Microscopia elettronica e correlativo super-risoluzione per risolvere la localizzazione della proteina nella Retina di Zebrafish

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per ottenere risultati di localizzazione sottocellulare della proteina sulla retina di zebrafish correlando microscopia di Super-risoluzione e immagini di microscopia elettronica di scansione.

L'obiettivo generale di questo metodo di microscopia è quello di localizzare con precisione l'espressione proteica in relazione a diversi organelli subcellulari nella retina larvale del pesce zebra correlando immagini di microscopia elettronica a super-risoluzione e a scansione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello sviluppo retinico e nei campi della via cellulare, come lo studio della cattiva localizzazione delle proteine nei mutanti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina la super-risoluzione con la microscopia elettronica a scansione per ottenere dati di localizzazione delle proteine altamente accurati all'interno del contesto strutturale del campione.

La raccolta di sezioni Tokuyasu su wafer di silicone facilita notevolmente la manipolazione e l'uso dell'ombreggiatura al platino per il contrasto fornisce una buona topografia del campione. Quindi, questo metodo può fornire informazioni sugli studi sulla retina delle larve di pesce zebra. Uno dei suoi principali vantaggi è che può essere applicato anche a molti altri sistemi biologici, come l'identificazione dell'espressione proteica nel tessuto di topo.

Dopo aver sezionato gli occhi da larve di pesce zebra fissate secondo il protocollo di testo, riscaldare 15 millilitri di gelatina di marca alimentare locale al 12% in PBS a 40 gradi Celsius. Quindi aspirare il PBS dalle provette degli occhi e aggiungere la soluzione di gelatina. Picchiettare delicatamente la provetta per assicurarsi che la gelatina si infiltri nel campione e incubarla per 10-30 minuti a 40 gradi Celsius in un blocco termico agitando delicatamente o a bagnomaria.

In un bagnomaria a 40 gradi Celsius, riempire stampi da inclusione piatti in silicone o polietilene da 12 x cinque x tre millimetri con gelatina calda. Quindi, utilizzando una pipetta, aggiungere due occhi per stampo e sotto un binocolo utilizzare un ago da dissezione per allinearli correttamente. Dopo aver lasciato raffreddare la gelatina a temperatura ambiente per un minuto, metterla a quattro gradi Celsius per 20 minuti per farla indurire.

Sotto il binocolo, usa una lama di rasoio per tagliare nuovamente il blocco di gelatina in modo che si adatti a un occhio per blocco. Trasferire gli occhi incorporati nella gelatina in saccarosio molare 2,3 in PBS su ghiaccio. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius durante la notte.

Quindi scambiare i campioni con una soluzione fresca di saccarosio 2,3 molari. E conservare il tessuto a quattro gradi Celsius, o meno 20 gradi Celsius per la conservazione fino a diversi mesi. Ritagliare il blocco di gelatina quasi alle dimensioni dell'occhio prima di trasferirlo su un crio-pin.

Quindi congelare il blocco in azoto liquido e trasferirlo in un crio-ultramicrotomo. Utilizzando un coltello diamantato nel crio-ultramicrotomo, tagliare sezioni spesse 110 nanometri a meno 120 gradi Celsius. Prelevare le sezioni con un anello cablato contenente una gocciolina di metilcellulosa al 2% e una soluzione di saccarosio molare da 2,3 molari.

Quindi trasferire le sezioni su un wafer di silicone di sette per sette millimetri. Per lavare i wafer, pipettare quattro gocce e posizionare i wafer a testa in giù sulle gocce. Incubare i wafer sulle gocce a zero gradi Celsius per 20 minuti.

Quindi lavare le cialde due volte in PBS a temperatura ambiente per due minuti ciascuna. Incubare i campioni tre volte in glicina allo 0,15% in PBS per un minuto ciascuno. Quindi utilizzare PBS per lavare i campioni tre volte per un minuto per lavaggio.

Pre-incubare il tessuto con PBG per cinque minuti. Quindi, aggiungi coniglio anti-Tom20 in PBG alle sezioni. E incubare i wafer a temperatura ambiente per 30 minuti.

Con PBG, lavare il fazzoletto sei volte per un minuto per lavaggio. Quindi pre-incubare i campioni con PBG a temperatura ambiente per cinque minuti. Sostituisci il PBG con i frammenti Fab bivalenti anti-coniglio Alexa 647 in PBG e incuba per 30 minuti.

Lavare i campioni in PBG sei volte per un minuto per lavaggio. Quindi utilizzare PBS per lavare i wafer tre volte per due minuti. Aggiungere DAPI e PBS ai wafer e incubare per 10 secondi.

Quindi utilizzare PBS per lavare i campioni due volte per due minuti ciascuno. Posizionare il wafer su una gocciolina di una soluzione uno a uno di glicerolo all'80% e tampone di imaging contenente un sistema di evacuazione dell'ossigeno e incubarlo brevemente. Trasferire i wafer, con il fazzoletto rivolto verso il basso, su una goccia fresca della miscela uno a uno di glicerolo all'80% e tampone di imaging su una piastra di Petri con fondo di vetro.

Utilizzare una pipetta da tutti i lati per rimuovere la maggior parte del liquido sotto il wafer. Quindi utilizzare strisce di silicone per fissare il wafer al fondo della capsula di Petri. Posizionare le sezioni montate su un microscopio invertito con un obiettivo a immersione in olio ad alta apertura numerica.

Prima dell'imaging, lasciare che il campione si equilibri alla temperatura del microscopio per minimizzare o ridurre la deriva laterale e assiale. Centra l'area di interesse e acquisisci immagini di riferimento per l'epifluorescenza ad ampio campo. Passare alla modalità di funzionamento a super risoluzione.

Regolare il tempo di esposizione della fotocamera a 15 millisecondi e impostare il guadagno di moltiplicazione degli elettroni al massimo di 300. Quindi, illuminare il campione in modalità epifluorescenza con il laser a 642 nanometri alla massima potenza laser. Non appena la singola molecola lampeggia è ben separata in ogni fotogramma, in modo che la probabilità che i singoli segnali si sovrappongano sia bassa, ridurre la potenza del laser a quasi 1/3.

Registra l'immagine raw in epifluorescenza acquisendo un minimo di 30.000 fotogrammi. Dai dati grezzi, in Strumenti, l'analisi della serie t utilizza una soglia di rilevamento di 30 fotoni. Fare clic su Valuta per generare un elenco di eventi di localizzazione.

In Strumenti, nel pannello Elaborazione elenco eventi, fare clic su Crea immagine per visualizzare l'immagine a super-risoluzione mediante adattamento gaussiano, applicando una dimensione in pixel di rendering di quattro nanometri. Rimuovi le strisce di silicone e aggiungi una goccia di PBS vicino ai bordi del wafer per sollevarlo dalla capsula di Petri. Dopo aver usato il PBS per lavare il wafer due volte per due minuti ciascuna, utilizzare lo 0,1% di glutaraldeide nel PBS per post-fissarlo per cinque minuti.

Quindi lavare nuovamente il campione due volte per due minuti per ogni lavaggio in PBS. Incubare il wafer in una goccia di metilcellulosa al 2% in acqua su ghiaccio due volte per cinque minuti per incubazione. Quindi inserire il wafer in una provetta da centrifuga e centrifugare a 14, 100 volte g per 90 secondi.

Dopo la rotazione, utilizzare cemento di carbonio conduttore per montare il wafer su un tronchetto di alluminio SEM. Utilizzando un dispositivo di evaporazione a fascio di elettroni, aggiungere uno strato da due a 10 nanometri di carbonio di platino sul campione mediante ombreggiatura rotante con le seguenti impostazioni. Sezioni dell'immagine con un microscopio elettronico a scansione a 1,5 kilovolt, una distanza di lavoro di due millimetri e con un rivelatore di elettroni secondario nella lente.

Utilizzare Fiji per aprire sia le immagini di microscopia ottica che quelle elettroniche facendo clic su File, Apri. Regola le dimensioni della tela facendo clic su Immagine, Regola, Dimensioni tela. Quindi porta entrambe le immagini in una pila facendo clic su Immagine, Pile, Immagini da impilare.

Nelle Figi, apri una nuova interfaccia Track EM2 facendo clic su File, Nuovo, Track EM2 nuovo. Importa la pila con entrambe le immagini facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra nera e selezionando Importa pila. Allinea manualmente l'immagine al microscopio ottico all'immagine al microscopio elettronico con i punti di riferimento facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e selezionando Allinea, Allinea manualmente il livello con i punti di riferimento.

Seleziona lo strumento per aggiungere punti di riferimento. Usa la forma dei nuclei come riferimento per selezionare gli stessi bordi in entrambe le immagini e per aggiungere diversi punti. Applicare l'allineamento con un modello affine facendo clic con il pulsante destro del mouse e selezionando Applica trasformazione, Modello affine.

Infine, modificare la trasparenza del layer per valutare la qualità dell'allineamento. Questo pannello mostra un'immagine a campo largo a basso ingrandimento di una sezione retinica di zebrafish post-fecondazione di cinque giorni. La stessa area è mostrata qui dalla microscopia elettronica a scansione.

Queste immagini con ingrandimento più elevato mostrano Tom20 colorato in rosso con grappoli ai mitocondri. L'espressione di Tom20 è mostrata qui come rilevata dalla microscopia GSDIM. In questa immagine, la stessa sezione combina la super-risoluzione correlativa e la microscopia elettronica a scansione.

colorazione Tom20 appare all'interno del cluster mitocondriale alle membrane esterne dei mitocondri. Il segnale DAPI a fluorescenza nei nuclei corrisponde alla topografia dell'immagine SEM. Questa immagine SEM fornisce il contesto alla colorazione Tom20 nell'immagine GSDIM.

Le cristae mitocondriali sono chiaramente visibili e la colorazione Tom20 è localizzata sulle membrane esterne dei mitocondri. Le membrane del segmento esterno dei fotorecettori sono chiaramente risolte. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare al meglio i parametri di etichettatura e imaging.

Solo i campioni etichettati in modo ottimale sono adatti per la super-risoluzione. I campioni non devono mai asciugarsi in nessun momento durante la procedura di etichettatura. Questa procedura potrebbe essere estesa all'immunofluorescenza a doppia marcatura, e quindi consentire la localizzazione di due diverse proteine all'interno di una struttura specifica.

In caso di campioni più complessi, si consiglia l'uso di marcatori fiduciali per ottenere un allineamento preciso delle immagini. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire studi correlati per localizzare le proteine in relazione ai diversi organelli della cellula in un campione di tessuto complesso con precisione a super risoluzione.