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Developmental Biology

Correlative सुपर संकल्प और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी Zebrafish रेटिना में प्रोटीन स्थानीयकरण को हल करने के लिए

Published: November 10, 2017 doi: 10.3791/56113
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 2, 1, 2,3, 1
1Center for Microscopy and Image Analysis, University of Zurich, 2Institute for Molecular Life Sciences, University of Zurich, 3Institute for Medical Genetics, University of Zurich

Summary

इस प्रोटोकॉल correlating सुपर संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों द्वारा zebrafish रेटिना पर उपसेलुलर प्रोटीन स्थानीयकरण परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन करता है ।

Abstract

हम सुपर संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के संयोजन से लार्वा zebrafish रेटिना में उपसेलुलर प्रोटीन स्थानीयकरण की जांच करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । सुपर संकल्प प्रकाश सूक्ष्मदर्शी की उप-विवर्तन सीमा संकल्प क्षमताओं को संबंधित डेटा की सटीकता में सुधार की अनुमति देते हैं । संक्षेप में, ११० नैनोमीटर मोटी क्रायो-वर्गों एक सिलिकॉन वेफर को हस्तांतरित कर रहे है और, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के बाद, सुपर संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged हैं । बाद में, वर्गों methylcellulose और प्लैटिनम में संरक्षित कर रहे है एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) में इमेजिंग से पहले छाया हुआ । इन दो सूक्ष्म तरीकों से छवियों को आसानी से खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के साथ ऊतक स्थलों का उपयोग कर विलय कर रहे हैं । यहां हम लार्वा zebrafish रेटिना के लिए अनुकूलित विधि का वर्णन । हालांकि, इस विधि के ऊतकों और जीवों के अन्य प्रकार के लिए भी लागू है । हम यह दर्शाते हैं कि इस संबंध द्वारा प्राप्त पूरक जानकारी कोशिका के अन्य डिब्बों के साथ-साथ mitochondria के झिल्ली और cristae के संबंध में mitochondrial प्रोटीन की अभिव्यक्ति को हल करने में सक्षम है.

Introduction

तरीके प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण और सेल के विभिन्न डिब्बों के लिए उनके रिश्ते का निर्धारण करने के लिए उनके कार्यों और संभव बातचीत को समझने के लिए आवश्यक उपकरण हैं । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी ऐसी जानकारी प्रदान करता है1. भूमि राज्य कमी व्यक्तिगत अणु वापसी के बाद माइक्रोस्कोपी (GSDIM) एक सुपर संकल्प सूक्ष्म प्रौद्योगिकी कार्बनिक और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorophores2 की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत है और 20 एनएम के लिए एक पार्श्व संकल्प प्राप्त 3. मानक विवर्तन से उच्च संकल्प के साथ तरीकों का शामिल-सीमित माइक्रोस्कोपी सहसंबंध4,5,6की सटीकता में सुधार करता है । आदेश में एक विशिष्ट उपसेलुलर डिब्बे के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति का सबसे अच्छा संबंध को प्राप्त करने और अनिश्चितता की मात्रा को कम करने के लिए7 प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक ही ultrathin अनुभाग के उपयोग की सिफारिश की है । विभिंन अनुभागीय तरीकों के अलावा, Tokuyasu क्रायो-अनुभाग प्रोटोकॉल निर्जलीकरण या राल embedding की आवश्यकता नहीं है और, इसके अलावा में, कई epitopes के antigenicity को बरकरार रखता है और अच्छे ऊतक ultrastructure प्रदान करता है8। कई तरीकों correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों)4,5,9,10में इन वर्गों की प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया है ।

zebrafish रेटिना एक मूल्यवान दृश्य विकास और मानव रोग रीढ़ भर में अपने अत्यधिक संरक्षित संरचना और समारोह दिया तंत्र का अध्ययन करने के लिए मॉडल है. विशेष रूप से, रेटिना photoreceptors स्तनधारी photoreceptors के रूप में एक ही वास्तुकला प्रदर्शित, एक बेसल synapse, एक apico-बेसल लंबी नाभिक के साथ, अधिक mitochondria भीतरी खंड में शिखर की clustering और एक बाहरी झिल्ली से बना खंड सबसे शिखर स्थिति11में डिस्क्स । प्रोटीन स्थानीयकरण विविध सेलुलर डिब्बों को zebrafish और मानव के बीच संरक्षित है, मानव रोग के जैविक समारोह-प्रासंगिक प्रोटीन12,13की जांच की अनुमति ।

यहाँ हम correlative सुपर संकल्प प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा mitochondrial बाहरी झिल्ली प्रोटीन Tom20 के स्थानीयकरण को हल करने के लिए लार्वा zebrafish रेटिना नमूने तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । विधि सिलिकॉन वेफर्स पर क्रायो-वर्गों को इकट्ठा करने और स्थलाकृतिक प्लेटिनम की एक पतली परत के आवेदन के बाद उत्पादित जानकारी के द्वारा इसके विपरीत प्राप्त करने पर आधारित है । इन चरणों का उपयोग करने के लिए आसानी के मामले में स्पष्ट तकनीकी सुधार कर रहे हैं, reproducibility, और प्रयोग पूरा करने के लिए समय. हमने हाल ही में माउस के ऊतकों में परमाणु pores और mitochondrial प्रोटीन का पता लगाने के लिए विधि की प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया14।

Protocol

< p class = "jove_content" > नेत्र और विजन रिसर्च में जानवरों के इस्तेमाल के लिए ARVO बयान के अनुसार सभी प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया और इसे स्थानीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया ।

< p class = "jove_title" > 1. सिलिकॉन वेफर्स पर Ultrathin सेक्शन की तैयारी

  1. नमूना निर्धारण
    1. निर्धारण समाधान तैयार करें जिसमें ०.१% glutaraldehyde, 4% formaldehyde में ०.१ मीटर cacodylate बफर है.
      नोट: सावधानी! सावधानी का प्रयोग करें जब glutaraldehyde, formaldehyde और cacodylate बफर के साथ काम कर रहे हैं, उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनते है और एक धुएं डाकू में काम करते हैं ।
    2. Euthanize 5 दिनों के बाद निषेचन (5 dpf) zebrafish लार्वा के साथ tricaine (एथिल 3-aminobenzoate methanesulfonate, ०.४% डब्ल्यू/वी के पंजाब में (फास्फेट बफर खारा, पीएच 7)) के रूप में पहले से वर्णित < सुप वर्ग = "xref" > १५ .
    3. बर्फ पर पूर्व ठंडा कर निर्धारण समाधान में विसर्जन करके लार्वा को ठीक करें । सिर निकालो और रात भर गर्मी 4 & #176; सी कोमल कमाल के साथ ।
    4. टुकड़े आंखों के आसपास के ऊतकों की छंटनी करके आँखों को ठीक संदंश और एक microdissection स्केलपेल (एक दूरबीन के नीचे) एक 1% agarose पलंगों वाली प्लेट पर ठंडा कर निर्धारण समाधान में । ताजा पूर्व ठंडा निर्धारण के साथ एक ट्यूब के लिए आंखों स्थानांतरण ।
    5. दो बार पंजाब में धोने (फॉस्फेट बफर खारा, पीएच ७.४) 5 मिनट के लिए प्रत्येक कमरे के तापमान पर धोने (RT).
  2. जिलेटिन घुसपैठ और बढ़ते
    1. गर्म ऊपर 15 मिलीलीटर स्थानीय खाद्य ब्रांड जिलेटिन 12% डब्ल्यू/वी पीबी & #160;(p hosphate बफर, ०.१ एम पीएच ७.४) में ४० & #176; ग. पंजाबियों को निकालें और आंखों युक्त ट्यूबों के लिए जिलेटिन समाधान जोड़ें । जिलेटिन सुनिश्चित करने के लिए धीरे ट्यूब नल नमूना और ४० पर 10-30 मिनट के लिए गर्मी की #176 & में एक thermoblock के साथ कोमल मिलाते हुए या एक पानी स्नान में सी ।
    2. भरने 12 मिमी x 5 मिमी x 3 मिमी सिलिकॉन या एक ४० & #176 में गर्म जिलेटिन के साथ पॉलीथीन फ्लैट embedding मोल्ड; सी जल स्नान । एक पिपेट का उपयोग कर मोल्ड प्रति दो आंखें जोड़ें, एक विच्छेदन सुई का उपयोग कर एक दूरबीन के तहत उन्हें ठीक से संरेखित करें और जिलेटिन 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शांत हो जाओ और 4 & #176 पर सख्त; C 20 min.
      3. के लिए
    3. पुन: दूरबीन के तहत जिलेटिन ब्लॉक ट्रिम करने के लिए एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर ब्लॉक प्रति एक आंख फिट ।
    4. बर्फ पर पंजाब में २.३ मीटर सुक्रोज के लिए जिलेटिन एंबेडेड आंखें हस्तांतरण । पर गर्मी 4 & #176; ग रात भर.
    5. एक्सचेंज को नया २.३ M सुक्रोज हल और स्टोर पर 4 & #176; c या-20 & #176; ग; इस चरण के बाद, नमूने खोदी जा सकने के लिए तैयार हैं या इन पर संग्रहित किया जा सकता है-20 & #176; C महीनों से कई हफ्तों के लिए.
    6. फिर से एक क्रायो-पिन करने के लिए स्थानांतरित करने से पहले आंख के लगभग आकार करने के लिए जिलेटिन ब्लॉक ट्रिम कर दीजिए । तरल नाइट्रोजन में फ्रीज और एक क्रायो-ultramicrotome.
      7. करने के लिए स्थानांतरण
  3. Cryosectioning
    1. कट ११० एनएम मोटी-वर्गों पर-१२० & #176; ग में हीरे के चाकू के साथ क्रायो-ultramicrotome.
    2. 2% methylcellulose (पानी में) और २.३ मीटर सुक्रोज समाधान (1:1) की एक छोटी बूंद युक्त एक वायर्ड पाश के साथ वर्गों उठाओ । एक 7 मिमी x 7 मिमी सिलिकॉन वेफर के लिए वर्गों स्थानांतरण । संग्रह अनुभागों पर 4 & #176; C आगे संसाधन तक.
< p class = "jove_title" > 2. Immunolabelling

  1. धो वेफर्स पर पंजाबियों के साथ 0 & #176; ग पर 20 मिनट के लिए चार & #160;d पर वेफर्स को उल्टा रखकर बूंदों को उलटा रॉप. कमरे के तापमान पर पंजाब 2x 2 मिनट में धो लें ।
  2. 1 मिनट प्रत्येक के लिए, पंजाब में ०.१५% glycine में 3 बार मशीन । 1 मिनट के लिए 3x धो लें/ PBG के साथ पूर्व-गर्मी (०.५% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन BSA और ०.२% जिलेटिन प्रकार बी के साथ पंजाब) 5 min.
    3. के लिए
  3. खरगोश विरोधी Tom20 के साथ गर्मी (सामग्री के तालिका देखें) PBG में (4 & #181; g/एमएल) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ।
  4. वाश 6x for 1 min/PBG में धो लें । पूर्व-आरटी पर 5 मिनट के लिए PBG के साथ मशीन विरोधी खरगोश Alexa ६४७ एफ के साथ (ab & #39;) 2 (सामग्री की तालिका देखें) में PBG (७.५ & #181; g/mL) के लिए 30 min.
  5. वाश 6x for 1 min/PBG में धो लें । पंजाब में 3x 2 मिनट धो लो । DAPI के साथ मशीन (4 & #181; g//पंजाब में 10 एस धो 2x 2 मिनट के लिए पंजाब में.
< p class = "jove_title" > 3. सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी

  1. ग्लिसरॉल की एक छोटी बूंद (८०%) और इमेजिंग बफर युक्त एक ऑक्सीजन सफाई प्रणाली (२०० mM फॉस्फेट बफर युक्त 10% ग्लूकोज, ०.५ मिलीग्राम/एमएल के एक छोटा सा पर रखने के द्वारा वेफर संक्षेप (10 एस) की मशीन glucoseoxidase, ४० & #181; जी/एमएल catalase, 15 एमएम बीटा-mercaptoethylamine हाइडरोक्लॉराइड (मेे एचसीएल), पीएच ८.०) ।
  2. स्थानांतरण वेफर्स (धारा नीचे का सामना करना पड़) एक गिलास नीचे (मोटाई १७० & #177; 5 & #181; m) ग्लिसरॉल के 1:1 मिश्रण की एक ताजा बूंद पर पेट्री डिश (८०%) और इमेजिंग बफर (के रूप में चरण में ३.१) ।
  3. सभी पक्षों से दूर, एक पिपेट के साथ, वेफर के नीचे तरल का सबसे । पेट्री डिश के नीचे करने के लिए वेफर को ठीक करने के लिए सिलिकॉन धारियों का प्रयोग करें ।
    नोट: सिलिकॉन धारियों के दो घटक सिलिकॉन-गोंद (3 मिमी x 12 मिमी) से बाहर कर दिया जाता है ।
    4. एक औंधा खुर्दबीन पर
  4. छवि वर्गों के एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर का उपयोग ( उदा 160X & #160;/NA १.४३; सामग्री की तालिका देखें) तेल विसर्जन सुपर संकल्प समर्पित उद्देश्य । इमेजिंग करने से पहले, नमूना equilibrate को कम करने के लिए तापमान माइक्रोस्कोप करने के लिए चलो/पार्श्व और अक्षीय बहाव को कम करने के लिए ।
  5. केंद्र हित के क्षेत्र और पहली widefield epifluorescence संदर्भ छवियों का अधिग्रहण । सुपर रिज़ॉल्यूशन कार्रवाई मोड में परिवर्तित करें । 15 एमएस के लिए कैमरे के जोखिम समय समायोजित करें और इलेक्ट्रॉन गुणा (EM) ३००.
    6. की अधिकतम करने के लिए लाभ
  6. अधिकतम लेजर शक्ति पर ६४२ एनएम सतत तरंग लेजर के साथ प्रबुद्ध नमूना (~ २.८ किलोवाट/सेमी 2 ) epifluorescence मोड में करने के लिए इसी । जैसे ही एक अणु पलक अच्छी तरह से प्रत्येक फ्रेम में अलग कर रहे हैं, ताकि संभावना कम है कि व्यक्तिगत संकेतों ओवरलैप, लेजर पावर सेट करने के लिए ~ ०.७ किलोवाट/cm 2 । ३०,००० फ्रेम की एक ंयूनतम प्राप्त करने के द्वारा epifluorescence मोड में रॉ छवि रिकॉर्ड ।
    नोट: ये सभी पैरामीटर भिंन नमूनों और लेबलिंग घनत्व के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।
    7. कच्चे डेटा से
  7. , एक पुनर्निर्माण घटना सूची उत्पंन (रॉ छवि में प्रत्येक एक अणु पलक के स्थानीयकरण) 30 फोटॉनों का पता लगाने दहलीज का उपयोग कर (नमूने के अनुसार समायोजित करने की जरूरत है) क्लिक करके & #34; यूज्ड & #34; में & #39; टी सीरीज analysis & #39; के तहत & #39; tools & #39;.
  8. गाऊसी फिटिंग द्वारा सुपर संकल्प छवि कल्पना < सुप वर्ग = "xref" > १६ क्लिक करके 4 एनएम का एक प्रतिपादन पिक्सेल आकार लागू & #34; छवि बनाएं & #34; म & #39; स्पर्धा सूची प्रोसेसिंग पैनल & #39; के तहत & #39; औजार. & #39;
    नोट: सुपर हल छवि पैदा करने के लिए इस अध्ययन में इस्तेमाल प्रणाली के एकीकृत सॉफ्टवेयर उपकरण कार्यरत थे. हालांकि, वर्णित सुपर संकल्प इमेजिंग किसी भी अंय एक अणु स्थानीयकरण आधारित प्रणाली पर किया जा सकता है, और डेटा के रूप में खुला स्रोत सॉफ्टवेयर उपकरण के साथ संसाधित किया जा सकता है आंधी < सुप वर्ग = "xref" > १७ .
< p class = "jove_title" > 4. प्लैटिनम छाया देने वाले

  1. सिलिकॉन पट्टियों को हटाने और वेफर्स के किनारों के करीब एक बूंद को जोड़ने के लिए यह पेट्री डिश से ऊपर उठा । पंजाब में वेफर 2x 2 मिनट धो लो, तो पोस्ट यह ०.१% glutaraldehyde के साथ 5 min. धो के लिए 2 मिनट के लिए 2x/
  2. पानी में बर्फ पर methylcellulose 2% की 1 बूंद में 5 मिनट के लिए दो बार वेफर मशीन । एक केंद्रापसारक ट्यूब में वेफर डालें और ९० एस के लिए १४,१०० x g पर केंद्रापसारक यह कार्बन सीमेंट के संचालन के साथ एक SEM एल्यूमीनियम ठूंठ पर माउंट ।
  3. 8 में रोटरी छाया द्वारा नमूना पर 2 से 10 एनएम/कार्बन की एक परत जोड़ें & #176; एक इलेक्ट्रॉन बीम वाष्पीकरण डिवाइस सेटिंग्स का उपयोग करना: १.५५ केवी, ५५ एमए, ०.३ एनएम/एस, और 8 & #176 का एक कोण, रोटेशन स्तर 4.
< p class = "jove_title" > 5. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. छवि वर्गों के साथ एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन एम१.५ केवी, 2 मिमी काम दूरी पर icroscope और एक लेंस माध्यमिक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर में के साथ ।
< p class = "jove_title" > 6. प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों के संरेखण

  1. फिजी के साथ दोनों प्रकार की छवियों को खोलें < सुप क्लास = "xref" > 18 by click & #34; फाइल | खुला & #34;. क्लिक करके कैनवास का आकार समायोजित करें & #34; छवि | समायोजित करें । कैनवास साइज़ & #34; और दोनों इमेजेस को क्लिक करके टैक् स को लाएं & #34; इमेज | पोट | images to टैक् & #34;. स्टैक के रूप में tiff फ़ाइल प्रकार सहेजें ।
    2. फिजी में
  2. , एक नया TrackEM2 < सुप क्लास = "xref" > 19 इंटरफेस क्लिक करके & #34; फाइल | new | TrackEM2 (new) & #34;. सही काली विंडो पर क्लिक करके दोनों छवियों के साथ ढेर आयात और & #34 का चयन; आयात स्टैक & #34;.
  3. छवि पर एक सही माउस क्लिक का उपयोग करके स्थलों के साथ मैन्युअल रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि को संरेखित करें और & #34 का चयन; संरेखण | स्तर के साथ मैन्युअल रूप से परत संरेखित करें & #34;.
    1. चुनें उपकरण (काला तीर) स्थलों को जोड़ने के लिए उठाओ । दोनों छवियों में समान किनारों का चयन करने के लिए संदर्भ के रूप में नाभिक के आकार का उपयोग करें ( अनुपूरक चित्रा 1 ) । कई बिंदुओं को जोड़ें (न्यूनतम तीन बिंदुओं को चयनित करने की आवश्यकता है). सही माउस क्लिक करके एक affine मॉडल के साथ संरेखण लागू करें, और & #34 का चयन; ट्रांस्फ़ॉर्म लागू करें । Affine model & #34;.
  4. परत पारदर्शिता बदलें ( अनुपूरक चित्रा 1 देखें) संरेखण की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए ।

Representative Results

प्रोटीन Tom20 की अभिव्यक्ति, translocase mitochondrial बाहरी झिल्ली जटिल20की एक उपइकाई, लार्वा zebrafish रेटिना के पतले वर्गों में, सुपर संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1) द्वारा निर्धारित किया गया था और यह जानकारी थी स्थलाकृतिक एक ही वर्गों के प्लैटिनम छाया के बाद इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा प्राप्त संकेत के साथ पूरित । ये correlative डेटा एक विशेष डिब्बे के साथ सहयोग में एक प्रोटीन के स्थानीयकरण की पुष्टि, बाहरी mitochondrial झिल्ली और, इसके अलावा कोशिका के अन्य organelles के साथ प्रोटीन के संबंध के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं.

Figure 1
चित्रा 1: भूखों पर zebrafish रेटिना । एक 5 dpf zebrafish रेटिना खंड, नाभिक DAPI (सियान) के साथ सना हुआ की कम आवर्धन widefield छवि । इसी क्षेत्र की बी. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी. C. उच्च आवर्धन widefield नाभिक में फ़्रेम की छवि DAPI (सियान) के साथ सना हुआ और Tom20 mitochondrial धुंधला लाल रंग में प्रकट होता है । उच्च आवर्धन पर एक ही अनुभाग की D. Widefield छवि । Tom20 अभिव्यक्ति का पैटर्न mitochondria के समूहों में है । Tom20 (लाल डॉट्स) की अभिव्यक्ति ई. GSDIM माइक्रोस्कोपी द्वारा पता चला. DAPI (सियान) के साथ सना नाभिक । ई संयोजन correlative सुपर संकल्प और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में एक ही खंड F. Tom20 धुंधला (लाल डॉट्स) mitochondria के बाहरी झिल्ली पर mitochondrial क्लस्टर (एम) में प्रकट होता है । नाभिक (एन) में प्रतिदीप्ति DAPI संकेत SEM छवि की स्थलाकृति के साथ मेल खाती है । F. में फ़्रेम का Gउच्च आवर्धन छवि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि GSDIM छवि (लाल डॉट्स) के लिए संदर्भ प्रदान करता है । Mitochondrial cristae स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं और Tom20 धुंधला mitochondria की बाहरी झिल्ली के लिए स्थानीयकृत है । बाहरी खंड photoreceptors (ओएस) की झिल्ली स्पष्ट रूप से हल कर रहे हैं । छवि पिक्सेल आकार 5 एनएम । स्केल बार्स: A, B, and C: 10 µm; D: 2 µm; ई और एफ: 1 µm और जी: ०.२ µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों का संरेखण । SEM छवि और गिने स्थलों के साथ TrackEM2 अंतरफलक से A. स्क्रीनशॉट (पीले) अलग नाभिक साथ । प्रतिदीप्ति छवि और अलग DAPI सना हुआ नाभिक साथ गिने स्थलों (पीले) के साथ TrackEM2 इंटरफेस से बीस्क्रीनशॉट । परत पारदर्शिता बदलने के लिए मेनू के बाईं ऊपरी भाग पर स्लाइडर्स इस्तेमाल किया जा सकता है । स्केल बार: 1 µm. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Discussion

इस विधि में एक organelle में प्रोटीन की सटीक स्थिति निर्धारित करने के लिए संदर्भ जानकारी के साथ सुपर हल प्रोटीन स्थानीयकरण को जोड़ती है । हम यहाँ mitochondria की बाहरी झिल्ली में Tom20 की अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए प्रयोग के समापन का प्रदर्शन, और photoreceptor लार्वा रेटिना में zebrafish के नाभिक या बाहरी क्षेत्रों की तरह अन्य organelles के लिए अपने संबंध.

Tokuyasu क्रायो-अनुभाग में अच्छी तरह से संरक्षित वर्गों को प्राप्त करने के लिए कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता है । हालांकि, यह एक के साथ कई प्रयोगशालाओं में कार्यरत पद्धति है सफलता का प्रदर्शन21। सिलिकॉन वेफर के लिए वर्गों के हस्तांतरण बहुत आसान है और कोई विशेष विचार की जरूरत है । इमेजिंग बफर में ग्लिसरॉल का उपयोग वर्गों के सूखने से बचने के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है । सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब वेफर बहुत पेट्री डिश के नीचे कांच के करीब है । सिलिकॉन धारियों इस स्थिति में वेफर बनाए रखने में मदद करते हैं । वर्गों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए धारियों को हटाते समय विशेष सावधानी बरतनी होगी ।

क्रायो की मोटाई-वर्गों, १०० एनएम के आसपास, Z-आयाम में ऑप्टिकल संकल्प से पतले, इसके अलावा सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी संकेत के रूप में इस correlative विधि की सटीकता की सुविधा केवल इस पतली परत से आ रहा है और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप संकेत नमूना की स्थलाकृति प्रदर्शित कर रहा है । इस विधि भी बहुरंगा इमेजिंग के साथ जोड़ा जा सकता है । हालांकि, विशेष देखभाल लिया जाना चाहिए कि नमूना एक ही स्थिति के तहत imaged किया जा सकता है (उदाहरण के लिए इमेजिंग बफर) और क्रॉस टॉक रोका जाना चाहिए ।

विधि की एक सीमा अपने दो आयामी दृष्टिकोण है, केवल धारावाहिक वर्गों की एक सीमित संख्या के बाद से (के बारे में 3 से 7 वेफर प्रति) एकत्र किया जा सकता है । इस प्रकार, परियोजनाओं की मात्रा विश्लेषण से निपटने आदर्श नहीं होगा । हालांकि, यह एक तरीका है कि नमूने के सरल अनुभाग द्वारा ऊतक के किसी भी प्रकार में प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है । हम uranyl एसीटेट या सीसा साइट्रेट जैसे शास्त्रीय विपरीत एजेंटों के उपयोग के बिना एक विधि प्रदान करते हैं । प्लैटिनम छायांकित द्वारा इसके विपरीत बहुत जानकारीपूर्ण स्थलाकृतिक विपरीत प्रदान करता है, लेकिन कुछ मामलों में झिल्ली को हल करने के लिए मुश्किल हैं । यह परियोजनाओं के लिए समस्या है कि जरूरत है, उदाहरण के लिए, छोटे बुलबुले में प्रोटीन की अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए पैदा कर सकता है ।

हमारे प्रोटोकॉल, Tokuyasu क्रायो के आधार पर-वर्गों, मानक उपकरण का उपयोग करता है के लिए सुपर संकल्प से correlative परिणाम प्राप्त करने और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी स्कैनिंग । सिलिकॉन वेफर्स पर वर्गों का संग्रह और इसके विपरीत प्लेटिनम के उपयोग के लिए नमूना तैयार करने के लिए स्थिरता और reproducibility प्रदान करने के लिए सरल कदम हैं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

अनुदान आयन और आरजीबी: स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन Ambizione-स्कोर ग्रांट PZ00P3 142404/1 और PZ00P3 १६३९७९.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich #158127
Glutaraldehyde EM Grade EMS, USA #16220
Cacodylate Merck #8.20670
Tricaine Sigma-Aldrich #886-86-2
Agarose, peqGOLD Universal VWR International GmbH 35-1020
Flat embedding molds BEEM Flat
Local food brand gelatin Dr.Oetker Extra Gold
Sucrose Merck #1.07687
Methylcellulose Sigma #M-6385
Glycine Sigma #G-7126
Gelatin type B Sigma #G-6650
BSA Applichem #A6588.0050
Silicon wafer Si-Mat Silicon Materials Type: P/Boron; Orientation <111> ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm
Cryo-pin Baltic Preparation #16701950
Wired loop "Perfect loop"
Silicone stripes Picodent Twinsil 22
Glucose Sigma-Aldrich #G8270
glucoseoxidase Sigma-Aldrich #G7141
catalase Sigma-Aldrich #C40
beta-Mercaptoethylamine hydrochloride Sigma-Aldrich #M6500
anti-Tom20 Santa Cruz Biotechnology #sc - 11415
AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti rabbit IgG Jackson Immuno-Research #711-606-152
DAPI ROCHE, Switzerland #10236276001
Glycerol solution Sigma-Aldrich #49782
Glass bottom petri dish Ibidi, Germany u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158
SEM aluminium stub Agar Scientific #G301F
Conducting carbon cement Leit-C Plano, Germany AG3300
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
Diamond Knife (Cryo Immuno) Diatome DCIMM3520
Cryo-ultramicrotome Leica Microsystems Leica EM FCS
Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D Leica Microsystems
160x 1.43 TIRF objective Leica Microsystems 11523048
SEM - Zeiss Supra 50 VP Zeiss Supra 50 VP
FIB-SEM - Zeiss Auriga 40 Zeiss Auriga 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities. Chem Rev. , (2017).
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विकास जीव विज्ञान अंक १२९ भूखों इम्यूनोफ्लोरेसेंस सुपर संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी उपसेलुलर स्थानीयकरण zebrafish रेटिना
Correlative सुपर संकल्प और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी Zebrafish रेटिना में प्रोटीन स्थानीयकरण को हल करने के लिए
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Mateos, J. M., Barmettler, G.,… More

Mateos, J. M., Barmettler, G., Doehner, J., Ojeda Naharros, I., Guhl, B., Neuhauss, S. C. F., Kaech, A., Bachmann-Gagescu, R., Ziegler, U. Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina. J. Vis. Exp. (129), e56113, doi:10.3791/56113 (2017).

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