Summary
여기에서는 여러 가지 용도, 특히 알츠하이머 질환 (Alzheimer 's disease, AD)과 같은 질병에 대한 감수성 평가에 사용하기 위해 보체 수용체 1 (CR1) 길이 다형성을 결정하는 혁신적인 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 AD의 병인에 CR1 isoforms의 역할을 더 잘 이해하는 데 유용 할 수 있습니다.
Abstract
선천성 면역계에서 중요한 역할을하는 막 관내 당 단백질 인 보체 수용체 1 (CR1)은 많은 세포 유형에서 발현되지만, 특히 적혈구 세포 (RBC)에서 발현됩니다. 보체 성분 C3b 및 C4b에 대한 수용체로서, CR1은 보체 캐스케이드의 활성화를 조절하고 알츠하이머 병 (AD)에서의 면역 복합체 및 세포 잔해뿐만 아니라 아밀로이드 베타 (Aβ) 펩타이드의 식균 작용을 촉진시킨다. CR1 유전자에서 AD 관련 단일 염기 다형성 (SNP)과 카피 수 변이 (CNV)를 확인한 몇몇 연구가있다. 여기, 우리는 CR1 수용체의 길이 다형성을 결정하는 혁신적인 방법을 설명합니다. 수용체는 긴 동질 반복 (LHR) -LHR-A, LHR-C 및 LHR-D-와 n 도메인 인 LHR-B (n은 0과 3 사이의 정수)라는 3 개의 도메인을 포함합니다. 특정 프라이머의 경우, 유전 물질을 사용하여 LHR-B 도메인의 제 1 단편 (the 변형 앰플 리콘 B) 및 LHR-C 도메인의 제 2 단편 (불변 앰플 리콘)을 포함한다. 변이 형 증폭 자 B 및 불변 형 증폭 변이체는 상기 프라이머의 혼성화 영역 외부의 5 개 뉴클레오티드에서 차이를 나타낸다. 변이 형 앰플 리콘 B 및 불변 형 앰플 리콘의 수는 정량적 도구 (고해상도 용융 (HRM) 곡선)를 사용하여 추론되며, 변이 형 앰플 리콘 B 대 불변 형 앰플 리콘의 비율은 CR1 길이 다형성에 따라 상이하다. 이 방법은 새로운 물질을 필요로하지 않고 저렴하고 빠르며 더 큰 집단에 적용 할 수 있기 때문에 정식 표현형 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 따라서이 방법의 사용은 AD와 같은 질병의 병인에 CR1 isoforms의 역할을 더 잘 이해하는 데 도움이된다.
Introduction
치매의 가장 흔한 원인 인 AD는 전 세계적으로 3 천만 명 이상의 사람들에게 영향을 미치며 주요 공중 보건 문제 1 입니다. 임상 적으로 AD는 neurocognitive 장애로 특징 지어져 자율성 2 의 점진적 손실을 초래합니다. AD는 두 가지 신경 병리학 적 특징, 즉 세포 외 아밀로이드 침전물과 세포 내 신경 원 섬유 엉킴 3을 특징으로 합니다.
전통적으로, 질병의 발병 연령에 따라, AD는 두 가지 형태로 분류됩니다. 첫 번째는 초기 발병 형 AD (EOAD)로 65 세 이전에 발병이 가장 흔히 발생합니다. 이 형태는 AD 사례의 5 % 미만을 차지합니다. Amyloid precursor protein ( APP) 4 , presenilin 1 ( PSEN1 ) 5 또는 presenilin 2 ( PSEN2 )에서 완전히 침투성 돌연변이를 일으키는 드문 상 염색체 우성 AD 형태입니다.> 6 유전자. 둘째, 더 흔한 형태의 질병 (AD 사례의 90 % 이상)은 "산발적 인"후기 발병 광고 (LOAD)라고하며, 대부분 65 세 이상의 개인에서 발생합니다. 여러 가지 유전 적 및 환경 적 위험 요소로 인해 발생합니다. 7 . LOAD에서 아포지 단백질 E (APOE) 유전자의 대립 유전자 (4)의 주요 위험 인자 유전자 (8, 9)이다. 더욱이, 20 개 이상의 유전자좌가 AD의 위험과 연관되어있는 게놈 - 와이드 연관 연구 (GWAS)에 의해 확인되었으며, 그 중 하나는 보체 성분 (3b / 4b) 수용체 1 ( CR1 ) 유전자 10 보체 관련 단백질 군의 1q32 염색체. CR1 유전자는 보체 활성 조절 인자의 구성 요소 인 보체 수용체 유형 1 (CR1) 단백질을 코딩한다.
CR1 (C3b / C4b 수용체, CD35), approximat의 transmembrane glycoprotein엘리 200 kDa의도 11에서,는 C3b, C4b, C3bi, C1q에, 만난 결합 렉틴 (MBL)에 결합하고, 단백질 12 보완 ficolin. CR1의 생물학적 기능은 그것이 발현되는 세포 유형에 따라 다양합니다. 사람의 경우 순환하는 CR1의 90 %가 적혈구 (RBC)에서 발견됩니다 13 . RBC의 표면에 존재하는 CR1은 C3b- 또는 C4b- 옵 소닌 화 된 미생물 또는 면역 복합체에 결합하여 혈액 순환을 원활하게합니다. RBC가 간과 비장을 통과 할 때 CR1에 결합 된 복합체는 실제로 식세포로 전달됩니다 11 , 14 . C3b 및 C4b의 침착을 제한함으로써, CR1은 과도한 보체 활성화를 방지 할 수있다. 따라서, RBCs에 대한 CR1의 발현은 대뇌 신경계와 같은 조직의 면역 복합체 침착 및 그로 인한 질병에 대한 보호에 필수적인 요소로 간주된다. 적혈구의 CR1은 또한병원성 감염에 중요한 역할을한다 15 , 16 . 또한, CR1은 타고난 면제의 핵심 역할을 담당하며, 보체 캐스케이드의 조절과 면역 복합체의 수송 및 제거에 관여한다. CR1은 C3b 및 C4b 단편을 결합시키고 고전 및 대안 전환 효소 (C4b2a 복합체로부터의 C2a의 해리 및 C3bBb 복합체로부터의 C3b의 해리)를 해리시킴으로써이 활성을 발휘한다. 혈장 세린 프로테아제 인자 I (FI)의 보조 인자로서, CR1은 FI에 의한 C4b 및 C3b의 절단을 증가시키고, 보조 인자 활성 (CA)으로 알려진 특성을 증가시키고, C3 증폭 루프를 억제함으로써 고전 및 대안 보체 경로를 저해한다 차례로 추가 보체 활성화를 방지합니다. Rogers와 동료는 Aβ 펩타이드가 항체 17 의 부재하에 보체 경로에 결합하고 활성화 할 수 있다는 증거를 제시하고 Aβ 펩타이드가 clRBCs 18에 표현 된 CR1에 보체 의존적 순응을 통해 혈액 순환이 시작되었다.
CR1은 구조적 또는 길이의 다형성, 밀도 다형성, Knops 혈액형 다형성 11 , 19의 세 가지 유형의 다형성을 나타냅니다. 구조 다형성은 긴 상 동성 반복 (LHR)의 수의 변화와 관련이 있으며 따라서 4 개의 동형을 정의합니다. 사실 CR1 단백질의 세포 외 도메인은 SCR (short consensus repeats) 또는 CCPs (complement control repeat)라고하는 일련의 반복 단위로 구성됩니다. 이러한 SCR은 CR1을 코딩하는 complement deoxyribonucleic acid (cDNA)로부터 증명되었습니다. SCR은 LHR로 알려진 7 개의 직렬 그룹으로 배열됩니다. CR1은 7 개의 SCR 유닛 ( 19 , 20 , 21 ) 의 복제로 인해 발생하는 LHR-A, -B, -C 및 -D로 지정된 4 개의 LHR로 배열된다 .21 .
주파수의 증가 순서에서 서양 얼룩 (WB)에 의해 결정 CR1 * 1 (A / F) (겔 전기 영동에 빠른 이동), CR1 * 2 (B / S) (겔 전기 영동에 느린 마이 그 레이션), CR1 * 3 (C / F`), CR1 * 4 (D). CR1 * 1 (A / F)과 CR1 * 2 (B / S)는 각각 4 개의 LHR과 5 개의 LHR로 구성되며 CR1 * 3 (C / F`)와 CR1 * 4 )는 각각 3 개의 LHR과 6 개의 LHR로 구성됩니다. 30 개의 SCR로 구성된 가장 일반적인 isoform (CR1 * 1)은 세 개의 C4b 결합 부위 (SCR 1-3, 8-10, 15-17)와 두 개의 C3b 결합 부위 (SCR 8-10과 15-17) SCR 22-28은 C1q, ficolins 및 MBL 12 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25를 결합한다 . 따라서, CR1 * 2는 하나의 추가적인 C3b / C4b 결합 부위를 포함한다d부터 CR1 * 1. 그림 1 은 CR1의 4 가지 다른 이소 형의 구조, 명칭 및 분자량을 보여줍니다.
밀도 다형성은 적혈구에서 CR1의 구성 적 발현 수준을 나타내는 안정한 표현형에 해당한다. 건강한 백인 환자에서는 RBC 당 CR1 분자의 수는 26 (셀 당 150 1,200 분자 변화) 10 배까지에 따라 다를 수 있음을 보였다. Helgeson 표현형의 적혈구는 CR1 밀도가 매우 낮아 세포 당 150 분자보다 낮은 것으로 나타났습니다 27 , 28 . 적혈구에 CR1 밀도 유전자 힌 DIII 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) (29)와 대응 지어진 CR1 유전자의 염색체 codominant biallelic 시스템과 관련된다. 인트론 27에서 CR1 유전자의 단일 지점 돌연변이, 두 번째 돌연변이를 암호화하는 엑손LHR-D의 SCR은이 영역 내에서 다형성 Hin dIII 사이트를 생성합니다 30 . 7.4 및 6.9 kDa의 게놈 Hin dIII 단편은 각각 적혈구의 높은 (H 대립 형) 또는 낮은 (L 대립 형) CR1 밀도와 관련된 대립 유전자를 식별한다. 그러나, 상관 관계는 일부 서 아프리카 인구 31, 32에서 적혈구와 힌 DIII 다형성에 CR1 밀도 사이에서 발견되지 않았다. CR1 밀도 조절과 비 코딩 Hin dIII 다형성을 연결하는 메커니즘은 알려져 있지 않다. 여러 다형성 중에서 SCR16의 Q981H와 SCR28의 P1786R은 RBC 30 , 33 의 CR1 밀도와 관련이 있다고보고되었습니다.
Knops (KN) 다형성은 국제 명명법에 따라 International Blood Transfusion Society에서 색인을 생성 할 22 번째 혈액 그룹 시스템입니다. 9 개의 항원 특이성KN1 / KN2, KN3 / KN6, KN4 / KN7 등 세 가지 항원 항원, KN5, KN8, KN9를 포함하여 적혈구에 CR1이 표현한 혈색소가있다. KN1, KN3, KN4 및 KN5 항원은 KN 시스템의 고주파 항원 ( 즉, 일반 인구의 99 % 이상에서 표현됨)입니다. 그러나 AD에서이 다형성의 역할은 아직 결정되지 않았다 .
이 연구에서 설명 된 프로토콜은 AD, 전신성 홍 반성 루푸스 및 말라리아와 같은 여러 질병에 대한 감수성과 관련된 CR1 길이 다형성 유전자형을 결정하기 위해 고안되었습니다. CR1 길이 다형성 결정을위한 우리의 방법은 CR1 isoform을 포함하는 LHR-Bs의 수와 LHR-B와 LHR-C 사이의 서열 차이를 이용한다 ( 그림 2 ).
Protocol
인간 혈액 채취 및 취급에 대한 프로토콜은 지역 윤리위원회 (CPP Est II)에서 검토 및 승인되었으며 프로토콜 번호는 2011-A00594-37입니다.
참고 : 다음 프로토콜은 사람의 혈액 취급에 대해 설명합니다. 생물학적 유해 물질을 폐기하는 동안 기관 지침을 따르십시오. 실험실 코트와 장갑과 같은 실험실 안전 장비를 착용해야합니다. 프로토콜을 설명하는 플로우 차트가 그림 3에 나와 있습니다.
1. 혈액 및 체액 DNA 추출
- 1.5 ML 튜브의 바닥에 proteinase K (15 μg / μL) 20 μL를 피펫.
- 1.5 mL 튜브에 시료 200 μL를 넣으십시오. 200 μL의 전혈, 혈장, 혈청, 버피 코트 또는 체액을 사용하거나 PBS 200 μL 중 5 x 106 개의 림프구를 사용하십시오.
- 샘플에 용해 버퍼 200 μL를 추가합니다. 15 초 동안 펄스 보 텍싱하여 혼합합니다.
- 56 ° C에서 10 분 동안 수 욕조에서 품어 낸다.
- 1.5 mL 튜브를 간단히 원심 분리하여 뚜껑 안의 방울을 제거합니다.
- 시료에 에탄올 (96-100 %) 200 μL를 넣고 15 초 동안 펄스 보 텍싱하여 다시 혼합하십시오. 혼합 후 1.5 mL 튜브를 간단히 원심 분리하여 뚜껑 안쪽의 방울을 제거합니다.
- 조심스럽게 1.6 mL의 혼합물을 멤브레인 컬럼 (2 mL 수집 튜브 내)에 바릅니다. 림을 적시 지 않고 캡을 닫고 6,000 xg에서 1 분간 원심 분리하십시오. 멤브레인 컬럼을 깨끗한 2-mL 수집 튜브에 넣고 여과 액이 들어있는 튜브를 버립니다.
- 조심스럽게 멤브레인 컬럼을 열고 림을 적시 지 않고 세척 버퍼 1 500 μL를 첨가하십시오. 캡을 닫고 6,000 xg에서 1 분간 원심 분리합니다. 막 컬럼을 깨끗한 2 ML 수집 튜브에 넣고 여과 액이 들어있는 튜브를 버립니다.
- 조심스럽게 멤브레인 컬럼을 열고 젖음없이 500 ㎕의 세척 완충액 2를 첨가하십시오.가장자리. 캡을 닫고 최고 속도 (20,000 xg)로 3 분간 원심 분리합니다.
- 멤브레인 컬럼을 새로운 2 mL 수집 튜브에 넣고 여과 액과 함께 수집 튜브를 버립니다. 1 분 동안 20,000 xg에서 원심 분리하십시오.
- 막 컬럼을 깨끗한 1.5 mL 튜브에 놓고 여과 액이 들어있는 수집 튜브를 버립니다.
- 조심스럽게 멤브레인 컬럼을 열고 증류수 200 μL를 첨가하십시오. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션 한 다음, 1 분 동안 6,000 xg에서 원심 분리한다.
- DNA 농도 단계를 결정하거나 -20 ° C에서 DNA 샘플을 동결하십시오
2. DNA 농도의 결정
참고 : 그림 4를 참조하십시오.
- 분광 광도계에서 DNA 모드를 선택하려면 1을 누릅니다. 왼쪽 및 오른쪽 화살표를 사용하여 5mm 경로 길이를 선택하십시오. 왼쪽 및 오른쪽 화살표를 사용하여 희석 배수 1을 선택하십시오.
- th 단위를 사용하여 단위 (μg / mL)를 선택하십시오왼쪽 및 오른쪽 화살표. 왼쪽 및 오른쪽 화살표를 사용하여 계수를 50으로 선택하십시오. 확인을 누릅니다 .
- 10 μL의 증류수를 큐벳에 넣습니다. 분광 광도계에 큐벳을 넣으십시오. OA / 100 % T 버튼을 누르십시오.
- DNA 시료 (증류수에서 1/4 희석) 10 μL를 큐벳에 넣으십시오. 분광 광도계에 큐벳을 넣으십시오. 녹색 버튼 (읽기 / 시작)을 누릅니다. 농도에주의하십시오.
- -20 ° C에서 DNA 샘플을 동결하십시오.
3. HRM-PCR 프로토콜
- DNA 샘플을 녹여 라. 10 ng / μL의 농도로 그들을 조정하는 물로 1.5 ML 튜브에 DNA 샘플을 희석
참고 : 희석 된 DNA의 총 부피는 2 μL와 10 μL 사이 여야합니다. - 프라이머 용액을 녹입니다. 물로 1.5 ML 튜브에 뇌관 솔루션을 희석 6 μM의 동일한 농도로 그들을 조정합니다.
참고 : 프라이머 서열과 반응 조건은 T능력있는 1.
표 1 : 고해상도 용융 분석에 사용 된 프라이머 및 매개 변수.
- HRM-PCR 키트 솔루션을 해동하고 볼 텍싱으로 조심스럽게 섞어 모든 내용물을 회수하십시오. 간단히 DNA 연결 염료, MgCl 2 및 물과 함께 효소 혼합물을 포함하는 세 개의 유리 병을 마이크로 원심 분리기에서 회전 시켜서여십시오. 실내 온도에 보관하십시오.
- 상온에서 1.5 mL 튜브에 아래의 순서대로 다음의 성분을 첨가하여 20 μL 반응 1 회분의 PCR 혼합물을 준비한다 :
- DNA 결합 염료와 효소 혼합물 10 μL;
- 25 밀리미터의 MgCl 2 2 μL;
- 1 μL의 프라이머 1, 6 μM (최종 농도 : 300 nM);
- 1 μL의 프라이머 2, 6 μM (최종 농도 : 300nM); 과
- 5 μL의 물.
참고 : 두 개 이상의 반응에 대해 PCR mix를 준비하려면 위의 볼륨에 실행될 반응 수와 추가 반응 1을 곱합니다.
- 볼 텍싱으로 조심스럽게 섞는다.
- 위에 준비된 PCR 믹스 19 μL를 흰색 멀티 웰 플레이트의 각 구멍에 넣습니다.
- 단계 3.1에서 준비한 농도 조정 DNA 템플릿 1 μL를 추가합니다.
참고 : 대조군 반응의 경우, 항상 샘플을 사용하여 음성 대조군을 실시하십시오. 음성 대조군을 준비하려면 주형 DNA를 물로 교체하십시오. - 밀봉 용 호일로 흰색 멀티 웰 플레이트를 밀봉하십시오.
- 원심 분리기에 흰색 멀티 웰 플레이트를 놓고 적절한 균형추 ( 즉, 다른 멀티 웰 플레이트)와 균형을 맞 춥니 다. 적합한 어댑터가있는 멀티 웰 플레이트 용 로터가 포함 된 표준 스윙 버킷 원심 분리기에서 1,500 xg로 1 분간 원심 분리하십시오.
- 흰색 멀티 웰 플레이트를 HRM-PCR 장비에로드하십시오.
- 다음 PCR 조건으로 HRM-PCR 프로그램을 시작하십시오 :
변성 : 95 ℃에서 10 분; 1 사이클.
증폭 : 10 초 동안 95 ℃, 15 초 동안 62 ℃, 20 초 동안 72 ℃; 47주기.
용융 곡선 : 95 ° C; 램프 속도 : 0.02 ° C / s; ° C 당 25 회의 인수; 1 사이클.
냉각 : 30 초 동안 40 ℃; 램프 속도 2.2 ° C / s; 1 사이클.
4. CR1 길이 다형성을 결정하기위한 HRM 분석
참고 : 설명 된 방법 ( 그림 5 )은 다른 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있지만 우리 소프트웨어 ( 표 5 참조)에만 적용됩니다.
- 유전자 스캐닝 소프트웨어를 열어 CR1 길이 다형성 스캐닝 분석을 수행하십시오.
- 증폭 프로그램과 용융 곡선 프로그램이 포함 된 실험을 엽니 다.
- 모듈 막대에서 샘플 편집기 를 클릭 한 다음 S 를 선택하십시오.통조림 작업 흐름 .
- 샘플의 속성 ( 예 : 이름, 알 수없는 컨트롤 또는 부정적인 컨트롤)을 정의합니다.
- 모듈 막대에서 분석 을 클릭하십시오.
- Create New Analysis 목록에서 Gene Scanning을 선택하십시오 .
- 녹는 곡선을 정규화하려면 정규화 탭을 클릭하십시오.
- 온도 이동 탭을 클릭하여 용융 곡선의 온도 축 (x 축)을 재설정합니다.
참고 : 아래 그래프는 표준화되고 온도 이동 된 용융 곡선을 보여줍니다. - 계산 버튼을 클릭하여 결과를 분석하고 그룹화를 결정합니다.
- 차트 영역에서 Difference plot 탭을 클릭하여 Normalized and Shifted Melting Curve 와 Normalized and Temperature Shifted Difference Plot을 봅니다.
Representative Results
도 6 A는 WB로 CR1 길이 다형성의 표현형을 표시한다. 도 6 B 및 C는 CR1 길이 다형성 결정을 가능 HRM-PCR 분석에서 수득 된 곡선을 표시한다. 상이한 CR1 동종 형을 갖는 피험자의 게놈 DNA로부터 PCR- 유도 된 앰플 리콘의 고 - 해상도 용융 후 소프트웨어를 사용하여 융합 곡선을 분석하면, 그의 동종 형 CR1 발현 표현형에 따라 피험자를 구별하는 곡선이 생성된다.
도 6은 C라는 프레젠테이션의 제 2 모드를 표시하는 동안,도 6 B는 "정규화 시프트 된 용융 곡선"이라고 프레젠테이션의 제 1 모드를 표시 "노멀라이징 온도 시프트 차이 플롯."
프로파일은도 6 (A)에 표시되는 표현형을 나타내는 그룹에 따라 분배된다 (CR1 * 3 * 1 CR1); (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; 및 (CR1 * 2, CR1 * 4). 이것은 새로운 분자 생물학 방법을 사용하여 CR1 길이 다형성의 유전자 타이핑을 가능하게합니다.
그림 1 : 보체 수용체 1 단백질의 구조와 다형성의 도식적 표현. 각 SCR (short consensus repeat) 또는 CCP (complement control protein)는 원으로 표시됩니다. SCR은 LHR이라고하는 반복적 인 고차원 구조로 그룹화됩니다. 세포 외 도메인에서 세포막에 이르기까지 LHR은 LHR-A, -B, -C, -D 및 -S (보충 또는 추가 LHR)입니다. 가장 일반적인 CR1 isoform(CR1 * 1), C4b / 쇠약 촉진 활성 (DAA) 결합 부위는 LHR-A (SCR1-3, 녹색 원)에 위치하고, C3b / C4b / 코 팩터 활성 (CA) 결합 부위는 3 LHR-D (SCR 8-10, 빨간색 원) 및 LHR-C (SCR 15-17, 자주색 원)의 N 말단 SCR 및 C1q / MBL 및 ficolin의 결합 자리는 LHR-D (SCR 22-28, 파란색 동그라미). 상 동성 구조는 동일하게 착색된다. CR1 * 2 (S) 이형 체는 추가의 LHR (LHR-S)을 제공하며 따라서 추가의 C3b / C4b 결합 부위를 포함합니다. KDa, kilodalton. NRC, 비 감축 조건. RC, 감소 된 조건. TM, 막 횡단 도메인. 이 수치는 Brouwers et al. Nature Publishing Group의 허락하에 36 세 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2 : HRM-PCR로 얻은 서열 amplicon 위치를 갖는 CR1 isoform 구조의 개략도. 각 상자는 SCR을 나타냅니다. SCR은 LHR : LHR-A, -B, -C 및 -D로 그룹화됩니다. 상 동성 구조는 동일하게 착색된다. CR1 * 2 및 CR1 * 4 isoforms 추가 LHRs (LHR - B)를 제시하고 따라서 추가 amplicon 영역 (amplicon B, 빨간색으로)를 포함하고 있습니다. CR1 * 3은 LHR-B가 결핍되어 있으며 앰플 리콘 영역이 적습니다 (앰플 리콘 B가 없음). 증폭 산물 B (196 bp)와 불변 증폭 산물 (197 bp) 사이의 염기 차이는 각각 빨간색과 파란색으로 표시됩니다. 각 CR1 이소 형 사이의 비율 : (적색 / 불변 앰플 리콘에서의 증폭 물 B)은 HRM-PCR에 의해 결정되어 유전자형을 가능하게한다. CN3 및 CN3re 프라이머 서열은 밑줄을 그었다. TM, 막 횡단 도메인. CYT, 세포질 꼬리.pg "target ="_ blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 인간 혈액 샘플에서 CR1 길이 다형성을 genotyping 프로토콜의 순서도. 인간의 DNA 샘플을 수집하십시오. DNA 혈액 샘플을 얻기 위해 DNA를 추출하십시오. DNA 농도를 결정하고 10 ng / μL에서 DNA 농도를 얻기 위해 묽게하십시오. HRM-PCR을 사용하여 CR1 길이 다형성 유전자형을 얻습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 분광 광도계의 스크린 샷 DNA 농도를 결정하기 위해 에드. 분광 광도계에서 DNA 모드를 선택하려면 1 ( A )를 누르십시오. 왼쪽 및 오른쪽 화살표 ( C )를 사용하여 5mm 경로 길이 ( B )를 선택하십시오. 왼쪽 및 오른쪽 화살표 ( C )를 사용하여 단위 (μg / mL) ( D )를 선택하십시오. 왼쪽 및 오른쪽 화살표 ( C )를 사용하여 희석 배수 1 ( E )을 선택하십시오. 왼쪽 및 오른쪽 화살표를 사용하여 계수 50 ( F )을 선택하십시오. OK ( G )를 누릅니다 . 10 μL의 증류수를 큐벳에 넣습니다. 분광 광도계 ( H )에 큐벳을 넣으십시오. OA / 100 % T 버튼 ( I )을 누르십시오. 10 μL의 DNA 시료 (증류수에서 1/4 희석)를 큐벳에 넣습니다. 분광 광도계 ( K )에 큐벳을 넣으십시오. 녹색 버튼 (읽기 / 시작) ( L )을 누릅니다. 농도 ( M )에주의하십시오.es / ftp_upload / 56012 / 56012fig4large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 프로토콜의 4 단계에서 사용 된 소프트웨어 그래픽 인터페이스의 스크린 샷. ( A ) 유전자 스캐닝 소프트웨어를 엽니 다. ( B ) 증폭 프로그램 및 용융 곡선 프로그램. ( C ) 모듈 막대에서 샘플 편집기 를 클릭하십시오. ( D ) 스캐닝을 선택하십시오. ( E ) 시료의 성질을 정의한다. ( F ) 모듈 막대에서 분석 을 클릭하십시오. ( G ) Normalization 탭을 클릭하여 용융 곡선을 정규화합니다. ( H ) Temperature Shift (온도 이동) 탭을 클릭하여 둘 다인 녹는 곡선을 표시합니다표준화 및 온도 이동. ( I ) 계산 버튼을 클릭하여 결과를 분석하고 그룹을 결정합니다. ( J ) Differential plot 탭을 클릭하여 Normalized and Shifted Melting Curve 와 Normalized and Temperature Shifted Difference Plot을 봅니다. ( K ) CR1 길이 유전자형에 따른 샘플의 컬러 그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : WB에서 관찰 된 CR1 길이 다형성의 표현형 및 HRM-PCR로 얻은 해당 프로파일 곡선. ( A ) WB를 사용하여 CR1 길이 다형성의 Phenotyping. ( B C ) HRM-PCR 분석을 이용한 CR1 길이 다형성의 유전자형 분석. 상이한 CR1 동종 형을 나타내는 피험자의 게놈 DNA로부터 얻어진 PCR 증폭 물의 HRM 곡선 분석은 특정 곡선 프로파일의 확인을 유도 하였다 : (CR1 * 3, CR1 * 1) (보라색); (CR1 * 1, CR1 * 2) (청색); CR1 * 1 (녹색); CR1 * 2 (적색); 및 (CR1 * 2, CR1 * 4) (회색). 이들은 CR1 길이 다형성 대립 유전자에 해당한다. "표준화 및 시프트 된 녹는 곡선"(B) 및 "표준화 및 온도 변위의 차이 플롯"(C) - 곡선 프로파일은 (CR1 * 3, CR1 * 1)에 따라 분포되어 있으며, ; (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; 및 (CR1 * 2, CR1 * 4) 그룹. 이 수치는 Mahmoudi et al. Elsevier의 허락하에 38 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에서는 CR1 길이 다형성을 연구하기 위해 널리 접근 할 수있는 방법을 설명합니다. 증폭 또는 분절 형 혼성화를위한 분자 생물학 기술은 모든 개체에서 CR1 길이 다형성을 결정할 수있는 만족스러운 결과를 제공 할 수 없었습니다. 이것은 CR1 유전자의 반복적 인 구조 ( 즉, CR1의 반복적 인 SCR) 때문입니다. 여기에 설명 된 분자 생물학 방법은 CR1 분자에서 LHR-B의 정량적 분포를 이용합니다. CR1 분자는 그림 2 에서 설명한 바와 같이 n 개의 LHR-B 도메인을 포함하며, n은 0과 3 사이의 숫자이며 단 하나의 LHR-C 도메인을 포함합니다. 정량적 도메인 B 탐지는 하나의 추가 또는 누락 된 도메인 B를 완벽하게 식별 할 수있게합니다.
추출 된 유전 물질로부터, LHR-B로부터의 첫번째 DNA 단편을 특정 프라이머 쌍을 사용하여 PCR로 증폭시키고, represen"variant amplicon B"라 불리는 LHR-B의 특징적인 변이 형체가있다. "불변 증폭기 병원체"라고 불리는 LHR-C에 속하는 두 번째 DNA 단편도 증폭됩니다. 이 두 번째 DNA 단편은 LHR-C의 단편이지만 LHR-A 또는 -D의 또 다른 불변 단편도 사용할 수 있습니다.
두 개의 DNA 단편, 변이 증폭 물 B 및 불변 증폭 물은 동일한 프라이머에 의해 증폭되고 뉴클레오티드 서열에서 5 가지 차이를 나타낸다. 이 특성은 후속 단계에서이 목적을 위해 적응 된 정량적 분자 생물학 도구 인 HRM을 사용하여 변이 형 amplicon B의 수와 불변 amplificon의 수를 결정할 수있게합니다. amplicon B와 invariant amplicon의 비율 (비율 : amplicon B / invariant amplicon) 사이의 비율은 CR1 분자의 길이에 따라 다양합니다. 실제로, CR1 * 4는 3 개의 증폭 산물 B 단위를 1 개의 불변 증폭 산물로 표시하고, CR1 * 2는 2 개의 증폭 산물 B 단위를 1 개의 불변 증폭 산물로, CR1 * 1은 1 개의 증폭 산물 B를 1 개의 불변 증폭 산물로 표시하고, CR1 * 3은 0 개의 증폭 산물 B 단위를 1 개의 불변 증폭 산물로 표시합니다 ( 그림 2 ). 따라서,이 HRM-PCR 방법은 CR1 길이 다형성의 유전자형을 가능하게한다.
그럼에도 불구하고,이 기술은 연구 초기에 얻어진 곡선의 기준 프로파일에 따라 CR1의 유전형을 확립 할 수 있도록 CR1 표현형이 이미 알려져있는 ( 즉, 이전에 WB에 의해 확립 된) 참조 피험자의 사용을 필요로한다 HRM-PCR에 의해 "Normalized and Shifted Melting Curves"와 "Normalized and Temp-Shifted Difference Plot"의 두 가지 유형의 표현이 가능합니다. WB가 얻은 CR1 길이 다형성 표현형에 따라 색깔이 다른 곡선 프로파일 그룹을 표시합니다 ( 그림 6 ). "Normalized and Shifted Melting Curves"단계에서 우리의 방법은 th를 구별 할 수있게한다.색깔에 따라 분류 된 CR1의 아이소 폼 (isoform)에 해당하는 곡선의 개별 그룹. 그러나 다른 수학 표현에 해당하는 "표준화 된 및 임시 이동 된 플롯"을 사용하면 구별되는 곡선 그룹을 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 제조업체의 소프트웨어가이 연구에서 일상적으로 사용되었지만 다른 소프트웨어 (예 : uANALYSE)는 곡선 분석을위한 데이터 추출 프로그램으로 사용될 수 있습니다.
현재까지, WB 분석 기술은 단백질 레벨에서 상이한 CR1 길이 다형성의 동정을 가능하게하는 최초의 기술이다. 그러나,이 기술은 많은 단점이 있습니다. 특히 WB에 의한 단백질 분석은 세포막을 추출한 후에 만 수행 할 수 있습니다. 결과적으로, 그것은 복잡하고 매우 시간 소모적입니다. 또한,이 기술은 유용한 res를 달성하기 위해 시술 초기에 적절한 조건에서 신선한 혈액 샘플을 얻는 것을 필요로합니다ults. 반대로, DNA에서 수행 된 HRM-PCR은 장기 보관 후에 마른 혈액 반점이나 샘플을 사용할 수있게합니다. HMR-PCR은 HRM 소프트웨어가 포함 된 전용 장비 또는 HMR 용량 thermocycler 중 하나 인 특수 DNA 용융 도구가 필요합니다. SNP 검출은 다음과 같은 몇 가지 요소에 따라 달라집니다. i) 큰 PCR 단편에 포함 된 SNP는 작은 PCR 단편에서 동일한 SNP보다 검출하기가 더 어렵습니다. ⅱ) 클래스 III 및 IV의 SNP에 속하는 클래스 I 및 II들 (34)보다 검출하기가 더 어렵다; HMR 플랫폼의 분해 능에 관계없이 가장 가까운 근원 대칭 ( 예 : 5'-G (G / C) C-3 ')이있는 SNP는 용융으로 분류 할 수 없습니다. 분석의 타당성을 평가하기 위해 관심있는 SNP를 포함하는 예상 PCR 단편을 uMELT 소프트웨어 35 로 시험하는 것이 유용 할 수있다. 마지막으로, HMR-PCR은 유추 법으로 녹는 곡선의 유사성템플릿 시퀀스가 기준과 다르지만 열역학적으로 동등하므로 템플릿 시퀀스가 기준과 동일하다는 것을 반드시 의미하지는 않습니다. 그러나, 이러한 제한 사항은 여기에 설명 된 방법에는 적용되지 않습니다.이 방법은 5 염기 서열과 관련하여 다른 앰플 리콘의 혼합을 기반으로합니다.
또한 여기에 설명 된 기술은 HRM 분석을 기반으로 여러 가지 장점이 있습니다. 첫째, CR1 길이 다형성은 유전 물질의 추출이 수행 된 후 약 2 시간 내에 결과가 얻어지기 때문에보다 신속하게 결정된다. 반대로 WB 단백질 분석을 기반으로하는 전통적인 생화학 기술은 아크릴 아마이드 젤을 통한 세포막 추출물의 전기 영동, 단백질을 니트로 셀룰로오스 또는 폴리 비닐 리덴 플루오 라이드 (PVDF) 막으로 전달하는 단계, 아이소 폼의CR1 분자를 면역 화학 발광 (immunochemumuminescence) 둘째로, HRM-PCR 기술은 또한 너무 비싸지 않다는 장점을 가지고 있는데, 이는 알츠하이머 병과 같은 병리학의 발달에 대한 감수성을 결정하기 위해 많은 개인 ( 즉, 대형 환자)에게 적용될 수있는 방법에 특히 중요하다. 루푸스 또는 말라리아.
최근 우리와 다른 연구자들은 하나의 추가적인 C3b / C4b 결합 부위를 포함하고있는 CR1 * 2 isoform이 AD 36 , 37 , 38 와 관련이 있음을 보여 주었다. 우리가 이전에 발표 한 연구에서 유전자와 단백질의 수준에서 CR1 길이 다형성은 환자 38 명 중 98.9 %에서 일관되었다. HRM-PCR에 의해 얻어진 길이 다형성과 WB에 의해 얻어진 길이 다형성을 비교했을 때 얻어진 불일치 결과는 HRM (유전자)에 의해 결정된 (CR1 * 1, CR1 * 2)WB (단백질)에 따라 적혈구의 표면에서 CR1 * 1 이소 형만을 누르십시오. 우리 연구에서 WB가 더 긴 노출 시간으로 수행되었을 때 CR1 * 2 이성체 발현의 결핍 (침묵하는 대립 유전자를 가진 개체)은 재현성이 있었고 CR1 대립 유전자 (CR1 * 2)의 존재로 설명 할 수 있었다 Helgeson 39 의 문헌에서 그럼에도 불구하고이 가설을지지하기 위해서는 더 많은 인구에 대한 더 많은 연구가 필요하다.
사립 SNP (작은 가족 그룹 또는 단일 개체에서만 발생하는 SNP)는 기준 표현형 결정 (WB)을 사용하여 해독되어야하지만 명확한 피 프로파일과 혼동해서는 안되는 구별되는 곡선 프로파일을 유도한다는 점에 유의해야합니다 CR1 길이 다형성 유전자형의 오해.
Disclosures
저자는 Reims Champagne-Ardenne (URCA) (특허 번호 WO 2015166194)에 의해 소유 된 특허의 발명가이며,
Acknowledgments
우리는 Plateforme Régionale de Biologie Innovante의 모든 구성원, 면역학 부서의 직원 및 프로토콜 최적화 및 유효성 확인에 기여한 내과학 및 노인 의학과 직원에게 감사드립니다. 이 작품은 Reims University Hospitals (기금 번호 AOL11UF9156)에 의해 지원되었습니다. 우리는 또한 편집 지원을 위해 Fiona Ecarnot (EA3920, 프랑스 Besancon 대학 병원)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab coat | protection | ||
| SensiCareIce powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 0,5-10µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 20-100µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 100-1000µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| TipOne 10µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| TipOne 1-100µL bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| ART 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
| QIAamp DNA Mini Kit (250) | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 51306 | DNA Extraction |
| Buffer AL | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19075 | Lysis buffer |
| QIAamp Mini Spin Column | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 1011706 | DNA binding |
| Buffer AW1 | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19081 | Wash buffer |
| Buffer AW2 | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19072 | Wash buffer |
| Biowave DNA spectrophotometer | Biochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, England | 80-3004-70 | DNA concentration |
| Mikro 200 centrifuge | Hettich Zentrifugen, D-78532, Germany | 0002020-02-00 | centrifugation |
| Multipette E3 | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4987000010 | distribution |
| Light Cycler 480 multiwell plate 96, white | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04729692001 | reaction place |
| Light Cycler 480 sealing foil | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04429757001 | coverage |
| Heraeus Megafuge 11R centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 75004412 | centrifugation |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 05015278001 | high resolution melting polymerase chain reaction |
| LightCycler 480 High Resolution Melting Master | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04909631001 | reaction reagents |
| light cycler 480 SW 1.5.1 software | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | software used for HRM PCR CR1 polymorphism data analysis | |
| CN3 primer: 5'ggccttagacttctcctgc 3' | Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium | reaction reagent | |
| CN3re primer: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3' | Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium | reaction reagent |
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