Name: Microscopia elettronica e correlativo super-risoluzione per risolvere la localizzazione della proteina nella Retina di Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Impara la microscopia correlativa super-risoluzione ed elettronica per localizzare le proteine nella retina di Danio rerio. Questo metodo combina tecniche avanzate per studiare lo sviluppo retinico con precisione subcellulare.

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tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la dichiarazione di ARVO per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research e sono stati approvati dalle autorità locali.
 1. preparazione di sezioni ultrasottili su wafer di silicio fissazione del campione <ol><li><ol><li>preparare la soluzione fissante contenente 0,1% glutaraldeide, formaldeide 4% in tampone cacodilato 0.1 M. 
		Nota: attenzione! Usare cautela quando si lavora con glutaraldeide, formaldeide e cacodylate buffer, indossare adeguati dispositivi di protezione personale e lavorare in una cappa aspirante.</li>
		<li>Eutanasia 5 giorni dopo la fecondazione (5 dpf) larve di zebrafish con tricaina (methanesulfonate 3-aminobenzoate etilico, 0,4% p/v in PBS (tampone fosfato salino, pH 7)) come descritto in precedenza 15.</li>
		<li>Difficoltà le larve mediante immersione in soluzione fissante pre-refrigerati sul ghiaccio. Togliere la testa e incubare per una notte a 4 ° C con dolce dondolio.</li>
		<li>Sezionare gli occhi tagliando il tessuto intorno all'occhio utilizzando una pinzetta e un bisturi di microdissection (sotto un binocolo) in soluzione fissante fresco su una zolla di letti dell'agarosi di 1%. Trasferire gli occhi in una provetta con fissativo fresco pre-refrigerato.</li>
		<li>Lavare due volte in PBS (tampone fosfato salino, pH 7.4) per 5 min ogni lavaggio a temperatura ambiente (TA).</li>
	</ol></li> <li>Gelatina infiltrazione e montaggio <ol><li>Warm up 15ml cibo locale marca gelatina 12% p/v in PB (tampone fosfato, 0,1 M a pH 7.4) a 40 ° C. rimuovere il PBS ed aggiungere la soluzione di gelatina per le provette contenenti gli occhi. Toccare il tubo delicatamente per garantire si infiltra in gelatina il campione e incubare per 10-30 min a 40 ° C in un termoblocco con agitazione delicata o in un bagno d'acqua.</li>
		Silicio <li>riempire 12 x 5 x 3 mm o polietilene piatto incorporamento stampi con gelatina calda in un bagno di acqua 40 ° C. Aggiungere due occhi per muffa usando una pipetta, allinearle correttamente sotto un binocolo utilizzando un ago di dissezione e lasciare che la gelatina raffreddare a temperatura ambiente per 1 min e indurire a 4 ° C per 20 min.</li>
		<li>Ri-tagliare il blocco di gelatina sotto il binocolo per adattarsi a un occhio per blocco utilizzando una lama di rasoio.</li>
		<li>Trasferire gli occhi di gelatina incorporato a 2,3 M saccarosio in PB sul ghiaccio. Incubare per una notte a 4 ° C.</li>
		<li>Cambio alla nuova soluzione di saccarosio di 2,3 M e conservare a 4 ° C o -20 ° C; dopo questo passaggio, i campioni sono pronti per il sezionamento o possono essere conservati a-20 ° C per parecchie settimane ai mesi.</li>
		<li>Ri-tagliare il blocco di gelatina quasi la dimensione dell'occhio prima di trasferire ad un cryo-pin. Congelamento in azoto liquido e trasferimento in un cryo-ultramicrotomo.</li>
	</ol></li> <li>Cryosectioning <ol><li>Cut 110 nm di spessore-sezioni a-120 ° C con un coltello di diamante in cryo-ultramicrotomo.</li>
		<li>Pick le sezioni con un anello via cavo contenente una goccia di 2% metilcellulosa (in acqua) e soluzione di saccarosio di 2,3 M (1:1). Trasferimento sezioni per un wafer di silicio di 7 x 7 mm. Memorizzare sezioni a 4 ° C fino a ulteriore elaborazione.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunolabelling <ol><li>wafer di lavaggio con PBS a 0 ° C per 20 min su quattro gocce mettendo sottosopra i wafer sulle gocce. Lavaggio in PBS 2 x 2 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare 3 volte da glicina 0,15% in PBS, per 1 min ciascuna. Lavare 3x per 1 min/lavaggio con PBS. Pre-incubate con PBG (PBS con 0,5% di sieroalbumina bovina BSA e 0,2% gelatina tipo B) per 5 min.</li>
	<li>Incubare con coniglio anti-Tom20 (Vedi la Tabella materiali) in PBG (4 µ g/mL) per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare 6x per 1 min/lavaggio in PBG. Pre-incubate con PBG per 5 min a RT. Incubare con anti-coniglio Alexa 647 F(ab&#39;) 2 (Vedi la Tabella materiali) in PBG (7,5 µ g/mL) per 30 min.</li>
	<li>Lavare 6x per 1 min/lavaggio in PBG. Lavare 3 x 2 min in PBS. Incubare con DAPI (4 µ g/mL) in PBS per 10 s. Wash 2 x 2 min in PBS.</li>
</ol> 3. Microscopia di Super-risoluzione <ol><li>Incubare la cialda brevemente (10 s) ponendolo su una goccia di una soluzione di 1:1 di glicerolo (80%) e tampone contenente un ossigeno lo scavenging sistema (200 mM di tampone fosfato contenente glucosio 10%, 0,5 mg/mL di imaging Glucoseoxidase, 40 catalasi µ g/mL, beta-mercaptoethylamine cloridrato di 15 mM (MEA HCL), pH 8.0).</li>
	<li>Trasferire i wafer (sezione rivolto verso il basso) per un piatto di Petri vetro inferiore (spessore 170 ± 5 µm) su una fresca goccia di miscela 1:1 di glicerolo (80%) e imaging buffer (come descritto al punto 3.1).</li>
	<li>Rimuovere da tutti i lati, con una pipetta, la maggior parte del liquido sotto il wafer. Utilizzare strisce di silicone per correggere la cialda sul fondo del piatto Petri. 
	Nota: Strisce di Silicone sono fatte di silicone-colla a due componenti (3 x 12 mm).</li>
	<li>Immagine sezioni su un microscopio invertito usando un'apertura numerica elevata (ad esempio 160 X / NA 1,43; si veda la Tabella materiali) obiettivo dedicato a super risoluzione immersione in olio. Prima di formazione immagine, lasciate che il campione equilibrare a temperatura microscopio al fine di ridurre al minimo/ridurre la deriva laterale e assiale.</li>
	<li>Centro della zona di interesse e acquisire immagini di riferimento primi widefield epifluorescenza. Modificare la modalità di funzionamento di super risoluzione. Regolare il tempo di esposizione della fotocamera a 15 ms e impostare l'elettrone moltiplicando il guadagno (EM) ad un massimo di 300.</li>
	<li>Campione di illuminare con la 642 laser ad onda continua nm a potenza massima laser (corrispondente a ~2.8 kW/cm 2) in modalità epifluorescenza. Non appena la singola molecola lampeggia sono ben separati in ogni fotogramma, in modo che la probabilità è bassa che singoli segnali si sovrappongono, impostare la potenza del laser a ~0.7 kW/cm 2. Registrare l'immagine raw in modalità epifluorescenza con l'acquisizione di un minimo di 30.000 fotogrammi. 
	Nota: Tutti questi parametri possono variare a seconda di diversi esemplari ed etichettatura densità.</li>
	<li>Da dati grezzi, generare un elenco di eventi di ricostruzione (localizzazioni di ogni singola molecola batter nell'immagine raw) utilizzando una soglia di rilevamento di 30 fotoni (deve essere adattata secondo il campione) cliccando &#34; Evaluate &#34; alla &#39; t-serie analisi &#39; sotto &#39; Strumenti &#39;.</li>
	<li>Visualizzare l'immagine di super risoluzione di raccordo gaussiana 16 applicando una dimensione di pixel rendering di 4 nm cliccando &#34; Crea immagine &#34; alla &#39; pannello elaborazione di evento elenco &#39; sotto &#39; strumenti. &#39; 
	Nota: Per generare l'immagine super risolto gli strumenti software integrato del sistema utilizzato in questo studio sono stati impiegati. Tuttavia, l'imaging di super risoluzione descritta può essere eseguita su qualsiasi altro sistema di localizzazione basato su singola molecola, e possono essere trattati i dati con strumenti software open source come temporale 17.</li>
</ol> 4. Shadowing platino <ol><li>rimuovere le strisce di silicio e aggiungere una goccia di PBS vicino ai bordi del wafer per sollevarlo da di Petri. Lavare il wafer 2 x 2 min in PBS, poi post fissarlo con 0,1% glutaraldeide in PBS per 5 min. lavare 2x per 2 min/lavaggio in PBS.</li>
	<li>Incubare la cialda due volte per 5 min/incubazione in 1 goccia di metilcellulosa 2% in acqua sul ghiaccio. Inserire la cialda in una provetta da centrifuga e centrifugare a 14.100 x g per 90 s. Monte e su un albero mozzo alluminio SEM con lo svolgimento di cemento carbonio.</li>
	<li>Aggiungere uno strato di 2-10 nm di platino/carbonio sul campione lo shadowing rotativo a 8° utilizzando un elettrone del fascio le impostazioni del dispositivo di evaporazione: 1,55 kV, 55 mA, a 0,3 nm/s e un angolo di 8°, livello di rotazione 4.</li>
</ol> 5. Microscopia elettronica a scansione <ol><li>sezioni di immagine con scansione elettrone microscope a 1,5 kV, 2 mm di lavoro distanza e con un In lente detector elettronico secondario.</li>
</ol> 6. Allineamento di luce e di microscopia elettronica immagini <ol><li>Apri entrambi tipi di immagini con Fiji 18 cliccando &#34; File | Aperto &#34;. Regolare la dimensione della tela facendo &#34; immagine | Regolare | Tela di dimensioni &#34; e portare entrambe le immagini a una pila facendo &#34; immagine | Stack | Immagini di stack &#34;. Salvare lo stack come tipo di file tiff.</li>
	<li>In Fiji, aprire una nuova interfaccia di 19 TrackEM2 facendo &#34; File | nuovo | TrackEM2 (nuovo) &#34;. Importare lo stack con entrambe le immagini facendo clic destro sulla finestra nera e selezionando &#34; stack di importazione &#34;.</li>
	Immagine di microscopia <li>luce allineare all'immagine di microscopia elettronica manualmente con punti di riferimento utilizzando un clic destro del mouse sull'immagine e selezionando &#34; Align | Allineare il livello manualmente con luoghi d'interesse &#34;.
	<ol><li>Pick Seleziona strumento (la freccia nera) per aggiungere punti di riferimento. Utilizzare la forma dei nuclei come riferimento per selezionare gli stessi bordi in entrambe le immagini (complementare figura 1). Aggiungere diversi punti (minimi tre punti necessita di essere selezionata). Applicare l'allineamento con un modello affine di destro del mouse scegliendo e selezionando &#34; applica trasformazione | Modello affine &#34;.</li>
	</ol></li> <li>Cambiare la trasparenza del layer (vedere complementare figura 1) per valutare la qualità dell'allineamento.</li></ol>

<ol><li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+Super-Resolution+Microscopy%3A+New+Dimensions+and+New+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Fölling, J., Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+photoactivated+localization+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy.</a> PLOS one. 8 (10), e77209(2013).</li>
<li>Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation-resistant+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+CLEM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM.</a> Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).</li>
<li>Narayan, K., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beams+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Focused ion beams in biology.</a> Nat Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li>
<li>Suleiman, H., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+protein+architecture+of+the+kidney+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane.</a> eLife. 2, e01149(2013).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+3D+superresolution+fluorescence+and+electron+microscopy+reveal+the+relationship+of+mitochondrial+nucleoids+to+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).</li>
<li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+retina+in+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li>
<li>Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliopathy+gene+cc2d2a+controls+zebrafish+photoreceptor+outer+segment+development+through+a+role+in+Rab8-dependent+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking.</a> Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).</li>
<li>Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ciliopathy+Protein+CC2D2A+Associates+with+NINL+and+Functions+in+RAB8-MICAL3-Regulated+Vesicle+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Gen%22%5BJournal%5D)">The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking.</a> PLOS Gen. 11 (10), e1005575(2015).</li>
<li>Mateos, J. M., Guhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+contrast+of+ultrathin+cryo-sections+for+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Sci Rep. 6, 34062(2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., Saalfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS one. 7 (6), e38011(2012).</li>
<li>Wurm, C. A., Neumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+distribution+of+mitochondrial+import+receptor+Tom20+is+adjusted+to+cellular+conditions+and+exhibits+an+inner-cellular+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).</li>
<li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17947990">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo metodo combina la localizzazione della proteina super-risolto con informazioni di contesto per determinare la posizione precisa di proteine in un organello. Dimostriamo qui il completamento dell'esperimento di visualizzare l'espressione di Tom20 nella membrana esterna dei mitocondri e la sua relazione con altri organelli come i nuclei o segmenti esterni dei fotorecettori della retina di zebrafish larvale.
Tokuyasu cryo-sezionamento richiede un certo allenamento per acquisire sezioni ben conservati. Tuttavia, questo è un metodo impiegato in molti laboratori con successo dimostrato21. Trasferimento delle sezioni per i wafer di silicio è molto semplice e particolari considerazioni non sono necessari. L'uso del glicerolo nel buffer di imaging è una fase molto critica per evitare la disidratazione delle sezioni. Per l'imaging ad alta super-risoluzione i migliori risultati si ottengono quando la cialda è molto vicino alla parte inferiore di vetro del piatto Petri. Le strisce di silicone aiutano a mantenere la cialda in questa posizione. Particolare cura deve essere presa mentre togliere le strisce per evitare di danneggiare le sezioni.
Lo spessore delle sezioni cryo, circa 100 nm, più sottile rispetto alla risoluzione ottica nella dimensione Z, inoltre facilita la precisione di questo metodo correlativo come il segnale di microscopia di Super-risoluzione è proveniente solo da questo strato sottile e la microscopio elettronico a scansione segnale sta visualizzando la topografia del campione. Questo metodo potrebbe anche essere combinato con formazione immagine multicolore. Tuttavia, è necessario prestare particolare attenzione che il campione può essere imaged nelle stesse condizioni (ad es. tampone di imaging) e cross-talk dovrebbe essere evitata.
Una limitazione del metodo è le due dimensioni si avvicinano, poiché solo un numero limitato di sezioni di serie (circa 3-7 per la cialda) possa essere raccolti. Così, progetti che fare con analisi del volume non sarebbe l'ideale. Tuttavia, è un metodo che può essere utilizzato per individuare l'espressione della proteina in qualsiasi tipo di tessuto sezionando semplice del campione. Forniamo un metodo senza uso di agenti di contrasto classica come citrato di piombo o acetato di uranile. Il contrasto lo shadowing platino fornisce contrasto topografico molto istruttiva, ma in alcuni casi le membrane sono difficili da risolvere. Questo può comportare problemi per progetti che hanno bisogno, ad esempio, per determinare l'espressione di proteine in piccole vescicole.
Il nostro protocollo, basato su Tokuyasu cryo-sezioni, utilizza equipaggiamento standard per ottenere risultati correlativi da Super-risoluzione e microscopi elettronici a scansione. La raccolta di sezioni su wafer di silicio e l'uso del platino per contrasto sono semplici passaggi per fornire stabilità e riproducibilità per la preparazione del campione.

Metodi per determinare la localizzazione subcellulare delle proteine e loro relazione con diversi compartimenti della cellula sono strumenti essenziali per comprendere le loro funzioni e le possibili interazioni. Microscopia di Super-risoluzione in combinazione con microscopia elettronica fornisce tali informazioni1. Microscopia di svuotamento dello stato fondamentale seguita da ritorno di singola molecola (GSDIM) è una tecnologia di microscopia di Super-risoluzione compatibile con una vasta gamma di fluorofori organici e codificato geneticamente2 e raggiunge una risoluzione laterale fino a 20 nm 3. l'incorporazione di metodi con risoluzione superiore a quella standard diffrazione limitata microscopia migliora l'accuratezza della correlazione4,5,6. Al fine di ottenere la migliore correlazione dell'espressione della proteina con un determinato comparto subcellulare e per ridurre il volume di incertezza7 l'uso della stessa sezione ultrasottile per luce e microscopia elettronica è raccomandato. Tra i vari metodi di taglio, Tokuyasu cryo-sezione protocollo non necessita di disidratazione o incorporamento di resina e, inoltre, conserva l'antigenicità di molti epitopi e fornisce buon tessuto ultrastruttura8. Diversi metodi hanno dimostrato l'applicabilità di queste sezioni correlativo luce e microscopia elettronica (CLEM)4,5,9,10.
La retina di zebrafish è un prezioso modello per studiare lo sviluppo visivo e meccanismi di malattia umana date la sua struttura altamente conservata e funzione in vertebrati. Fotorecettori della retina, particolare display la stessa architettura di fotorecettori dei mammiferi, con una sinapsi basale, un nucleo apico-basalmente allungata, il clustering dei mitocondri nel segmento apicale più interiore e un segmento esterno composto di membrana dischi in posizione più apicale11. La localizzazione della proteina per i diversi compartimenti cellulari è conservata tra zebrafish e umana, permettendo di indagine della funzione biologica di proteine umane rilevanti per la malattia12,13.
Qui presentiamo un protocollo per preparare larvale zebrafish retina campioni per risolvere la localizzazione della proteina della membrana mitocondriale esterna Tom20 da correlativo super-risoluzione luce e da microscopia elettronica. Il metodo si basa sulla raccolta di cryo-sezioni su wafer di silicio e l'ottenimento di contrasto da informazioni topografiche prodotte dopo l'applicazione di un sottile strato di platino. Questi passaggi sono miglioramenti tecnici chiaro in termini di facilità d'uso, riproducibilità e tempo per la realizzazione di esperimenti. Recentemente abbiamo dimostrato l'applicabilità del metodo per rilevare i pori nucleari e proteine mitocondriali in mouse tessuto14.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide EM Grade</td><td>EMS, USA</td><td>#16220</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate</td><td>Merck</td><td>#8.20670</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio, peqGOLD Universal</td><td>VWR International GmbH</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Stampi</td> <td>per inclusione piattiBEEM Flat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelatina di marca alimentare locale</td><td>Dr.Oetker</td><td>Extra Gold</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Merck</td> <td># 1.07687</td><td></td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Sigma</td><td>#M-6385</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>#G-7126</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina di tipo B</td><td>Sigma</td><td>#G-6650</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>#A6588.0050</td><td></td></tr><tr><td>Wafer di silicio</td><td>Si-Mat Tipo di materiali</td><td></td> in silicio<td>: P/Boro; Orientamento < 111> SU; Metodo di allevamento: CZ; Resistività: 1-30 ohm/cm; Superficie: lucida; Taglio laser a 7 x7 mm</td></tr><tr><td>Cryo-pin</td><td>Baltic Preparation</td><td>#16701950</td><td></td></tr><tr><td>Anello cablato "Perfect loop"</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strisce di silicone</td><td>Picodent</td><td>Twinsil 22</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G8270</td><td></td></tr><tr><td>glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G7141</td><td></td></tr><tr><td>catalasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>#C40</tr><tr><td>beta-Mercaptoetilammina cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M6500</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tom20</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>#sc - 11415</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 frammento d'asino anti coniglio IgG</td><td>Jackson Immuno-Research</td><td>#711-606-152</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ROCHE, Svizzera</td><td>#10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo soluzione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#49782</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri con fondo in vetro</td><td>Ibidi, Germania</td><td>u-Dish 35mm, fondo in vetro alto, #81158</td><td></td></tr><tr><td>Tronchetto in alluminio SEM</td><td>Agar Scientific</td><td>#G301F</td><td></td></tr><tr><td>Cemento conduttivo al carbonio Leit-C</td><td>Plano, Germania</td><td>AG3300</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Knife (Cryo Immuno)</td><td>Diatome</td><td>DCIMM3520</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems Leica EM</td><td>FCS</td><td></td></tr><tr><td>Widefield-TIRF microscopio GSD Leica SR GSD 3D</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo TIRF 160x 1,43</td><td>Leica Microsystems</td><td>11523048</td><td></td></tr><tr><td>SEM - Zeiss Supra 50 VP</td><td>Zeiss</td><td>Supra 50 VP</td><td></td></tr><tr><td>FIB-SEM - Zeiss Auriga 40</td><td>Zeiss</td><td>Auriga 40</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia elettronica e correlativo super-risoluzione per risolvere la localizzazione della proteina nella retina di zebrafish

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Presentiamo un metodo per studiare la localizzazione sottocellulare della proteina nella retina larvale zebrafish combinando microscopia di Super-risoluzione e microscopia elettronica a scansione. Le funzionalità di risoluzione sub-diffrazione limite di microscopi ottici di Super-risoluzione consentono di migliorare l'accuratezza dei dati correlati. Brevemente, 110 cryo-sezioni spesse nanometro sono trasferiti da un wafer di silicio e, dopo l'immunofluorescenza che macchia, sono ripresi dalla microscopia di Super-risoluzione. Successivamente, le sezioni vengono mantenute in metilcellulosa e platino ombreggiato prima di formazione immagine in un microscopio elettronico a scansione (SEM). Le immagini da queste due modalità di microscopia sono facilmente unite utilizzando punti di riferimento del tessuto con software open source. Qui descriviamo il metodo adattato per la retina di zebrafish larvale. Tuttavia, questo metodo è anche applicabile ad altri tipi di tessuti e organismi. Dimostriamo che le informazioni complementari ottenute da questa correlazione sono in grado di risolvere l'espressione delle proteine mitocondriali in relazione con le membrane e i cristae dei mitocondri come pure per quanto riguarda altri compartimenti della cellula.

L'espressione della proteina Tom20, un'unità secondaria del translocase della membrana mitocondriale esterna complesso20, è stato determinato, in sezioni sottili della retina di zebrafish larvale, da microscopia di Super-risoluzione (Figura 1) e questa informazione è stata integrato con il segnale topografico ottenuto da microscopia elettronica di esame dopo platino lo shadowing delle sezioni stesse. Questi dati correlativi confermano la localizzazione di una proteina in associazione con un particolare vano, membrana mitocondriale esterna e, inoltre, fornire informazioni circa la relazione tra la proteina con altri organelli della cellula.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg"> 
Figura 1: CLEM zebrafish retina. R. immagine di widefield basso ingrandimento di una sezione retinica di zebrafish 5 dpf, nuclei macchiati con DAPI (ciano). B. la microscopia della stessa area. C. maggiore ingrandimento widefield immagine del fotogramma in B. Nuclei macchiato con DAPI (ciano) e Tom20 mitocondriale colorazione appare in rosso. D. Widefield immagine della stessa sezione a maggiore ingrandimento. Il pattern di espressione di Tom20 è presso i cluster dei mitocondri. E. espressione di Tom20 (punti rossi) rilevati da microscopia GSDIM. Nuclei macchiati con DAPI (ciano). F. stessa sezione E combinando correlativo super-risoluzione e microscopia elettronica a scansione. Tom20 colorazione (punti rossi) appare il cluster mitocondriale (M) alle outer membrane dei mitocondri. Segnale di fluorescenza DAPI nei nuclei (N) corrisponde con la topografia dell'immagine SEM. G. immagine ad alto ingrandimento del fotogramma nel F. L'immagine di microscopia elettronica scansione fornisce il contesto per l'immagine GSDIM (punti rossi). Cristae mitocondriali sono chiaramente visibili e la macchiatura di Tom20 è localizzata alla membrana esterna dei mitocondri. Le membrane del segmento esterno i fotorecettori (OS) sono chiaramente risolti. Immagine pixel dimensioni 5 nm. Scala bar: A, B e c: 10 µm; D: 2 µm; E e f: 1 µm e g.: 0,2 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Complementare figura 1: allineamento delle immagini di luce e microscopia elettronica. A. Screenshot dall'interfaccia TrackEM2 con immagine di SEM e numerati luoghi d'interesse (gialli) lungo diversi nuclei. B. Screenshot dall'interfaccia TrackEM2 con immagine di fluorescenza e punti di riferimento numerati (giallo) lungo diversi DAPI macchiato i nuclei. Per modificare la trasparenza del layer i cursori nella parte superiore sinistra del menu possono essere utilizzati. Barra della scala: 1 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per ottenere risultati di localizzazione sottocellulare della proteina sulla retina di zebrafish correlando microscopia di Super-risoluzione e immagini di microscopia elettronica di scansione.

Microscopia elettronica e correlativo super-risoluzione per risolvere la localizzazione della proteina nella Retina di Zebrafish

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

L'obiettivo generale di questo metodo di microscopia è localizzare con precisione l'espressione proteica in relazione ai diversi organelli subcellulari nella retina di larve di pesce zebra, attraverso la correlazione di immagini ottenute mediante microscopia a super-risoluzione e microscopia elettronica a scansione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dello sviluppo retinico e dei percorsi cellulari, come ad esempio lo studio della miscalocalizzazione proteica in mutanti. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella combinazione della microscopia a super-risoluzione con la microscopia elettronica a scansione, al fine di ottenere dati altamente accurati sulla localizzazione delle proteine all'interno del contesto strutturale del campione.La raccolta di sezioni di Tokuyasu su wafer di silicone facilita notevolmente la manipolazione e l'uso della proiezione al platino per il contrasto fornisce una buona topografia del campione. Pertanto, questo metodo può fornire informazioni utili per lo studio della retina del pesce zebra in fase larvale. Uno dei suoi principali vantaggi è che può essere applicato anche a molti altri sistemi biologici, come l'identificazione dell'espressione proteica nei tessuti di topo.Dopo aver dissezionato gli occhi da larve di zebrafish fissate seguendo il protocollo descritto nel testo, riscaldare 15 millilitri di gelatina al 12% del marchio alimentare locale in PBS a 40 gradi Celsius. Quindi aspirare il PBS dai tubi contenenti gli occhi e aggiungere la soluzione di gelatina. Agitare delicatamente il tubo per assicurarsi che la gelatina penetri nel campione e incubare per 10-30 minuti a 40 gradi Celsius in un termoblocco con agitazione delicata o in un bagno d'acqua.In un bagno d'acqua a 40 gradi Celsius, riempire stampi di inclusione piatti in silicone o polietilene di dimensioni 12 per 5 per 3 millimetri con gelatina calda. Quindi, utilizzando una pipetta, aggiungere due occhi per stampo e, sotto un binocolo, usare un ago da dissezione per allinearli correttamente. Dopo aver lasciato raffreddare la gelatina a temperatura ambiente per un minuto, posizionarla a quattro gradi Celsius per 20 minuti per farla indurire.Sotto la lente binoculare, utilizzare una lametta per ritagliare nuovamente il blocco di gelatina in modo da adattarlo a un occhio per blocco. Trasferire gli occhi inclusi in gelatina in saccarosio 2,3 molare in PBS su ghiaccio. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius durante la notte.Quindi sostituire i campioni con una soluzione fresca di saccarosio 2,3 M. Conservare il tessuto a quattro gradi Celsius o a meno 20 gradi Celsius per una conservazione fino a diversi mesi. Rilavorare nuovamente il blocco di gelatina fino a ridurlo quasi alle dimensioni dell'occhio prima di trasferirlo su un perno criogenico.Quindi congelare il blocco in azoto liquido e trasferirlo su un crioultramicrotomo. Utilizzando un coltello al diamante, tagliare sezioni di 110 nanometri di spessore a meno 120 gradi Celsius nel crioultramicrotomo. Raccogliere le sezioni con un anello metallico contenente una goccia di soluzione al 2% di metilcellulosa e saccarosio 2,3 molare.Quindi trasferire i campioni su una piastrina di silicone di sette per sette millimetri. Per lavare le piastrine, pipettare quattro gocce e posizionare le piastrine a faccia in giù sulle gocce. Incubare le piastrine sulle gocce a zero gradi Celsius per 20 minuti.Quindi lavare le wafer due volte in PBS a temperatura ambiente per due minuti ciascuna. Incubare i campioni tre volte in glicina 0,15% in PBS per un minuto ciascuna. Successivamente, utilizzare PBS per lavare i campioni tre volte per un minuto per ogni lavaggio.Preincubare il tessuto con PBG per cinque minuti. Successivamente, aggiungere ai campioni coniglio anti-Tom20 in PBG. E incubare le sezioni a temperatura ambiente per 30 minuti.Con PBG, lavare il tessuto sei volte per un minuto per ogni lavaggio. Quindi pre-incubare i campioni con PBG a temperatura ambiente per cinque minuti. Sostituire il PBG con frammenti divalenti di Fab anti-coniglio marcati con Alexa 647 in PBG e incubare per 30 minuti.Lavare i campioni in PBG sei volte per un minuto per ogni lavaggio. Quindi utilizzare PBS per lavare le wafer tre volte per due minuti. Aggiungere DAPI e PBS alle wafer e incubare per 10 secondi.Quindi lavare i campioni due volte con PBS, per due minuti ciascuna. Posizionare la wafer su una goccia di una soluzione uno a uno di glicerolo al 80% e buffer di imaging contenente un sistema scavenger di ossigeno e incubare brevemente. Trasferire le wafer, con il lato del tessuto rivolto verso il basso, su una goccia fresca della miscela uno a uno di glicerolo al 80% e buffer di imaging in una piastra di Petri con fondo in vetro.Utilizzare una pipetta da tutti i lati per rimuovere la maggior parte del liquido al di sotto della wafer. Quindi utilizzare strisce di silicone per fissare la wafer al fondo della piastra di Petri. Posizionare le sezioni montate su un microscopio invertito dotato di un obiettivo ad immersione in olio con elevata apertura numerica.Prima dell'acquisizione delle immagini, lasciare che il campione raggiunga l'equilibrio alla temperatura del microscopio al fine di minimizzare o ridurre le deriva laterale e assiale. Centrare l'area di interesse e acquisire immagini di riferimento in campo chiaro ad epifluorescenza. Passare alla modalità operativa di super-risoluzione.Regolare il tempo di esposizione della fotocamera a 15 millisecondi e impostare il guadagno di moltiplicazione elettronica al valore massimo di 300. Successivamente, illuminare il campione in modalità epifluorescenza con il laser a 642 nanometri alla potenza massima del laser. Non appena i lampeggiamenti delle singole molecole risultano ben separati in ogni fotogramma, in modo che la probabilità di sovrapposizione tra segnali individuali sia bassa, ridurre la potenza del laser a circa 1/3.Registrare l'immagine grezza in epifluorescenza acquisendo un minimo di 30.000 fotogrammi. Dai dati grezzi, sotto Strumenti, analisi della serie temporale utilizzare una soglia di rilevamento di 30 fotoni. Fare clic su Valuta per generare un elenco di eventi di localizzazione.Sotto Strumenti, nel pannello Elaborazione elenco eventi, fare clic su Crea immagine per visualizzare l'immagine a super-risoluzione mediante adattamento gaussiano, applicando una dimensione del pixel di rendering di quattro nanometri. Rimuovere le strisce di silicone e aggiungere una goccia di PBS vicino ai bordi della piastrina per sollevarla dalla capsula di Petri. Dopo aver lavato la piastrina due volte con PBS per due minuti ciascuna, utilizzare glutaraldeide 0,1% in PBS per fissarla ulteriormente per cinque minuti.Quindi lavare il campione altre due volte per due minuti per ogni lavaggio in PBS. Incubare la wafer in una goccia di metilcellulosa al 2% in acqua su ghiaccio due volte per cinque minuti per ogni incubazione. Successivamente inserire la wafer in una provetta per centrifuga e centrifugare a 14.100 ×g per 90 secondi.Dopo la centrifugazione, utilizzare un cemento conduttivo al carbonio per montare la wafer su un portacampioni in alluminio per SEM. Mediante un dispositivo di evaporazione a fascio elettronico, aggiungere un rivestimento di due-dieci nanometri di carbonio platinato sul campione mediante ombreggiatura rotatoria con le seguenti impostazioni. Acquisire le immagini delle sezioni con un microscopio elettronico a scansione a 1,5 chilovolt, distanza di lavoro di due millimetri e con un rivelatore di elettroni secondari a lente interna.Utilizzare Fiji per aprire le immagini di microscopia ottica ed elettronica cliccando su File, Apri. Regolare le dimensioni della tela cliccando su Immagine, Regola, Dimensioni tela. Successivamente, riunire entrambe le immagini in uno stack cliccando su Immagine, Stack, Immagini in stack.In Fiji, aprire una nuova interfaccia traccia EM2 facendo clic su File, Nuovo, Nuova traccia EM2. Importare lo stack con entrambe le immagini facendo clic con il tasto destro sulla finestra nera e selezionando Importa stack. Allineare manualmente l'immagine di microscopia ottica all'immagine di microscopia elettronica mediante punti di riferimento, utilizzando un clic con il tasto destro sull'immagine e selezionando Allinea, Allinea livello manualmente con punti di riferimento.Scegliere lo strumento Selezione per aggiungere punti di riferimento. Utilizzare la forma dei nuclei come riferimento per selezionare gli stessi margini in entrambe le immagini e aggiungere diversi punti. Applicare l'allineamento con un modello affine facendo clic con il tasto destro e selezionando Applica trasformazione, Modello affine.Infine, modificare la trasparenza del livello per valutare la qualità dell'allineamento. Questo pannello mostra un'immagine a campo ampio a bassa magnificazione di una sezione retinica di zebrafish a cinque giorni post-fertilizzazione. La stessa area è mostrata qui mediante microscopia elettronica a scansione.Queste immagini ad ingrandimento maggiore mostrano la colorazione di Tom20 in rosso con aggregati localizzati nei mitocondri. L'espressione di Tom20 è mostrata qui come rilevata mediante microscopia GSDIM. In questa immagine, la stessa sezione combina microscopia elettronica a scansione e microscopia super-risololutiva correlative.La colorazione di Tom20 appare all'interno dell'aggregato mitocondriale sulle membrane esterne dei mitocondri. Il segnale fluorescente di DAPI nei nuclei corrisponde alla topografia dell'immagine al SEM. Questa immagine al SEM fornisce un contesto alla colorazione di Tom20 nell'immagine GSDIM.Le creste mitocondriali sono chiaramente visibili e la colorazione per Tom20 è localizzata alle membrane esterne dei mitocondri. Le membrane del segmento esterno dei fotorecettori sono chiaramente risolte. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare al meglio possibile i parametri di marcatura e di acquisizione delle immagini.Solo i campioni etichettati in modo ottimale sono adatti alla super-risoluzione. I campioni non devono mai asciugarsi in alcun momento durante la procedura di etichettatura. Questa procedura potrebbe essere estesa a una doppia etichettatura mediante immunofluorescenza, consentendo così la localizzazione di due proteine diverse all'interno di una struttura specifica.Nel caso di campioni più complessi, si consiglia l'uso di marcatori fiduciali per ottenere un allineamento preciso delle immagini. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire studi correlative per localizzare le proteine in relazione ai diversi organelli cellulari in un campione di tessuto complesso con precisione di super-risoluzione.

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Microscopia elettronica e correlativo super-risoluzione per risolvere la localizzazione della proteina nella Retina di Zebrafish (Video) | JoVE Journal

Microscopia elettronica e correlativo super-risoluzione per risolvere la localizzazione della proteina nella Retina di Zebrafish

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