Summary
Denne protokollen beskriver fremgangsmåten for å få subcellular protein lokalisering resultater på sebrafisk netthinnen av samkjøre super-oppløsning * lys og skanning elektronmikroskop bilder.
Abstract
Vi presenterer en metode for å undersøke den subcellular protein lokaliseringen i larver sebrafisk netthinnen ved å kombinere super-oppløsning * lys og skanning elektronmikroskop. Sub Diffraksjon grense oppløsning evnene av super-oppløsning lys mikroskop kan forbedre nøyaktigheten av samsvarende data. Kort, 110 nanometer tykk cryo-partiene er overført til en silicon wafer og, etter immunofluorescence flekker, er fotografert av super-oppløsning * lys. Deretter er delene bevart i methylcellulose og platina skygget før imaging i en scanning elektron mikroskop (SEM). Bilder fra disse to mikroskopi modaliteter enkelt slås sammen med vev landemerker med åpen kildekode. Her beskriver vi tilpasset metoden for larver sebrafisk netthinnen. Denne metoden er imidlertid også gjelder for andre typer vev og organismer. Vi viser at utfyllende informasjon ved denne sammenhengen er løse uttrykk for mitokondrie proteiner i forhold til membraner og cristae av mitokondrier så vel som andre avdelinger av cellen.
Introduction
Metoder for å bestemme den subcellular lokaliseringen av proteiner og deres forhold til forskjellige deler av cellen er viktige verktøy å forstå deres funksjonene og mulighetene for interaksjon. Super-oppløsning mikroskopi i kombinasjon med elektronmikroskop inneholder slik informasjon1. Bakken staten uttømming mikroskopi etterfulgt av personlige molekyl avkastning (GSDIM) er en super-oppløsning mikroskopi teknologi kompatibel med en rekke organiske og genetisk kodet fluorophores2 og oppnår en lateral oppløsning opptil 20 nm 3. inkorporering av metoder med høyere oppløsning enn standard Diffraksjon-begrenset mikroskopi forbedrer nøyaktigheten av korrelasjon4,5,6. For å oppnå best korrelasjon av protein uttrykk med et bestemt subcellular rom og redusere volumet av usikkerhet7 bruk av samme ultrathin inndeling for lys og elektronmikroskop anbefales. Blant de ulike snitting metodene, Tokuyasu cryo-delen protokollen krever ikke dehydrering eller harpiks innebygging og, i tillegg beholder antigenicity av mange epitoper og gir god vev ultrastructure8. Flere metoder har vist anvendelsen av disse delene i correlative lys og elektronmikroskop (CLEM)4,5,9,10.
Sebrafisk netthinnen er en verdifull modell visuell utvikling og menneskelig sykdom mekanismer gitt høyt konservert strukturen og funksjonen over virveldyr. I særdeleshet, netthinnen fotoreseptorer displayet samme arkitektur som pattedyr fotoreseptorer, med en basal synapse, en apico-basally langstrakt kjernen, klynger av mitokondrier i mer apikale indre segmentet og en ytre segmentet består av membran disker i mest apikale posisjon11. Protein lokaliseringen å mangfoldig mobilnettet seksjonene er bevart mellom sebrafisk og menneskelig, slik at etterforskningen av den biologiske menneskelig sykdom relevante proteiner12,13.
Her presenterer vi en protokoll for å forberede larver sebrafisk netthinnen prøver å løse lokaliseringen av mitokondrie ytre membran protein Tom20 ved correlative super-oppløsning lys og elektronmikroskop. Metoden er basert på å samle cryo-partiene på silisiumskiver, og hvordan kontrast topografiske opplysninger produsert etter et tynt lag av platinum. Disse trinnene er klart tekniske forbedringer inne pris av lette av bruk og reproduserbarhet tid eksperimenter. Vi har nylig demonstrerte anvendbarheten av metoden å oppdage kjernefysiske porene og mitokondrie proteiner i musen vev14.
Protocol
alle eksperimentene ble utført i samsvar med ARVO erklæringen for bruk av dyr i Ophthalmic og visjon forskning og ble godkjent av lokale myndigheter.
1. forberedelse av Ultrathin deler på silisiumskiver
- eksempel fiksering
- forberede etappe, den stabiliserende løsningen inneholder 0,1% glutaraldehyde, 4% formaldehyd inne 0.1 M cacodylate buffer.
Merk: Advarsel! Vær forsiktig når du arbeider med glutaraldehyde og formaldehyd cacodylate buffer, bruke riktig personlig verneutstyr og arbeide i avtrekksvifte. - Euthanize 5 dager legge befruktning (5 dpf) sebrafisk Larvene med tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, 0,4% w/v i PBS (fosfat buffer saltvann, pH 7)) som beskrevet tidligere 15.
- Fikse Larvene ved nedsenkning i pre kjølt etappe, den stabiliserende løsning på is. Fjern hodet og ruge over natten ved 4 ° C med milde rocking.
- Dissekere øynene ved å redusere vevet rundt øyet bruker fine tang og microdissection skalpell (under en kikkert) i kjølt etappe, den stabiliserende løsning på en 1% agarose-sengs plate. Overføre øynene til en rør med fersk pre kjølt bindemiddel.
- Vask to ganger i PBS (fosfat buffer saltvann, pH 7.4) i 5 min hver vask ved romtemperatur (RT).
- forberede etappe, den stabiliserende løsningen inneholder 0,1% glutaraldehyde, 4% formaldehyd inne 0.1 M cacodylate buffer.
- Gelatin infiltrasjon og montering
- varme opp 15 mL lokal mat merkevare gelatin 12% w/v i PB (fosfatbuffer, 0.1 M pH 7.4) på 40 ° C. Fjern PBS og tilsett gelatin løsning til rør med øynene. Trykk røret forsiktig for å sikre gelatin infiltrerer prøven og ruge i 10-30 min ved 40 ° C i en termoblokken med mild skjelvende eller i et vannbad.
- Fylle 12 mm x 5 x 3 mm silisium eller polyetylen flat innebygging former med varm gelatin i et 40 ° C vannbad. Legg to øyne per mold bruker en pipette, justere dem riktig under en kikkert bruker en disseksjon nål og la gelatin avkjølt ved romtemperatur for 1 min og stivne ved 4 ° C i 20 min.
- Re trim gelatin blokken under kikkerter til passer ett øye per blokk med et barberblad.
- Overføre gelatin innebygd øynene til 2,3 M sukrose i PB på is. Ruge på 4 ° C over natten.
- Exchange til nye 2,3 M sucrose løsning og butikk på 4 ° C eller 20 ° C, etter dette trinnet prøver er klar for skjæring eller kan lagres på 20 ° C i flere uker til måneder.
- Trim re gelatin blokken nesten størrelsen i øyet før du overfører til en cryo-pin. Fryse i flytende nitrogen og overføre til en cryo-ultramicrotome.
- Og kryosnitt
- kuttet 110 nm tykk-partiene ved-120 ° C med en diamant kniv i cryo-ultramicrotome.
- Plukke delene med en kablet loop som inneholder et slippverktøy 2% methylcellulose (i vann) og 2,3 M sucrose løsning (1:1). Overføre deler til en 7 x 7 mm silisium wafer. Lagre deler 4 ° C før videre behandling.
2. Immunolabelling
- vask wafere med PBS ved 0 ° C i 20 min på fire dråper ved å plassere wafere opp ned på dråpene. Vask i PBS 2 x 2 min ved romtemperatur.
- Ruge 3 ganger i 0,15% glysin i PBS, for 1 min. Vask 3 x for 1 min/vask med PBS. Pre incubate med PBG (PBS med 0,5% Bovine Serum Albumin BSA og 0,2% Gelatin type B) i 5 min.
- Incubate med kanin anti-Tom20 (se Tabell for materiale) i PBG (4 µg/mL) for 30 min ved romtemperatur.
- Vask 6 x 1 min/vaskes i PBG. Pre incubate med PBG i 5 min på rett Incubate med anti-kanin Alexa 647 F(ab') 2 (se Tabell for materiale) i PBG (7,5 µg/mL) for 30 min.
- Vask 6 x 1 min/vaskes i PBG. Vask 3 x 2 min i PBS. Inkuber med DAPI (4 µg/mL) i PBS for 10 s. vask 2 x 2 min i PBS.
3. Super-oppløsning mikroskopi
- Incubate kjeks kort (10 s) ved å plassere den på en dråpe av en 1:1 løsning glyserol (80%) og imaging bufferen som inneholder en oksygen scavenging system (200 mM fosfatbuffer inneholder 10% glukose, 0,5 mg/mL glucoseoxidase, 40 µg/mL catalase, 15 mM beta-mercaptoethylamine hydroklorid (MEA HCL), pH 8.0).
- Overføre wafere (inndelingen vender ned) til et glass bunn (tykkelse 170 ± 5 µm) Petri rett på en fersk dråpe 1:1 blanding av glyserol (80%) og tenkelig bufferen (som trinn 3.1).
- Fjerne fra alle sider, med en pipette, mesteparten av væsken under kjeks. Bruk silikon striper for å fastsette wafer til bunnen av Petriskål.
Merk: Silikon striper er laget av to-komponent silikon-lim (3 mm x 12 mm). - Bilde deler på en invertert mikroskop med en høy numeriske blenderåpning (f.eks 160 X / NA 1,43; se Tabellen for materiale) dedikert av oljeobjektiv på nedsenking av super-oppløsning. Før bildebehandling, La prøven equilibrate til mikroskopet temperatur for å minimere/redusere laterale og aksial drift.
- Senter området av interesse og hente første widefield epifluorescence referanse bilder. Endre til betjeningsmodus super-oppløsning. Justere eksponeringstiden for kameraet til 15 ms og sett elektronet multiplisere (EM) gevinst til maksimum av 300.
- Lyser prøve med 642 nm kontinuerlige bølgen laser ved maksimal laser makt (tilsvarende ~2.8 kW/cm 2) i epifluorescence-modus. Så snart enkelt molekylet blinker skilles godt i hver ramme, slik at sannsynligheten er lave at personlige signaler overlapper, sette laser makt ~0.7 kW/cm 2. Registrere rå bildet i epifluorescence-modus ved å kjøpe minst 30000 rammer.
Merk: Alle disse parametrene kan variere avhengig av forskjellige prøver og merking tettheter. - Fra rådata, generere en rekonstruksjon Hendelsesliste (steder av hver enkelt molekyl blink i rå bildet) bruker en gjenkjenning terskel for 30 fotoner (må justeres i henhold til utvalget) ved å klikke " evaluere " i den ' t-serien analyser ' under ' verktøy '.
- Visualisere super-oppløsning bildet av Gaussian passende 16 bruke en rendring pikselstørrelsen 4 nm ved " opprette Image " i de ' begivenhet listen behandling panel ' under ' Tools '
Merk: For å generere super løst bildet integrert programvareverktøy for systemet brukes i denne studien var ansatt. Men beskrevet super-oppløsning avbilding kan utføres på alle annet enkelt molekyl lokalisering basert system, og dataene kan behandles med åpen kildekode programvareverktøy som torden 17.
4. Platinum Shadowing
- fjerne silisium striper og legge en dråpe PBS nær kanten av kjeks løfte den opp fra Petriskål. Vask kjeks 2 x 2 min i PBS, så innlegget fikse det med 0,1% glutaraldehyde i PBS for 5 min. vask 2 x 2 min/vask i PBS.
- Ruge kjeks to ganger for 5 min/inkubasjon i 1 dråpe methylcellulose 2% i vann på is. Sett inn kjeks i en sentrifuge rør og sentrifuge 14,100 x g for 90 s. montere den på mangelfull SEM aluminium kjøre karbon sement.
- Legge et lag fra 2 til 10 nm platinum/karbon på prøven ved roterende skygge på 8° bruker et elektron strålen fordampning Enhetsinnstillinger: 1,55 kV, 55 mA, 0,3 nm/s og en vinkel på 8°, rotasjon nivå 4.
5. Skanning elektronmikroskop
- bildedeler med en scanning elektron microscope 1,5 kV, 2 mm arbeider avstand og med et In objektiv videregående electron detektor.
6. Justering av lys og elektronmikroskop bilder
- Åpne begge typer bilder med Fiji 18 ved " fil | Åpne ". Justere lerretet ved å klikke " bilde | Justere | Lerretet " og bringe både bilder til en stabel ved " bilde | Stabler | Bilder å stable ". Lagre stabelen som tiff-filtypen.
- I Fiji, åpne en ny TrackEM2 19 grensesnitt ved å klikke " filen | nye | TrackEM2 (ny) ". Importere stabelen med både bilder ved å høyreklikke på vinduet og velge " Import stabel ".
- Juster lys mikroskopi bildet til elektronmikroskop bildet manuelt med landemerker ved hjelp av et høyreklikk på bildet og velger " Juster | Justere lag manuelt med landemerker ".
- Plukke Velg verktøy (den svarte pilen) legge til landemerker. Bruke figuren av kjerner som referanse for å velge samme kantene i både bilder (supplerende figur 1). Legge til flere punkter (minimum tre poeng må velges). Bruk justering med en vridning modell av høyre mus klikke og velge " transformering | Vridning modell ".
- Endre lag (se utfyllende figur 1) å vurdere kvaliteten på justeringen.
Representative Results
Uttrykket av protein Tom20, en undergruppe av translocase mitokondrie ytre membran komplekse20, var bestemt, i tynne snitt av larver sebrafisk netthinnen av super-oppløsning * lys (figur 1) og denne informasjonen var supplert med topografiske signalet ved skanning elektronmikroskop etter platina skygging av de samme delene. Disse correlative data bekrefte lokalisering av et protein i forbindelse med et bestemt rom, ytre mitokondrie membranen og i tillegg gi informasjon om forholdet mellom protein andre organeller i cellen.
Figur 1: CLEM på sebrafisk netthinnen. A. lav forstørrelse widefield bilde av en 5 dpf sebrafisk retinal del, kjerner med DAPI (cyan). B. skanning elektronmikroskop av det samme området. C. høyere forstørrelse widefield bilde av ramme i B. kjerner farget med DAPI (cyan) og Tom20 mitokondrie flekker vises i rødt. D. Widefield bilde av samme delen på høyere forstørrelse. Mønsteret av Tom20 uttrykk er i klynger av mitokondrier. E. uttrykk av Tom20 (røde prikker) oppdaget av GSDIM mikroskopi. Kjerner farget med DAPI (cyan). F. samme delen e kombinere correlative super-oppløsning og skanning elektronmikroskop. Tom20 flekker (røde prikker) vises mitokondrie klyngen (M) på ytre membraner av mitokondrier. Fluorescens DAPI signalet i kjerner (N) tilsvarer topografien SEM bildet. G. forstørring bilde av ramme i F. Skanning elektronmikroskop bildet gir kontekst GSDIM bildet (røde prikker). Den Tom20 flekker er lokalisert til ytre membraner av mitokondrier mitokondrie cristae er synlig. Membraner av ytre segmentet fotoreseptorer (OS) er tydelig løst. Bilde piksel størrelse 5 nm. Skalere barer: A, B og C: 10 µm; D: 2 µm; E og F: 1 µm og G: 0,2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: justering av lys og elektronmikroskop bilder. A. skjermbilde fra TrackEM2 grensesnitt med SEM bilde og nummererte landemerker (gul) langs forskjellige kjerner. B. skjermbilde fra TrackEM2 grensesnitt med fluorescens bilde og nummererte landemerker (gul) langs forskjellige DAPI farget kjerner. Endre lag skyvekontrollene på venstre øvre del av menyen kan brukes. Skala bar: 1 µm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Denne metoden kombinerer super løst protein lokalisering med kontekstinformasjon å bestemme den nøyaktige plasseringen av proteiner i en organelle. Her viser vi ferdigstillelse av å visualisere uttrykk for Tom20 i den ytre membranen av mitokondrier og plasseringen i forhold til andre organeller som kjerner eller ytre deler av photoreceptor i larver sebrafisk netthinnen.
Tokuyasu cryo-skjæring krever litt trening å erverve velbevarte deler. Dette er imidlertid en metode ansatt i mange laboratorier med suksess vist21. Overføring av deler til silisium kjeks er meget enkel og ingen spesielle hensyn er nødvendig. Bruk glyserol i tenkelig bufferen er et svært viktig skritt å unngå tørking av delene. For super-oppløsning bildebehandling oppnås de beste resultatene når kjeks er svært nær glass nederst Petriskål. Silikon stripene hjelpe opprettholde kjeks i denne posisjonen. Særskilt omsorg må tas under fjerning stripene for å unngå skade delene.
Tykkelsen av cryo-deler, rundt 100 nm, tynnere enn den optiske oppløsningen i Z-dimensjonen, forenkler i tillegg nøyaktigheten av denne correlative metoden super-oppløsning mikroskopi signalet kommer bare fra dette tynt lag og Scanning elektron mikroskop signal viser topografien prøven. Denne metoden kan også kombineres med flerfarget bildebehandling. Forsiktighet må imidlertid tas at prøven kan avbildes under samme forhold (f.eks tenkelig buffer) og kryss-snakk skulle være forhindret.
En begrensning av metoden er to dimensjonal tilnærming, siden bare et begrenset antall serielle deler (ca 3 til 7 per wafer) kan samles. Dermed være prosjektoppgaver volum analyse ikke ideelt. Det er imidlertid en metode som kan brukes til å oppdage protein uttrykk i alle typer vev av enkel skjæring i prøven. Vi gir en metode uten bruk av klassisk kontrast agenter som uranyl acetate eller bly citrate. Kontrasten av platina skygge gir meget informativ topografiske kontrast, men i noen tilfeller membraner er vanskelig å løse. Dette kan utgjøre problemer for prosjekter som trenger, for eksempel å bestemme uttrykk for proteiner i små blemmer.
Våre protokollen, basert på Tokuyasu cryo-seksjoner, bruker standard utstyr for å få correlative resultater fra super-oppløsning og scanning elektron mikroskop. Innsamling av deler på silisiumskiver og bruk av platinum for kontrast er enkle trinn for å gi stabilitet og reproduserbarhet til eksempel utarbeidelse.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
ION og RGB: Swiss National Science Foundation Ambizione SCORE gir PZ00P3 142404/1 og PZ00P3 163979.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | #158127 | |
| Glutaraldehyde EM Grade | EMS, USA | #16220 | |
| Cacodylate | Merck | #8.20670 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | #886-86-2 | |
| Agarose, peqGOLD Universal | VWR International GmbH | 35-1020 | |
| Flat embedding molds | BEEM Flat | ||
| Local food brand gelatin | Dr.Oetker | Extra Gold | |
| Sucrose | Merck | #1.07687 | |
| Methylcellulose | Sigma | #M-6385 | |
| Glycine | Sigma | #G-7126 | |
| Gelatin type B | Sigma | #G-6650 | |
| BSA | Applichem | #A6588.0050 | |
| Silicon wafer | Si-Mat Silicon Materials | Type: P/Boron; Orientation <111> ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm | |
| Cryo-pin | Baltic Preparation | #16701950 | |
| Wired loop "Perfect loop" | |||
| Silicone stripes | Picodent | Twinsil 22 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | #G8270 | |
| glucoseoxidase | Sigma-Aldrich | #G7141 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | #C40 | |
| beta-Mercaptoethylamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #M6500 | |
| anti-Tom20 | Santa Cruz Biotechnology | #sc - 11415 | |
| AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti rabbit IgG | Jackson Immuno-Research | #711-606-152 | |
| DAPI | ROCHE, Switzerland | #10236276001 | |
| Glycerol solution | Sigma-Aldrich | #49782 | |
| Glass bottom petri dish | Ibidi, Germany | u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158 | |
| SEM aluminium stub | Agar Scientific | #G301F | |
| Conducting carbon cement Leit-C | Plano, Germany | AG3300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Diamond Knife (Cryo Immuno) | Diatome | DCIMM3520 | |
| Cryo-ultramicrotome | Leica Microsystems | Leica EM FCS | |
| Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D | Leica Microsystems | ||
| 160x 1.43 TIRF objective | Leica Microsystems | 11523048 | |
| SEM - Zeiss Supra 50 VP | Zeiss | Supra 50 VP | |
| FIB-SEM - Zeiss Auriga 40 | Zeiss | Auriga 40 |
References
- Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities. Chem Rev. , (2017).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Fölling, J., Bossi, M., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Betzig, E., Patterson, G. H., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy. PLOS one. 8 (10), e77209 (2013).
- Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Narayan, K., Subramaniam, S.
- Tokuyasu, K. T.
- Suleiman, H., Zhang, L., et al. Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane. eLife. 2, e01149 (2013).
- Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes. Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).
- Avanesov, A., Malicki, J.
- Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking. Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).
- Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking. PLOS Gen. 11 (10), e1005575 (2015).
- Mateos, J. M., Guhl, B., et al. Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy. Sci Rep. 6, 34062 (2016).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., Saalfeld, S., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS one. 7 (6), e38011 (2012).
- Wurm, C. A., Neumann, D., et al. Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient. Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).
