Microscopia elettronica e correlativo super-risoluzione per risolvere la localizzazione della proteina nella Retina di Zebrafish

Metodi per determinare la localizzazione subcellulare delle proteine e loro relazione con diversi compartimenti della cellula sono strumenti essenziali per comprendere le loro funzioni e le possibili interazioni. Microscopia di Super-risoluzione in combinazione con microscopia elettronica fornisce tali informazioni¹. Microscopia di svuotamento dello stato fondamentale seguita da ritorno di singola molecola (GSDIM) è una tecnologia di microscopia di Super-risoluzione compatibile con una vasta gamma di fluorofori organici e codificato geneticamente² e raggiunge una risoluzione laterale fino a 20 nm ³. l'incorporazione di metodi con risoluzione superiore a quella standard diffrazione limitata microscopia migliora l'accuratezza della correlazione^4,5,6. Al fine di ottenere la migliore correlazione dell'espressione della proteina con un determinato comparto subcellulare e per ridurre il volume di incertezza⁷ l'uso della stessa sezione ultrasottile per luce e microscopia elettronica è raccomandato. Tra i vari metodi di taglio, Tokuyasu cryo-sezione protocollo non necessita di disidratazione o incorporamento di resina e, inoltre, conserva l'antigenicità di molti epitopi e fornisce buon tessuto ultrastruttura⁸. Diversi metodi hanno dimostrato l'applicabilità di queste sezioni correlativo luce e microscopia elettronica (CLEM)^4,5,9,10.

La retina di zebrafish è un prezioso modello per studiare lo sviluppo visivo e meccanismi di malattia umana date la sua struttura altamente conservata e funzione in vertebrati. Fotorecettori della retina, particolare display la stessa architettura di fotorecettori dei mammiferi, con una sinapsi basale, un nucleo apico-basalmente allungata, il clustering dei mitocondri nel segmento apicale più interiore e un segmento esterno composto di membrana dischi in posizione più apicale¹¹. La localizzazione della proteina per i diversi compartimenti cellulari è conservata tra zebrafish e umana, permettendo di indagine della funzione biologica di proteine umane rilevanti per la malattia^12,13.

Qui presentiamo un protocollo per preparare larvale zebrafish retina campioni per risolvere la localizzazione della proteina della membrana mitocondriale esterna Tom20 da correlativo super-risoluzione luce e da microscopia elettronica. Il metodo si basa sulla raccolta di cryo-sezioni su wafer di silicio e l'ottenimento di contrasto da informazioni topografiche prodotte dopo l'applicazione di un sottile strato di platino. Questi passaggi sono miglioramenti tecnici chiaro in termini di facilità d'uso, riproducibilità e tempo per la realizzazione di esperimenti. Recentemente abbiamo dimostrato l'applicabilità del metodo per rilevare i pori nucleari e proteine mitocondriali in mouse tessuto¹⁴.

tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la dichiarazione di ARVO per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research e sono stati approvati dalle autorità locali.

1. preparazione di sezioni ultrasottili su wafer di silicio

1. 1. preparare la soluzione fissante contenente 0,1% glutaraldeide, formaldeide 4% in tampone cacodilato 0.1 M.
      Nota: attenzione! Usare cautela quando si lavora con glutaraldeide, formaldeide e cacodylate buffer, indossare adeguati dispositivi di protezione personale e lavorare in una cappa aspirante.
   2. Eutanasia 5 giorni dopo la fecondazione (5 dpf) larve di zebrafish con tricaina (methanesulfonate 3-aminobenzoate etilico, 0,4% p/v in PBS (tampone fosfato salino, pH 7)) come descritto in precedenza ¹⁵.
   3. Difficoltà le larve mediante immersione in soluzione fissante pre-refrigerati sul ghiaccio. Togliere la testa e incubare per una notte a 4 ° C con dolce dondolio.
   4. Sezionare gli occhi tagliando il tessuto intorno all'occhio utilizzando una pinzetta e un bisturi di microdissection (sotto un binocolo) in soluzione fissante fresco su una zolla di letti dell'agarosi di 1%. Trasferire gli occhi in una provetta con fissativo fresco pre-refrigerato.
   5. Lavare due volte in PBS (tampone fosfato salino, pH 7.4) per 5 min ogni lavaggio a temperatura ambiente (TA).
2. Gelatina infiltrazione e montaggio
   1. Warm up 15ml cibo locale marca gelatina 12% p/v in PB (tampone fosfato, 0,1 M a pH 7.4) a 40 ° C. rimuovere il PBS ed aggiungere la soluzione di gelatina per le provette contenenti gli occhi. Toccare il tubo delicatamente per garantire si infiltra in gelatina il campione e incubare per 10-30 min a 40 ° C in un termoblocco con agitazione delicata o in un bagno d'acqua.
   Silicio
   2. riempire 12 x 5 x 3 mm o polietilene piatto incorporamento stampi con gelatina calda in un bagno di acqua 40 ° C. Aggiungere due occhi per muffa usando una pipetta, allinearle correttamente sotto un binocolo utilizzando un ago di dissezione e lasciare che la gelatina raffreddare a temperatura ambiente per 1 min e indurire a 4 ° C per 20 min.
   3. Ri-tagliare il blocco di gelatina sotto il binocolo per adattarsi a un occhio per blocco utilizzando una lama di rasoio.
   4. Trasferire gli occhi di gelatina incorporato a 2,3 M saccarosio in PB sul ghiaccio. Incubare per una notte a 4 ° C.
   5. Cambio alla nuova soluzione di saccarosio di 2,3 M e conservare a 4 ° C o -20 ° C; dopo questo passaggio, i campioni sono pronti per il sezionamento o possono essere conservati a-20 ° C per parecchie settimane ai mesi.
   6. Ri-tagliare il blocco di gelatina quasi la dimensione dell'occhio prima di trasferire ad un cryo-pin. Congelamento in azoto liquido e trasferimento in un cryo-ultramicrotomo.
3. Cryosectioning
   1. Cut 110 nm di spessore-sezioni a-120 ° C con un coltello di diamante in cryo-ultramicrotomo.
   2. Pick le sezioni con un anello via cavo contenente una goccia di 2% metilcellulosa (in acqua) e soluzione di saccarosio di 2,3 M (1:1). Trasferimento sezioni per un wafer di silicio di 7 x 7 mm. Memorizzare sezioni a 4 ° C fino a ulteriore elaborazione.

2. Immunolabelling

1. wafer di lavaggio con PBS a 0 ° C per 20 min su quattro gocce mettendo sottosopra i wafer sulle gocce. Lavaggio in PBS 2 x 2 min a temperatura ambiente.
2. Incubare 3 volte da glicina 0,15% in PBS, per 1 min ciascuna. Lavare 3x per 1 min/lavaggio con PBS. Pre-incubate con PBG (PBS con 0,5% di sieroalbumina bovina BSA e 0,2% gelatina tipo B) per 5 min.
3. Incubare con coniglio anti-Tom20 (Vedi la Tabella materiali) in PBG (4 µ g/mL) per 30 min a temperatura ambiente.
4. Lavare 6x per 1 min/lavaggio in PBG. Pre-incubate con PBG per 5 min a RT. Incubare con anti-coniglio Alexa 647 F(ab') ₂ (Vedi la Tabella materiali) in PBG (7,5 µ g/mL) per 30 min.
5. Lavare 6x per 1 min/lavaggio in PBG. Lavare 3 x 2 min in PBS. Incubare con DAPI (4 µ g/mL) in PBS per 10 s. Wash 2 x 2 min in PBS.

3. Microscopia di Super-risoluzione

1. Incubare la cialda brevemente (10 s) ponendolo su una goccia di una soluzione di 1:1 di glicerolo (80%) e tampone contenente un ossigeno lo scavenging sistema (200 mM di tampone fosfato contenente glucosio 10%, 0,5 mg/mL di imaging Glucoseoxidase, 40 catalasi µ g/mL, beta-mercaptoethylamine cloridrato di 15 mM (MEA HCL), pH 8.0).
2. Trasferire i wafer (sezione rivolto verso il basso) per un piatto di Petri vetro inferiore (spessore 170 ± 5 µm) su una fresca goccia di miscela 1:1 di glicerolo (80%) e imaging buffer (come descritto al punto 3.1).
3. Rimuovere da tutti i lati, con una pipetta, la maggior parte del liquido sotto il wafer. Utilizzare strisce di silicone per correggere la cialda sul fondo del piatto Petri.
   Nota: Strisce di Silicone sono fatte di silicone-colla a due componenti (3 x 12 mm).
4. Immagine sezioni su un microscopio invertito usando un'apertura numerica elevata (ad esempio 160 X / NA 1,43; si veda la Tabella materiali) obiettivo dedicato a super risoluzione immersione in olio. Prima di formazione immagine, lasciate che il campione equilibrare a temperatura microscopio al fine di ridurre al minimo/ridurre la deriva laterale e assiale.
5. Centro della zona di interesse e acquisire immagini di riferimento primi widefield epifluorescenza. Modificare la modalità di funzionamento di super risoluzione. Regolare il tempo di esposizione della fotocamera a 15 ms e impostare l'elettrone moltiplicando il guadagno (EM) ad un massimo di 300.
6. Campione di illuminare con la 642 laser ad onda continua nm a potenza massima laser (corrispondente a ~2.8 kW/cm ²) in modalità epifluorescenza. Non appena la singola molecola lampeggia sono ben separati in ogni fotogramma, in modo che la probabilità è bassa che singoli segnali si sovrappongono, impostare la potenza del laser a ~0.7 kW/cm ². Registrare l'immagine raw in modalità epifluorescenza con l'acquisizione di un minimo di 30.000 fotogrammi.
   Nota: Tutti questi parametri possono variare a seconda di diversi esemplari ed etichettatura densità.
7. Da dati grezzi, generare un elenco di eventi di ricostruzione (localizzazioni di ogni singola molecola batter nell'immagine raw) utilizzando una soglia di rilevamento di 30 fotoni (deve essere adattata secondo il campione) cliccando " Evaluate " alla ' t-serie analisi ' sotto ' Strumenti '.
8. Visualizzare l'immagine di super risoluzione di raccordo gaussiana ¹⁶ applicando una dimensione di pixel rendering di 4 nm cliccando " Crea immagine " alla ' pannello elaborazione di evento elenco ' sotto ' strumenti. '
   Nota: Per generare l'immagine super risolto gli strumenti software integrato del sistema utilizzato in questo studio sono stati impiegati. Tuttavia, l'imaging di super risoluzione descritta può essere eseguita su qualsiasi altro sistema di localizzazione basato su singola molecola, e possono essere trattati i dati con strumenti software open source come temporale ¹⁷.

4. Shadowing platino

1. rimuovere le strisce di silicio e aggiungere una goccia di PBS vicino ai bordi del wafer per sollevarlo da di Petri. Lavare il wafer 2 x 2 min in PBS, poi post fissarlo con 0,1% glutaraldeide in PBS per 5 min. lavare 2x per 2 min/lavaggio in PBS.
2. Incubare la cialda due volte per 5 min/incubazione in 1 goccia di metilcellulosa 2% in acqua sul ghiaccio. Inserire la cialda in una provetta da centrifuga e centrifugare a 14.100 x g per 90 s. Monte e su un albero mozzo alluminio SEM con lo svolgimento di cemento carbonio.
3. Aggiungere uno strato di 2-10 nm di platino/carbonio sul campione lo shadowing rotativo a 8° utilizzando un elettrone del fascio le impostazioni del dispositivo di evaporazione: 1,55 kV, 55 mA, a 0,3 nm/s e un angolo di 8°, livello di rotazione 4.

5. Microscopia elettronica a scansione

1. sezioni di immagine con scansione elettrone microscope a 1,5 kV, 2 mm di lavoro distanza e con un In lente detector elettronico secondario.

6. Allineamento di luce e di microscopia elettronica immagini

1. Apri entrambi tipi di immagini con Fiji ¹⁸ cliccando " File | Aperto ". Regolare la dimensione della tela facendo " immagine | Regolare | Tela di dimensioni " e portare entrambe le immagini a una pila facendo " immagine | Stack | Immagini di stack ". Salvare lo stack come tipo di file tiff.
2. In Fiji, aprire una nuova interfaccia di ¹⁹ TrackEM2 facendo " File | nuovo | TrackEM2 (nuovo) ". Importare lo stack con entrambe le immagini facendo clic destro sulla finestra nera e selezionando " stack di importazione ".
Immagine di microscopia
3. luce allineare all'immagine di microscopia elettronica manualmente con punti di riferimento utilizzando un clic destro del mouse sull'immagine e selezionando " Align | Allineare il livello manualmente con luoghi d'interesse ".
   1. Pick Seleziona strumento (la freccia nera) per aggiungere punti di riferimento. Utilizzare la forma dei nuclei come riferimento per selezionare gli stessi bordi in entrambe le immagini (complementare figura 1). Aggiungere diversi punti (minimi tre punti necessita di essere selezionata). Applicare l'allineamento con un modello affine di destro del mouse scegliendo e selezionando " applica trasformazione | Modello affine ".
4. Cambiare la trasparenza del layer (vedere complementare figura 1) per valutare la qualità dell'allineamento.

L'espressione della proteina Tom20, un'unità secondaria del translocase della membrana mitocondriale esterna complesso20, è stato determinato, in sezioni sottili della retina di zebrafish larvale, da microscopia di Super-risoluzione (Figura 1) e questa informazione è stata integrato con il segnale topografico ottenuto da microscopia elettronica di esame dopo platino lo shadowing delle sezioni stesse. Questi dati correlativi confermano la localizzazione di una proteina in associazione con un particolare vano, membrana mitocondriale esterna e, inoltre, fornire informazioni circa la relazione tra la proteina con altri organelli della cellula.

Figura 1: CLEM zebrafish retina. R. immagine di widefield basso ingrandimento di una sezione retinica di zebrafish 5 dpf, nuclei macchiati con DAPI (ciano). B. la microscopia della stessa area. C. maggiore ingrandimento widefield immagine del fotogramma in B. Nuclei macchiato con DAPI (ciano) e Tom20 mitocondriale colorazione appare in rosso. D. Widefield immagine della stessa sezione a maggiore ingrandimento. Il pattern di espressione di Tom20 è presso i cluster dei mitocondri. E. espressione di Tom20 (punti rossi) rilevati da microscopia GSDIM. Nuclei macchiati con DAPI (ciano). F. stessa sezione E combinando correlativo super-risoluzione e microscopia elettronica a scansione. Tom20 colorazione (punti rossi) appare il cluster mitocondriale (M) alle outer membrane dei mitocondri. Segnale di fluorescenza DAPI nei nuclei (N) corrisponde con la topografia dell'immagine SEM. G. immagine ad alto ingrandimento del fotogramma nel F. L'immagine di microscopia elettronica scansione fornisce il contesto per l'immagine GSDIM (punti rossi). Cristae mitocondriali sono chiaramente visibili e la macchiatura di Tom20 è localizzata alla membrana esterna dei mitocondri. Le membrane del segmento esterno i fotorecettori (OS) sono chiaramente risolti. Immagine pixel dimensioni 5 nm. Scala bar: A, B e c: 10 µm; D: 2 µm; E e f: 1 µm e g.: 0,2 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Complementare figura 1: allineamento delle immagini di luce e microscopia elettronica. A. Screenshot dall'interfaccia TrackEM2 con immagine di SEM e numerati luoghi d'interesse (gialli) lungo diversi nuclei. B. Screenshot dall'interfaccia TrackEM2 con immagine di fluorescenza e punti di riferimento numerati (giallo) lungo diversi DAPI macchiato i nuclei. Per modificare la trasparenza del layer i cursori nella parte superiore sinistra del menu possono essere utilizzati. Barra della scala: 1 µm. per favore clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.