini Kit (250) | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 51306 | DNA Extraction |
| Buffer AL | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19075 | Lysis buffer |
| QIAamp Mini Spin Column | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 1011706 | DNA binding |
| Buffer AW1 | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19081 | Wash buffer |
| Buffer AW2 | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19072 | Wash buffer |
| Biowave DNA spectrophotometer | Biochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, England | 80-3004-70 | DNA concentration |
| Mikro 200 centrifuge | Hettich Zentrifugen, D-78532, Germany | 0002020-02-00 | centrifugation |
| Multipette E3 | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4987000010 | distribution |
| Light Cycler 480 multiwell plate 96, white | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04729692001 | reaction place |
| Light Cycler 480 sealing foil | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04429757001 | coverage |
| Heraeus Megafuge 11R centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 75004412 | centrifugation |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 05015278001 | high resolution melting polymerase chain reaction |
| LightCycler 480 High Resolution Melting Master | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04909631001 | reaction reagents |
| light cycler 480 SW 1.5.1 software | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | software used for HRM PCR CR1 polymorphism data analysis | |
| CN3 primer: 5'ggccttagacttctcctgc 3' | Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium | reaction reagent | |
| CN3re primer: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3' | Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium | reaction reagent |
References
- Prince, M., et al. World Alzheimer Report 2015, The Global Impact of Dementia: An analysis of prevalence, incidence, cost and trends. Alzheimer's Disease International. , (2015).
- McKhann, G. M., et al. The diagnosis of dementia due to Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 7 (3), 263-269 (2011).
- Serrano-Pozo, A., Frosch, M. P., Masliah, E., Hyman, B. T.
- Goate, A., et al. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease. Nature. 349 (6311), 704-706 (1991).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375 (6534), 754-760 (1995).
- Levy-Lahad, E., et al. A familial Alzheimer's disease locus on chromosome 1. Science. 269 (5226), 970-973 (1995).
- Mayeux, R., Stern, Y. Epidemiology of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (8), (2012).
- Corder, E. H., et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science. 261 (5123), 921-923 (1993).
- Yu, J. T., Tan, L., Hardy, J. Apolipoprotein E in Alzheimer's disease: an update. Annu Rev Neurosci. 37, 79-100 (2014).
- Lambert, J. C., et al. Genome-wide association study identifies variants at CLU and CR1 associated with Alzheimer's disease. Nat Genet. 41 (10), 1094-1099 (2009).
- Liu, D., Niu, Z. X. The structure, genetic polymorphisms, expression and biological functions of complement receptor type 1 (CR1/CD35). Immunopharmacol Immunotoxicol. 31 (4), 524-535 (2009).
- Jacquet, M., et al. Deciphering complement receptor type 1 interactions with recognition proteins of the lectin complement pathway. J Immunol. 190 (7), 3721-3731 (2013).
- Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
- Cosio, F. G., Shen, X. P., Birmingham, D. J., Van Aman, M., Hebert, L. A. Evaluation of the mechanisms responsible for the reduction in erythrocyte complement receptors when immune complexes form in vivo in primates. J Immunol. 145 (12), 4198-4206 (1990).
- Krych-Goldberg, M., Moulds, J. M., Atkinson, J. P. Human complement receptor type 1 (CR1) binds to a major malarial adhesin. Trends Mol Med. 8 (11), 531-537 (2002).
- Cohen, J. H., Geffriaud, C., Caudwell, V., Kazatchkine, M. D. Genetic analysis of CR1 (the C3b complement receptor, CD35) expression on erythrocytes of HIV-infected individuals. Aids. 3 (6), 397-399 (1989).
- Rogers, J., et al. Complement activation by beta-amyloid in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (21), 10016-10020 (1992).
- Rogers, J., et al. Peripheral clearance of amyloid beta peptide by complement C3-dependent adherence to erythrocytes. Neurobiol Aging. 27 (12), 1733-1739 (2006).
- Krych-Goldberg, M., Atkinson, J. P. Structure-function relationships of complement receptor type 1. Immunol Rev. 180, 112-122 (2001).
- Klickstein, L. B., et al. Human C3b/C4b receptor (CR1). Demonstration of long homologous repeating domains that are composed of the short consensus repeats characteristics of C3/C4 binding proteins. J Exp Med. 165 (4), 1095-1112 (1987).
- Hourcade, D., Miesner, D. R., Atkinson, J. P., Holers, V. M. Identification of an alternative polyadenylation site in the human C3b/C4b receptor (complement receptor type 1) transcriptional unit and prediction of a secreted form of complement receptor type 1. J Exp Med. 168 (4), 1255-1270 (1988).
- Krych, M., Hourcade, D., Atkinson, J. P. Sites within the complement C3b/C4b receptor important for the specificity of ligand binding. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (10), 4353-4357 (1991).
- Krych-Goldberg, M., et al. Decay accelerating activity of complement receptor type 1 (CD35). Two active sites are required for dissociating C5 convertases. J Biol Chem. 274 (44), 31160-31168 (1999).
- Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
- Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. J Exp Med. 192 (12), 1797-1808 (2000).
- Cornillet, P., Philbert, F., Kazatchkine, M. D., Cohen, J. H. Genomic determination of the CR1 (CD35) density polymorphism on erythrocytes using polymerase chain reaction amplification and HindIII restriction enzyme digestion. J Immunol Methods. 136 (2), 193-197 (1991).
- Moulds, J. M., Nickells, M. W., Moulds, J. J., Brown, M. C., Atkinson, J. P. The C3b/C4b receptor is recognized by the Knops, McCoy, Swain-langley, and York blood group antisera. J Exp Med. 173 (5), 1159-1163 (1991).
- Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sang. 62 (4), 230-235 (1992).
- Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. J Exp Med. 164 (1), 50-59 (1986).
- Wong, W. W., et al. Structure of the human CR1 gene. Molecular basis of the structural and quantitative polymorphisms and identification of a new CR1-like allele. J Exp Med. 169 (3), 847-863 (1989).
- Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in Caucasian and African American populations. Clin Immunol Immunopathol. 87 (2), 176-183 (1998).
- Rowe, J. A., et al. Erythrocyte CR1 expression level does not correlate with a HindIII restriction fragment length polymorphism in Africans; implications for studies on malaria susceptibility. Genes Immun. 3 (8), 497-500 (2002).
- Birmingham, D. J., et al. A polymorphism in the type one complement receptor (CR1) involves an additional cysteine within the C3b/C4b binding domain that inhibits ligand binding. Mol Immunol. 44 (14), 3510-3516 (2007).
- Venter, J. C., et al. The sequence of the human genome. Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Brouwers, N., et al. Alzheimer risk associated with a copy number variation in the complement receptor 1 increasing C3b/C4b binding sites. Mol Psychiatry. 17 (2), 223-233 (2012).
- Hazrati, L. N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2945-2949 (2012).
- Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiol. Aging. 36, 1712-1765 (2015).
- Helgeson, M., Swanson, J., Polesky, H. F. Knops-Helgeson (Kna), a high-frequency erythrocyte antigen. Transfusion. 10 (3), 137-138 (1970).
