Summary
Mest almindelige gut indhold analyser af macroinvertebrates er visuel. Der kræver intens viden om morfologiske diversitet af organismer, byttedyr, de savner bløde trehjulet bytte og, på grund af stærk comminution af byttedyr, er næsten umuligt for visse organismer, herunder amfipoder. Vi leverer detaljerede, Roman genetiske metoder til macroinvertebrate bytte identifikation i kosten af amfipoder.
Abstract
Analysere mad webs er afgørende for en bedre forståelse af økosystemerne. For eksempel kan mad web interaktioner gennemgå alvorlige ændringer forårsaget af invasionen af fremmede arter. En nøjagtig identifikation af feltet rovdyr-byttedyr interaktioner er imidlertid vanskeligt i mange tilfælde. Disse analyser er ofte baseret på en visuel vurdering af gut indhold eller analyse af stabile isotop nøgletal (δ15N og δ13C). Sådanne metoder kræver omfattende viden omkring, henholdsvis, morfologiske forskellighed eller isotopiske signatur fra individuelle bytte organismer, fører til hindringer i den nøjagtige identifikation af bytte organismer. Visuelle gut indhold analyser undervurdere især bløde trehjulet bytte organismer, fordi maceration, indtagelse og fordøjelse af bytte organismer gør identifikation af specifikke arter vanskeligt. Dermed, polymerase kædereaktion (PCR) baseret strategier, for eksempel brugen af gruppespecifikke primer sæt, giver et stærkt værktøj til undersøgelse i food web interaktioner. Her, beskriver vi detaljerede protokoller for at undersøge gut indholdet af macroinvertebrate forbrugere fra feltet gruppe-specifikke primer sæt for nuklear ribosomale deoxyribonukleinsyre (rDNA). DNA kan være udvundet enten fra hele enheder (for lille taxa) eller tarm indholdet af prøver indsamlet i feltet. Tilstedeværelse og funktionelle effektivitet af DNA skabeloner skal bekræftes direkte fra den testede enkelte ved hjælp af universelle primer angiver målretning de respektive underenhed af DNA. Vi viser også, at forbruges bytte kan bestemmes yderligere ned til artsniveau via PCR med umodificerede gruppe-specifikke primere kombineret med efterfølgende enkelt streng kropsbygning polymorfi (SSCP) analyser ved hjælp af polyacrylamidgeler. Derudover viser vi, at anvendelsen af forskellige fluorescerende farvestoffer som etiketter muliggør parallel screening for DNA fragmenter af forskellige bytte grupper fra flere gut indhold prøver via automatiseret fragment analyse.
Introduction
Rovdyr-byttedyr interaktioner, der udgør flertallet af trofiske interaktioner og fødekæde dynamik, er centrale aspekter til at karakterisere strømme af stof og energi i hele fødevarer webs inden for og mellem økosystemer, som er et af de vigtigste mål for økologi 1. bestemmelse af kilden og strømmen af carbon og næringsstoffer fremme forståelsen af økologiske forbindelser mellem økosystemer2. Dog er økosystemer, som floder og deres afvandingsområder, ikke kun forbundet af strømme af organisk stof og næringsstoffer, men også af flytninger af organismer3. Således kan habitat ændringer afbryde strømmen af ressourcer, som forbinder disse systemer kraftigt ændre mad spind af begge økosystemer, ikke kun direkte, men også indirekte ved at ændre de respektive sammensætning af rovdyr-byttedyr Fællesskaber. For eksempel, har ændringer af mad webs vist sig at være knyttet til bevægelser af enkelt rovdyr arter (fx, regnbueørred)4. Sådanne ændringer truer potentielt biodiversiteten og funktion af akvatiske økosystemer. Derfor er analysere rovdyr-byttedyr interaktioner i feltet afgørende for at bestemme virkningen af menneskeskabte miljøforandringer såsom vand ledelsespraksis, på den indfødte biodiversitet af akvatiske økosystemer.
Da tracking trofiske forbindelser er vanskeligt i komplekse systemer, har flere tilgange fastslået at muliggøre vurdering af fodring interaktioner i felt5. Traditionelt, undersøgelser af fodring interaktioner i feltet er baseret på visuelle identifikation af bytte forbliver i dissekeret indvolde og kræver en omfattende viden om morfologiske bytte mangfoldighed. Visuelle gut indhold analyser har givet indsigt i ressourceudnyttelsen af flere grupper af forbrugere (f.eks. sæsonvariation i kost af hummer6 og fisk7,8 eller fodring præferencer af vandlopper). Dog den fysiske processen med fordøjelsen vanskeliggør visuelle gut indhold analyser og normalt misser bløde trehjulet bytte-organismer9. For arter fodring af flydende indtagelse eller visse hvirvelløse forbrugere, der intensivt comminute deres mad før indtagelse, ligesom amfipoder, er visuelle identifikation af byttedyr i tarm indholdet umuligt10. På grund af disse begrænsninger giver Molekylær analyse en lovende alternativ.
Molekylære analyser er nu blevet en fælles værktøj giver mulighed for hurtig og præcis bytte påvisning i tarm indholdet. Rækken af sådanne teknikker er mangfoldige: strategier baseret på monoklonale antistoffer eller polymerase kædereaktion (PCR) anvendes ofte, på grund af deres høje specificitet og sensitivitet11. Udvikling af nye monoklonale antistoffer er tid - og omkostningskrævende, derfor anvendelsen af andre molekylære teknikker er mere nyttigt når antistoffer ikke allerede findes11. En anden fælles tilgang er forstærkningen af regioner af deoxyribonukleinsyre (DNA), ligesom ribosomale ribonukleinsyre (RNA) gener til stede i de fleste arter, ved hjælp af universelle primer sætter12,13. Når du bruger denne teknik, er det ofte ikke muligt at identificere en lang række bytte organismer inden for blandet kilder af DNA14. En effektiv metode til at undgå sådan en ulempe er, at bruge gruppe-specifikke primer sætter for genetiske gut indhold analyser. Designet til at forstærke kun DNA regioner af bestemte målgrupper og udelukke alle andre arter15,16, aktiverer gruppe-specifikke primere identifikation af bytte organismer på den taksonomiske niveau af de angivne grupper uden tid - og omkostningskrævende sekundære analyser. Men ligesom alle gut indholdsanalyse, sådanne analyser giver kun et øjebliksbillede af fodring adfærd. Derfor anses kombinerer molekylære gut indhold analyser med analyser af tid-integrere naturlige sporstoffer (fx stabile isotoper) gavnlige1,2.
Her beskriver vi en detaljeret metode til PCR-baserede undersøgelser af rovdyr-byttedyr interaktioner ved hjælp af gruppespecifikke primer sæt for nuklear ribosomale DNA (rDNA) regioner skal kombineres med stabil isotop analyser af det samme prøvemateriale. Vi beskriver påvisning af enkelt bytte grupper via Agarosen gelelektroforese DNA. Derudover præsenterer vi en mulighed for videre downstream analyse af PCR produkter af sådanne gruppe-specifikke primere gældende, når en højere taksonomiske opløsning end primere specificitet er påkrævet. Fordi enkelt strandede DNA (ssDNA) fragmenter form tertiære konformationer, der bestemmes af deres primære sekvens17, medføre små variationer i fragmenter forstærkes af sådanne gruppe-specifikke primere konformationelle ændringer. Sådanne ændringer kan påvises ved enkelt streng kropsbygning polymorfi (SSCP) analyser med polyacrylamidgeler17,18, muliggør en mere præcis identifikation af bytte organismer (ned til artsniveau).
Mens Agarosen gelelektroforese er en fælles og billig værktøj til at visualisere DNA fragmenter og bestemme deres omtrentlige længde19, løsningen afhænger af mængden af DNA og farvning farvestoffet anvendes20. Normalt, visualisering er ligetil når du arbejder med ren DNA-prøver, men potentielt lave mængder af byttedyr DNA i tarm indholdet af forbrugerne kan komplicere scoring af Agarosen gel elektroforese resultater. Stadig, denne metode til påvisning er muligt at screene et lavt antal forbruger prøver fra feltet for en eller et par bytte grupper, men komplikation i den scoring gør screening af et stort antal prøver for flere bytte taxa meget tid intensiv og dermed upraktisk. En mere følsom metode til påvisning er en automatiseret analyse af fragmenter via kapillar elektroforese, som Derudover giver mulighed for bestemmelse af den nøjagtige længde af fragmenter21. Flere microsatellite baseret undersøgelser har vist, at det ved hjælp af forskellige fluorescerende farvestoffer som etiketter, er muligt at påvise og bestemme forskellige fragmenter af tilsvarende længde af automatiserede fragment analyse22,23, 24. Derfor, vi også fremlægge en detaljeret protokol for parallelle påvisning af DNA fra flere bytte grupper ved hjælp af PCR med mærket gruppespecifikke primer sæt og registrering via automatiseret fragment analyse med en automatiseret sequencer. Derudover præsenterer vi resultaterne fra et casestudie viser, at påvisning af bytte DNA via automatiseret fragment analyse er en tilgang, som også giver en relativ kvantificering af indtagne bytte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. indsamle Macroinvertebrates fra marken og forberede prøverne for genetiske Gut indhold analyser.
- Indsamle macroinvertebrates på hver lokalitet, sortere ud individer af consumer art af interesse i enkelt rør, og direkte fryse dem i flydende nitrogen eller tøris til at forhindre gut clearance og nedbrydning af DNA.
Bemærk: Undgå at gemme prøver i alkohol, fordi nogle macroinvertebrates har tendens til at gylpe før alkohol dræber dem. - Kun bruge mave-og tarmkanal af mellemstore og store (ca > 3 mm) macroinvertebrate arter for genetiske gut indhold analyser så de resterende spørgsmål om modellen kan bruges til andre procedurer (fx, stabile isotop analyse). Bemærk, at dette ikke er gældende, når undersøge meget lille taxa som vand mider. Derfor skridt 1.2.1 og 1.2.2 kan hoppet.
- Afrimning lidt individ og dissekere omhyggeligt sin mave-og tarmkanal under et stereomikroskop ved hjælp af fine rustfrit stål pincet. Sørg for ikke at punktere mave-og tarmkanal for at undgå tab af sagen.
- Ren pincet med dekontaminering løsning for at fjerne DNA og RNA forureninger efter tilberedning af hver mave-tarmkanalen. Derfor, Ruger pincet i 10 min i dekontaminering løsning. Bagefter, skyl dem med sterilt vand for at fjerne resterende spor og tør dem med en fnugfri køkkenrulle.
- Overførsel dissekeret mave-tarmkanalen til en 2,0 mL sikker-lock reaktion rør indeholdende 440 µL (450 µL muligt for brug af gentagne pipette) salt udvinding buffer [SEB; 0,4 M natriumchlorid (NaCl), 10 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethane 2 mM ethylendiamintetra syre dinatriumsalt og hydrochlorid (Tris-HCl) pH 8.0 dehydrere (EDTA) pH 8,0]. Butik forberedt prøver på − 20 ° C umiddelbart før udvinding af DNA. Sikre, at DNA vil være uddraget inden for et par dage.
- Bruge en modificeret høj-salt udvinding protokol 25 til at udtrække DNA.
- Tage prøver ud af fryseren. Bruge pincet til at tilføje en 5 mm rustfrit stål perle for hvert prøveglas, og tjenestefrihed bænk ved stuetemperatur (RT) til at optø frosne prøver. Brug en perle mølle til at homogenisere prøver i 1 minut ved 15 Hz.
- Spin ned prøver med en kort sigt af en centrifuge. Brug microliter pipetter til at tilføje 90 µL (100 µL mulighed for anvendelse af repetitive pipette) 10% sodium dodecyl sulfat løsning (SDS) og 5 µL af 10 mg/mL proteinase K.
- Vortex prøver grundigt og inkuberes blandinger i 1 timer ved 60 ° C med konstant ryster på 400 rpm på en thermomixer. Derudover grundigt vortex prøver hver 10 min for at fremme yderligere lysering.
- Spin ned prøver med en kort køre i en centrifuge, tilføje 350 µL af 5 M NaCl med en microliter pipette og vortex grundigt for ca 0.5 - 1 min. Centrifuge prøver til 40 min. 16.200 x g på 5 ° C.
Bemærk: Hvis flere sæt i træk har at blive gennemstegt, temperaturindstilling i centrifugen skal hæves lidt (ikke højere end 10 ° C), fordi SDS tendens til at flocculate hvis temperaturen er for lav. - Brug microliter pipetter til at overføre ca 600 µL supernatanten ind i en ny 1,5 mL reaktion rør. Vær omhyggelig med ikke at fjerne noget fra toerstoffet.
- Spids rustfrit stål perler ud af reaktion rør ind i en rustfri tesi, rense dem med rindende vand og inkuberes dem i en petriskål med dekontaminering løsning for 10 min. Skyl grundigt af dekontaminering løsning med sterilt vand og gemme renset perler i ethanol (> 99%, p.a. grade) eller tørt indtil genbrug.
NOTE: Rengøring af perler behøver ikke at ske i dette trin direkte, men snarere kan gøres når der er ventetid i de følgende trin. - Tilføje 600 µL af iskold isopropanol (PA grade) til supernatanten med en microliter afpipetteres og vend omhyggeligt røret et par gange. Opbevare prøver overnatning på -20 ° C.
- Tage prøver ud af fryseren og centrifugeres dem i 20 min. ved 16.200 × g og stuetemperatur. Omhyggeligt supernatanten og tørre rør omhyggeligt med fnugfri silkepapir. Bemærk, at hvis den omgivende temperatur er høj (mere end 25 ° C), centrifugeres ved 5 ° C til undgå pellets glider mens kassere supernatanten.
- Vask pellets indeholder DNA med 70% ethanol. Det gør du tilføje 200 µL af iskold ethanol (70%, p.a. grade) ved hjælp af en microliter pipette og centrifugeres prøver i 10 min på 16.200 x g og stuetemperatur (eller 5 ° C, hvis nødvendigt). Omhyggeligt supernatanten og tørre rør omhyggeligt med fnugfri silkepapir. Brug en 10 µL pipette justeret til ca 8 µL til omhyggeligt afpipetteres off de resterende supernatanten. Sørg for ikke at forstyrre pelleten.
- Tørre pellet for ca 5-20 min. ved 60 ° C eller ved stuetemperatur på bænken, indtil alle ethanol er fordampet.
- Opløses pellet i 50-100 µL nukleasen-gratis (damp steriliseret og DEPC behandlet) vand (ddH 2 O), vente mindst 1 h (selvom vil opnås bedre resultater natten over ved 4 ° C).
- Måle mængden af DNA indeholdt i hver enkelt prøve med en mikro-volumen Spektrofotometer, ifølge producenten ' s instruktioner. Gøre en arbejdsfortynding af hver prøve, der indeholder ca 2-10 ng DNA / µL. holde stamopløsningen i fryseren. Holde brugsopløsning i køleskabet og sikre, at yderligere prøve behandlingen er færdig snart.
2. Kontrollere funktionelle effektivitet af DNA-uddrag til efterfølgende påvisning af nyligt indtaget bytte.
- At sikre tilstedeværelse og funktionelle effektivitet af skabeloner, test hver DNA ekstrakt (trin 1.1 til 1.3.11) ved hjælp af universelle primer indstiller velegnet til de respektive fødekilde (fx hvirvelløse dyr 16 , 26) der rettet mod den samme nukleare subunit som gruppe-specifikke primer, bruges til efterfølgende påvisning af bytte 25 , 27. Følgende trin henviser til brugen af universal primer sæt NSF1419/20 og NSR1642/16 16 og LSU D1, D2 fw1 og LSU D1, D2 rev2 eller LSU D1, D2 rev4 26. For at bevise at PCR reaktion har været vellykket, og at ingen forurening fandt sted, bruge en positiv kontrol som indeholder DNA, der havde allerede været forstærket med succes og én kontrolprøve indeholdende ddH 2 O i stedet for DNA inden for hver PCR køre.
- At forberede primer arbejder løsninger, der indeholder en slutkoncentration 10 µM primer, afpipetteres den passende mængde af de respektive primer stock løsning og Hedeselskabet 2 O (afhængigt af koncentrationen af stamopløsningen) ind i en frisk 1,5 mL reaktion tube bruger Mikropipetter.
- Tilføje primere, deoxynucleotide mix (dNTP'er), reaktion buffer, Taq DNA polymerase og Hedeselskabet 2 O i en 1,5 eller 2,0 mL (afhængigt af antallet af prøver, der skal behandles) reaktion tube, så vortex denne blanding. Detaljerede diskenheder for standard reaktionsblandingen til en 10 µL PCR reaktion er givet i tabel 1 (for detaljer af kemikalier, der anvendes, se Tabel of Materials).
- Brug microliter pipetter til at overføre hver 1 µL DNA uddrag i 9 µL af the standard reaktionsblandingen inden for en PCR rør (eller et godt af en PCR-plade). Luk reaktion tube eller reaktion wells af pladen (med hætte striber).
- Program for thermocycler: standard-protokol til NSF1419/20 og NSR1642/16 16 primer sættet er: 94 ° C i 4 min (denaturering), efterfulgt af 30 cyklusser af 94 ° C til 30 s, 50 ° C (udglødning temperatur) for 30 s, 72 ° C til 90 s og endelige udvidelse ved 72 ° C i 10 min. For LSU primer sæt 26, skal du bruge følgende: 94 ° C i 4 min, efterfulgt af 45 cyklusser af 94 ° C til 20 s, 52,5 ° C i 20 s, 72 ° C til 90 s, og en sidste udvidelse ved 72 ° C i 8 min.
- Sted PCR rør eller plader i thermocycler, lukke låget på cycler, og starte programmet respektive.
- Forbered en 1,5% Agarosen gel ved hjælp af en bufferopløsning indeholdende Tris base, borsyre og EDTA (TBE buffer) og agarosegelelektroforese. Til forberedelse af en 1,5%-agarosegel, ved hjælp af en gel støbning bakke med overordnede dimensioner af 10 cm × 7,5 cm × 3 cm, afveje 0,45 g Agarosen i en konisk kolbe, skal du bruge et måleglas for at måle 30 mL af 1 x TBE buffer (89 mM Tris pH 7,6, 89 mM borsyre og 2 mM EDTA, pH 8,0) og hæld det i den koniske kolbe. Opvarm blandingen ved hjælp af en mikrobølgeovn. Stoppe mikrobølgeovnen, når der er store luftbobler og omhyggeligt swirl kolben indtil løsningen har kun én fase.
- Til at køle ned løsning til ca 60 ° C, swirl kolben i et vandbad. Hurtigt hæld opløsningen i en gel støbning magasin, fjerne luftbobler, og Indsæt kamme. Vent ca. 20 min. indtil gel er hærdede.
- Fyld elektroforese enhed med 0,5 x TBE og Indsæt gel støbning bakke indeholdende agarosegel. Sørg for, at gel slots er fri for luftbobler.
- Spin ned PCR produkter ved hjælp af korte køre mulighed for en mini (plade) centrifuge. Bruge en microliter pipette til mix hver 3 µL PCR produkt med 1 µL af 6 x lastning farvestof (40% saccharose og 0,25% bromophenol blå) og indlæse den i gel slots af agarosegel. Afpipetteres 1,5 µL af en 100 bp DNA ladder én plads i hver linje med en microliter pipette som størrelse standard. Erstatte låget af elektroforese enhed korrekt og tilsluttes en strømforsyning kundeemner. Kør gelen på 100 V/cm til 35 min.
- Til at forberede en farvning bad, hæld 1.000 mL af 1 x TBE i en firkantet plastik kasse, uigennemtrængelig for lys. Tilsæt 50 µL af ethidiumbromid med en microliter pipette, lukke låget på den plastik kasse og ryst den for at sikre ligelig fordeling af ethidiumbromid.
- Fjerne gel fra elektroforese enhed og placere det i farvning badet i ca 10 min. Derefter tag gelen ud af farvning badet og placere det på en gel dokumentationssystem og visualisere det ifølge manualen.
- Analysere kun prøver, som viste positive resultater (fragmenter af passende størrelse visuelle i agarosegel) med hensyn til tilstedeværelse og funktionelle effektivitet af skabeloner til efterfølgende påvisning af nyligt indtaget bytte.
| PCR-Mix | koncentration brugsopløsning | Mix for 10 µl PCR reaktion | endelige koncentration i PCR |
| Primer FW | 10 µM | 0,5 μl | 0,5 µM |
| Primer RW | 10 µM | 0,5 & #956 ; l | 0,5 µM |
| reaktion buffer (20 mM 16 mM (NH4) 2SO4 og 2 mM MgCl2 endelige koncentrationer Tris-HCl, pH 8,55,) | 1 µM | 1 μl | 1 µM |
| dNTP | 10 mM | < t d > 0,25 μl0,25 mM | |
| Taq-polymerase | 5 U | 0,1 μl | 0,05 U |
| ddH 2 0 | 6,65 μl | ||
| < strø NG > samlede beløb reaktionsblandingen | 9 μl | ||
| DNA | 1 μl | ||
Tabel 1: detaljeret protokol for forberedelse af standard reaktionsblandingen til en 10 µL PCR reaktion.
3. opdage seneste indtaget bytte/fødevarer med gruppe-specifikke Primer sæt ved hjælp af gelelektroforese.
- Udføre PCR ved hjælp af brugsopløsning DNA ekstrakter (tilberedt efter trin 1.1 til 1.3.11) og den gruppe-specifikke primer sæt (umærkede, dvs. uden ændring) passende for gruppen bytte rettet som beskrevet i trin 2.1.1 og 2.1.3 (for variationer i reaktionsblandingen for det respektive primer sæt, se tabel 2). Køre PCR ved hjælp af standard-protokol i trin 2.1.4 (for udglødning temperaturer for det respektive primer sæt, se tabel 2).
- Bruger en kontrol med ren DNA fra prøvemateriale tilhører de respektive målgruppe (positiv kontrol) og en negativ kontrol med ren DNA fra forbrugeren arter i hver PCR køre.
- Kontrollere succes af PCR reaktion ved hjælp af Agarosen gelelektroforese beskrevet i trin 2.1.6 til 2.1.11. PCR reaktionen var vellykket, hvis et fragment af passende længde (Se tabel 2) er synlige for den positive kontrol, men ikke for den negative kontrol. Hvis en eller begge af disse kriterier er opfyldt, Gentag PCR.
- Brug Agarosen gel elektroforese, som beskrevet i trin 2.1.6 til 2.1.11, for at opdage om gruppen bytte målrettet havde forbrugt af de forskellige forbrugeren enheder testet (via dom om fragment af passende længde er synlige eller ikke). Sørg for ikke at gå glip af fragmenter med lav visuelle opløsning.
- Butik PCR produkter ved 4 ° C, hvis yderligere analyser vil ske inden for de næste 24 timer eller ved-20 ° C hvis analyser skal udføres senere.
4. Efterfølgende bestemme forbrugt bytte længere nedstrøms ved hjælp af SSCP analyse via Polyacrylamiden.
- Forberede SSCP elektroforese en 9% acrylamid gel. Forberede arbejde løsninger i et laboratorium hood.
- Til at forberede en 200 mL acrylamid brugsopløsning, udfylde et måleglas med 20 mL af 10 x TBE (109 g af Tris base, 55 g borsyre og 40 mL 0,50 M EDTA, pH 8,0 opløses i 1000 mL af Hedeselskabet 2 O) og en anden med 45 mL 40% (29: 1) acrylamid mix. Hæld TBE og acrylamid mix i en målekolbe (en gradueret glasflaske med en 200 mL mark er også relevant her) og tilføje ddH 2 O op til 200 mL maerket. Holde arbejde løsning i køleskab (4 ° C), indtil det skal bruges. Brug ikke ældre end én uge brugsopløsning.
- Afvejes 0,1 g af ammonium persulfat (APS, brug en balance med mindst 0,01 g nøjagtighed) i en 1 mL målekolbe og opløses det ved at tilføje ddH 2 O op til graduering markere for at forberede en 10% APS stamopløsning. Overføre delprøver (ca 350 µL) til frisk reaktion rør.
Bemærk: En delprøve er nødvendig for hver polyacrylamid gel. Gemme de resterende aliquOTS på-20 ° C og kun afrimning delprøver kort før de nødvendige. - Samle en gel kassette kompromitteret af to glasplader, en tom og en hakket glasplade (hver 20 cm x 20 cm), med afstandsstykker (1,5 mm tykt) mellem dem kører op ad siderne af glasset. Bruge hver tre fold-back klip (32 mm) på højre og venstre side til at fiksere gel kassette ( figur 1).
- Mix 5 g Agarosen og 250 mL af 1 x TBE buffer i en konisk kolbe på at forberede en 2% Agarosen løsning gel. Varme og bagefter køle ned blanding som beskrevet i trin 2.1.6 og 2.1.7. Hurtigt hæld opløsningen i en firkantet plastboks (21 cm x 6,5 cm x 5 cm) og placere den nedre ende af gel kassette (trin 4.1.3) til Agarosen løsning. Justere fold-back klip på den nederste ende af gel kassette til en højde, så de sidder på kanten af den firkantet plastik kasse ( figur 1). Vent ca. 20-30 min. indtil Agarosen plug er helt hærdet.
- Fylde et 100 mL måling cylinder med acrylamid brugsopløsning (trin 4.1.1) indtil 60 mL mark og hæld løsning i et bægerglas. Bruge en mikropipette tilsættes 300 µL af en alikvot af APS stamopløsningen (trin 4.1.2) og derefter tilføje 37,5 µL af tetramethylethylenediamine (TEMED). Hurtigt, hæld løsning mellem glasplader af gel kassette. Alternativt, injicere løsning mellem glasplader med en 100 mL engangs sprøjte med en 1.000 µL pipette tip justeret til injektion hovedet af sprøjten.
- Omhyggeligt indsætte en 1,5 mm tyk standard kam i den øvre ende mellem glasplader. Kammen skal være omgivet af polyacrylamid løsning. Vent ca. 1 h, indtil Polyacrylamiden er polymeriserede. Undgå ventilation under polymerisation så vidt muligt, fordi det øger den nødvendige tid til gel til at polymerisere.
Bemærk: Det er muligt at gemme støbt geler i forseglede plasticposer med et vådt væv i køleskabet op til 3 dage.
figur 1: billede illustrerer den byggeri til at hælde polyacrylamidgeler. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- placere gel kassette, der indeholder Polyacrylamiden forberedt, ind i en lodret elektroforese enhed. Fyld elektroforese enhed med det tilsvarende beløb (afhængigt af elektroforese enhed) i 0,5 x TBE og cool enhed ned til 10 ° C ved hjælp af en nedkølet cirkulationspumpe.
- For DNA denaturering, Forvarm en termisk-blok /-cycler til 96 ° C. Forbered denaturering buffer med 95% formamid (99,5% p.a. grade) og 5% vandig opløsning indeholdende 0,25% bromophenol blå og 40% (w/v) saccharose.
- Tage PCR produkter ud af køleskabet eller fryseren og afrimning dem. Spin ned PCR produkter ved hjælp af korte køre mulighed for en mini (plade) centrifuge. Derefter blandes hver 4 µL af en PCR produkt med 4 µL af denaturering buffer. Varme blandinger i 5 min. ved 96 ° C umiddelbart efterfulgt af en afkøling trin i isvand i 10 min.
Bemærk: Prøverne skal indlæses på polyacrylamid gel (trin 4.5) umiddelbart efter denne. - Fjern kammen fra polyacrylamid gel (trin 4.1.6) og bruge en mikropipette helt indlæse hver prøve i en gel slot. Køre elektroforese på 8 W pr. gel, mens konstant køling elektroforese enhed til 10 ° C. kører tid nødvendige afhænger af størrelsen af fragment kan adskilles. For fragment størrelser af ca 210 bp, en køretid på ca 3,5 h er hensigtsmæssigt.
- Til at forberede en farvning bad, hæld 1.000 mL af 1 x TBE i en firkantet plast kasse uigennemtrængelig for lys og tilføje 30 µL af farvning farvestof (egnet til pletten enkelt strandede DNA) med en microliter pipette. Luk låget af den plastik kasse og ryst den for at sikre ligelig fordeling af farvning farvestoffet.
- Fjerner gel kassette fra elektroforese kammer og adskille forsigtigt indskåret glasplade fra gel. Skub Polyacrylamiden fra tomme glasplade ind i farvning badet. Placer farvning badet på en rystende platform og pletten gel for 20-30 min. under konstant omrystning.
- Tage gel forsigtigt ud af farvning badet og placere den på UV bordet i et dokumentationssystem.
Bemærk: På grund af ustabilitet i gelen er det tilrådeligt at håndtere det forudgående trin med to mennesker. En person bør holde det farvning bad ved siden af tabellen UV og en anden skal nå under gel med begge hænder, tage det ud, og skub det ind på tabellen UV. - Lukker låget eller dør af ordningen med dokumentation og tage et fotografi ifølge producenten ' s instruktionsbog.
5. Opdage flere seneste indtages bytte grupper parallelt ved hjælp af automatiserede Fragment analyser.
- Analyze gut indhold DNA ekstrakter ved hjælp af de 16 gruppespecifikke primer indstiller givet i tabel 2, med en primer af nogle mærkes på grund af ændring med en farvning farvestof (se tabel 2 kolonne titlen ændring), og bruge de parallelle detektionsmetoder af en automatiseret sequencer.
- Brug brugsopløsning DNA ekstrakter (tilberedt efter trin 1.1 til 1.3.11) og adfærd adskille PCR'er for hver primer fastsat som beskrevet i trin 2.1.1 til 2.1.5 (variationer i blandingen er givet i tabel 2). Brug mindst én kontrol med ren DNA fra prøvemateriale tilhører de respektive målgruppe (positiv kontrol) og en negativ kontrol med ren DNA fra forbrugeren arter i hver PCR køre.
- Køre PCR'er i thermocycler bruger standardprotokollen PCR givet taktfast 2.1.4, justeret til den respektive udgloedning temperatur (og antal cyklusser) for hver primer, der er angivet i tabel 2.
Bemærk: Brug den samme DNA tildeling af reaktion brønde til PCR med hver af de 16 forskellige primer sæt at forenkle efterfølgende pooling af PCR produkter for batch automatiseret fragment analyser. - Butik PCR produkter ved-20 ° C indtil alle PCR'er tilhører én batch for automatiseret fragment analyser (Se tabel 2) er færdig. Holde PCR produkter i mørke og ikke gemme dem længere end 1 uge før fragment analyser.
tabel 2: oplysninger om de 2 partier af 15 gruppespecifikke primer par etableret af Koester et al. (2013) og den nydesignede Jae28S primer par forstærke regioner af 18S eller 28S rDNA fra 16 målgrupper af akvatiske macroinvertebrates. f, fremad primere; Rasmussen, reverse primere; 18s, primer mål 18S rDNA subunit; 28s, primer mål 28S rDNA underenhed. " Hydrobiologia, er Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) en ' killer rejer ' i Rhinen system?, 768, 2016, tabel S1, supplerende materiale side 2, Koester Meike, Bayer Bastian, Gergs René, (© Springer International udgiver Schweiz 2015) " med tilladelse fra Springer. venligst klik her for at se en større version af denne tabel.
- til at opdage de forstærkede fragmenter af alle 16 primer sæt gennemføre automatiserede fragment analyser i 2 partier i tabel 2. Bruge en indre størrelse standard (DNA størrelse Standard Kit - 400 [Batch B] og -600 [Batch A], henholdsvis) at bestemme fragment længde. Forberede sekventering plade og automatisk sequencer, som beskrevet i følgende fremgangsmåde. Bemærk, at denne procedure skal muligvis justeres, hvis du bruger en anden platform end den, der gives i tabellen materialer.
- Til at køre hver batch-prøve, udarbejde en blanding indeholdende prøve lastning løsning (SLS) og de respektive størrelse standard. Der afpipetteres 21,6 µL af SLS og 0,4 µL DNA størrelse Standard kit - 600 pr. stikprøve af serie A og henholdsvis 21.7 µL af SLS og 0,3 µL DNA størrelse Standard kit- 400 pr. sample af Batch B.
- Tage PCR-produkter af de 8 PCR'er tilhører de respektive batch ud af fryseren og afrimning dem. Sikre, at de stadig holdes i mørke.
- Bruger en microliter pipette til at indlæse antallet af huller i en sekventering pladen nødvendig (antallet af prøver der skal analyseres) med hver 22 µL af de respektive blanding beskrevet taktfast 5.2.1. Spin ned PCR-produkter af hver af de 8 PCR'er ved hjælp af korte køre mulighed for en mini (plade) centrifuge. Overføre hver 1 µL pr. PCR produkt af hver af de 8 PCR'er i de respektive brønde af sekventering pladen med en microliter pipette.
- Omhyggeligt spin ned denne blanding i sekventering pladen med en kort sigt af en mini pladen centrifugeres og overlay hver af brønde anvendes med en dråbe af mineralsk olie. Fyld respektive reaktion wells af en buffer plade med 250-300 µL DNA adskillelse buffer.
- Bruge softwaren til kapillær sequencer til at oprette en eksempelopsætning ifølge producenten ' s instruktioner. Tildele metoder til at kontrollere prøven sæt og bestemme rækkefølgen af metoder til at blive brugt til at behandle data (Se tabel 3 for at køre betingelser tilstrækkelige til brug med den størrelse standard i Materialer tabel). Bemærk, at det er afgørende, at tildelingen af prøver inden for den eksempelopsætning matcher stikprøve fordelingen i sekventering plade (herunder positive og negative kontroller, se trin 5.1.1) og at den metode, der er passende for fragment analyserer med den respektive Size standard er valgt.
- Udfylde en befugtning bakke med deioniseret vand og indsætte sekventering plade, buffer plade og befugtning bakke i den kapillære sequencer. Indsæt en gel patron, der indeholder en tilstrækkelig mængde af frisk DNA adskillelse gel, der er nødvendig for prøven køres. Køre sekventering pladen ved hjælp af den forberedte eksempelopsætning.
| denaturere | Adskil | Kapillær | sprøjt | ||||
| Temperatur | tid | spænding | tid | spænding | tid | ||
| størrelse standard 600 | 90 ° C | 120 s | 4.8 kV | 60 min. | 50 ° C vente på Temp: Ja | 2.0 kV | 30 s |
| størrelse standard 400 | 90 ° C | 120 s | 6 kV | 45 min | 50 ° C vente på Temp: Ja | 2.0 kV | 30 s |
tabel 3: specifikke betingelser for fragment analyser ved automatiseret sequenceren ved hjælp af de størrelse standarder i tabellen materialer.
- til at analysere resultaterne eksportere rå data og overføre disse data til et fragment analyse program. Vælg standard farvestof farve ordrer af den respektive producent at indstille farvestof farvekanaler.
- Opret et Panel skitserer den forventede række fragment længde forstærkes af den fælles gruppe-specifikke primer indstiller i en batch ifølge brugervejledningen til programmet.
- Til at behandle data, Vælg respektive Panel, passende størrelse standard, standard farve og type analyse og køre proceduren. Vælg indstillingen elektroferogrammet vise fluorescerende signal intensiteter fra kapillær elektroforese instrumenter som en enkelt linje spor for hver farvestof farve. Markører/primer sæt vises med angivelse af de respektive fragment rækkevidde og den nøjagtige længde af fundne fragment forbundet med midten af hver kaldet top vil blive fremhævet (i de fleste programmer efter farvning eller tildelt) automatisk.
- For hver prøve, beregne hvor tæt prøven ' s interne størrelse standard passer til den valgte størrelse standard for at berolige succes størrelse kald. De fleste fragment analyser programmer har en mulighed for at automatisk beregne og visualisere denne kamp. Hvis størrelse-kald mislykkedes, Gentag fragment analyser for disse prøver.
- Visuelt recheck elektroferogrammet af hver prøve og bekræfte/unconfirm hver top kaldes for hver markør/primer angivet separat. Manuelt indsætte malplaceret toppe, der passer til kriterierne for en markør/primer sæt eller slette forkerte dem ifølge brugsanvisningen på programmet bruges. Anvende basepar størrelse eller bin navn i den ' allel etiket '. Beregne og vise de højeste specifikationer i den ' Peak tabel '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har med held brugt trin, der beskrives i denne protokol for kost analyser inden for forskellige undersøgelser. I dette afsnit præsenterer vi eksempler der beskriver anvendelsen af de forskellige dele af protokollen.
Som et eksempel, for at demonstrere effektiviteten af gruppespecifikke primer sæt etableret af forfatterne28 og mulighederne for videre downstream analyse af PCR-produkter af SSCP analyser, blev en fodring eksperiment udført. Individer af Dikerogammarus villosus som rovdyr og Caenis spp. larver som bytte blev fanget i floden Rhinen og skodder nær Karlsruhe (Tyskland). I laboratoriet, rovdyr og byttedyr taxa var holdt separat i filtreret stream vand ved 20 ° C og blev sultet for 36 timer. For eksperimentet, var Tangloppen enheder placeret i bægre med filtreret stream vand (100 mL) individuelt, fodret med to til tre Caenis larver i 30 min, og efterfølgende fastfrosset i flydende kvælstof. Mave-tarmkanalen af hver D. villosus var dissekeret og DNA blev udtrukket som beskrevet i protokol 1. DNA ekstrakter blev testet med Caep28S primer indstille egnet til at påvise Caenis spp. ved hjælp af de relevante PCR-protokol28 , som beskrevet i protokol 3. Du kan kontrollere forskelle mellem forstærket fragmenter af forskellige arter, Caenis , blev PCR gennemført med gut indhold prøver og ren DNA prøver af tre Caenis reference arter. Agarosen gelelektroforese førte til enkelt bands af dobbelt strandede DNA, som ikke kan skelnes mellem de forskellige Caenis arter med denne type af elektroforese (figur 2A). Derimod ved SSCP gelelektroforese var som beskrevet i protokol 4, det muligt at identificere bytte organismer til artsniveau ved at sammenligne de gut indhold prøver med referenceprøver (figur 2B). SSCP fragment mønster af de tre reference taxa Caenis beskidensis (figur 2B, lane 1), Caenis horaria (figur 2B, lane 2), og Caenis luctuosa (figur 2B, lane 3) bestod af fire bands med differentiable mønstre. To gut indhold prøver (figur 2B, lane 4 og 5) havde en fragment mønster lig med C. luctuosa (figur 2B, lane 3). Fragment mønster af tredje gut indhold prøven (figur 2B, lane 6) var identisk med C. horaria (figur 2B, lane 2). Sekvens analyser af to gut indhold prøver identificeres som C. luctuosa og C. horaria (figur 2B, lane 4 og 6) og de respektive reference arter bekræftet dette resultat (Se electronical supplement justering fasta fil).
Figur 2: Oprindelige billede af (A) Agarosen gelelektroforese og (B) SSCP analyse af PCR fragmenter af gut indhold og referenceprøver forstærkes med Caep28S primer sæt. Baner 1-3 viser referenceprøver med arternes Caenis beskidensis (1), Caenis horaria (2) og Caenis luctuosa (3). I baner 4-6, fragment mønster af forskellige gut indhold prøver af Tangloppen Dikerogammarus villosus præsenteres. Lane 7 viser fragment mønstret af en 100 bp DNA ladder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Derudover blev en laboratorie eksperiment udført i vand mider tilhører arten Hygrobates fluviatilis blev fodret på chironomid larver ikke kun bestemme hvis DNA af chironomid individer forbruges kan påvises i vand mider, men også for at teste, hvis mængden af DNA fundet afhænger af den forløbne tid siden forbrug af bytte29. Efter sultende mider i ca en uge, blev hver mide tilbudt en chironomid larve som mad. Hver 3-4 vand mide enkeltpersoner blev fastsat i ethanol (absolutte) for genetisk analyse ved hjælp af Chiro18S primer sæt specifikke for de tovingede familie Chironomidae28 på 1, 2, 3, 7, 9, 24, 32 og 50 h efter fodres29. Som en grad af forbrug af vand mide enkeltpersoner, de respektive bytte personer blev klassificeret i følgende fem fodring kategorier: 1 = helt suget ud, integument helt tømt (> 90%), 2 = næsten helt suget ud (> 75-90%), 3 = semi suges ud (> 50-75%), 4 = kun delvist suget ud (> 5-50%), 5 = ingen synlige ændringer i den bytte krop struktur (≤5%)29. DNA blev udvundet fra vand mider, som beskrevet i protokol 1 (uden trin 1.2.1 og 1.2.2) og tilstedeværelsen af 18S rDNA i ekstraktet og funktionelle effektivitet af skabelonen blev bekræftet som beskrevet i protokol 2. Påvisning af bytte DNA blev udført i henhold til protokol 4 ved hjælp af kun Chiro18S primer med den fremadrettede primer mærket med et fluorescerende farvestof (Se tabel 2) og DNA størrelse Standard Kit - 400. At tillade sammenligninger mellem prøver analyseres inden for forskellige kørsler af en automatiseret sequencer, forholdet mellem prøve tophøjde og tophøjde af de nærmeste intern standard (dvs., 360 bp i dette tilfælde) af hver prøve blev beregnet og anvendes som en proxy for den DNA fundet. Resultaterne viste, at chironomid DNA var spores i næsten alle individer af Hygrobates fluviatilis fodret med chironomid larver29. Fra den korteste interval (1 time efter fodring) til den længste periode efter fodring (50 h) det relative antal fundne bytte DNA blev markant reduceret (figur 3A)29. Desuden bekræftet forholdet mellem tid efter fodring og bytte klassificering som en proxy for den indtagne mængde af bytte DNA kunne være (figur 3B)29. Reduktion af bytte DNA fundet med stigende gang efter fodring var sandsynligvis helt afspejlet ved nedbrydning af DNA og fordøjelse af bytte, fordi egestion af bytte DNA er meget usandsynlig på grund af manglende en anus i vand mider29. Disse resultater bekræfter egnetheden af denne metode til kvantificering af indtagne bytte.
Figur 3: Relationer mellem de nationale ln højdeforhold (prøve-peak heights/standard360 tophøjde) og (A) tid efter fodring af mider og (B) fodring kategori (n = 23). "Experimental og anvendes Acarologi, første påvisning af bytte DNA i Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): en ny metode til bestemmelse af rovdyr-byttedyr relationer i vand mider, 67, 376, s. Martin, M. Koester, L. Schynawa, R. Gergs, (© Springer International udgivelse Switzerlog 2015) "med tilladelse fra Springer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
For at undersøge betydningen af prædation af de invasive Tangloppen D. villosus i feltet, intensiv stabil isotop analyser af δ13C og δ15Nielsen D. villosus og potentielle mad ressourcer blev fremmet af molekylære påvisning af nyligt indtaget bytte inden for gut indholdet af de nøjagtige samme individer. I alt 206 D. villosus enkeltpersoner fra forskellige websteder blev indsamlet og mave-tarmkanalen af enkelte var dissekeret og DNA blev udvundet i henhold til protokol 1. Tilstedeværelse og funktionelle effektivitet af skabelonerne bruges var sikret som beskrevet i protokol 2. Seneste prædation af D. villosus enkeltpersoner på flere macroinvertebrate bytte taxa blev testet som beskrevet i protokol 4. Samlet set kun 16% af D. villosus gut indholdet testet positiv for DNA tilhører nogen af de 16 målrettede macroinvertebrate bytte taxa, og derfor understøttes de stabile isotop analyseresultater, der er angivet en lav predacious fodring adfærd af de invasive Tangloppen i feltet27. Mens inden for genetiske analyser, DNA af 12 testet bytte taxa blev fundet i mindst 1 gut indhold prøve, blev DNA af de 4 andre byttedyr taxa aldrig opdaget (figur 4)27.
Figur 4: Histogram illustrerer det respektive antal D. villosus enkeltpersoner fra alle ti steder hvis gut indhold testet positiv for macroinvertebrate bytte DNA. PCR blev udført med 16 gruppespecifikke primer sæt som angivet. "Hydrobiologia, er Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) en killer rejer i floden Rhinen system?, 768, 2016, 310, Koester Meike, Bayer Bastian, Gergs René, (© Springer International udgiver Schweiz 2015)" med tilladelse fra Springer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil. Sequence_alignement_feeding_trial.fasta venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en let og omkostningseffektiv metode til PCR-baserede bestemmelse af rovdyr-byttedyr interaktioner fra feltprøver via gruppe-specifikke primere for rDNA regioner, som kan kombineres med andre ikke-molekylære analyser af de samme enheder. Der er imidlertid adskillige kritiske trin i protokollen. For det første er forsikre specificiteten af primere bruges afgørende. For det andet er det afgørende at undgå kontaminering og tab af tarm indholdet materiale under udarbejdelse af mave-tarmkanalen og efterfølgende udvinding af DNA. Mens cross-prøve forurening kan føre til falsk positive påvisning af bytte DNA, forbruges tab af tarm indhold materiale kan føre til manglende sjældent byttedyr. Kontrol af tilstedeværelsen af rDNA tilhører de respektive subunit og funktionelle effektivitet af skabeloner anvendes til analyser (punkt 2 i protokollen) er afgørende for indsamling af repræsentative oplysninger om bytte forbruges. Dette er især vigtigt, hvis ingen DNA af bytte grupper forbrugeren formodes for at fodre kan være registreret25,27. Desuden, når du forbereder PCR'er (trin 3.1, 5.1.1 og 5.1.2) det er afgørende at blandingen og protokol, der bruges nøjagtig opfylder de kriterier, som de respektive primer blev angivet til en bestemt gruppe af taxa. Enten skal du forstærkning af DNA i PCR reaktionen kan mislykkes helt eller DNA af taxa ikke målrettet kan blive forstærket så godt. Derfor, det er obligatorisk at anvende positive og negative kontroller inden for hver PCR køre at forsikre om, at PCR reaktionen arbejdede og ingen kontaminering opstod. Derudover er det nødvendigt, at vifte af prøver for hver PCR køre er dokumenteret præcis for at aktivere den korrekte tildeling af bytte forbruges til den respektive forbruger model. Særlig forsigtighed skal tages mens pooling PCR produkter til parallel påvisning af flere bytte grupper via automatiseret fragment analyser (trin 5.2.3) for denne opgave.
Til påvisning af forstærkede fragmenter ved hjælp af Agarosen gel elektroforese (trin 3.2 og 3.3) Agarosen geler bør være så tynde som muligt og pleje skal tages under besigtigelse af billedet til at undgå manglende fragmenter med lav visuelle opløsning. For resultater og en passende konklusion om bytte forbrug af en forbruger er det afgørende, at selv sjældent forbrugt bytte taxa bliver anerkendt. Tyk agarosegelitris mindske synligheden af potentielt ringe mængder af byttedyr DNA og dermed mindske sandsynligheden for at gå glip af sjældent forbrugt bytte og indføre usikkerhedsfaktorer i konklusioner fra analysen. Desuden fra en sundhed perspektiv, ved hjælp af en mindre - eller ikke-giftigt alternativ end ethidiumbromid for farvning af geler ville være hensigtsmæssigt. Protokol for efterfølgende videre downstream analyse af forstærkede fragmenter via SSCP analyser ved hjælp af polyacrylamidgeler omfatter nogle skridt, der bør udføres med særlig forsigtighed. Det er vigtigt at gel kassette samlet er spildfri (trin 4.1.3) og polyacrylamid løsning gives tilstrækkelig tid til at polymerisere helt (trin 4.1.6). Åbne kassetten for tidligt vil føre til siver flydende acrylamid løsning og trods det faktum, at udarbejdelsen har at blive startet fra begyndelsen, omfattende oprydning skal gøres så godt. Derudover overfører Polyacrylamiden ind i farvning badet (trin 4.7) og derfra ind på UV tabel (trin 4.8) skal gøres meget omhyggeligt på grund af ustabilitet i sådanne geler. Ellers gel kan rive og fragmenter kan blive forstyrret, hvilket fører til behovet for at gentage denne procedure.
Et væsentligt krav til korrekt behandling af data modtaget fra automatiseret fragment analyser er at den prøve interne størrelse standard nøje svarer til den størrelse standard mønster angivet af fabrikanten (trin 5.3.3) til bestemmelse af den passende fragment længde. Dette er især afgørende, fordi ellers, forskellige fragmenter, mærket med den samme fluorescerende farvning farvestof, kan henføres til forkert bytte taxa og derfor føre til en fuldstændig fejlvurdering af rovdyr-byttedyr interaktioner. Derudover vise elektroferogrammer ofte baggrundsstøj. For at skabe tillid i fortolkningen, er det væsentligt, at toppene af den interne størrelse standard er betydeligt højere end baggrundsstøj af prøven. Toppe for hver markør/primer bør derfor kun medregnes, hvis de er væsentligt højere end baggrundsstøjen.
Denne protokol kan ændres til at registrere flere grupper af bytte taxa af interesse inden for forskellige forbrugere af interesse. Ganske vist kan gruppe-specifikke primere ikke allerede være tilgængelige for alle potentielle byttedyr taxon af interesse. Ikke desto mindre gruppe-specifikke primere er tilgængelige ikke kun for flere ferskvands macroinvertebrate taxa28, men også for en lang række andre taxa (f.eks. flere marine macroinvertebrate taxa16,30 og fælles taxa af flyvende insekter31). Dermed, udvælgelse af gruppespecifikke primer indstiller egnet til at forstærke DNA af alle byttedyr for en given taxon, men forgæves i forstærkning af DNA fra arter, der ikke tilhører dette taxon, er væsentlige32. Mange gruppe-specifikke primere, der findes nu er angivet for en given række taxa (fx, 130 taxa af ferskvand macroinvertebrates fælles i Rhinen system28). Derfor, for at undgå falsk negative eller falsk-positive resultater, sådan primere specificitet bør være gentages for rækken af taxa fælles i økosystemet i interesse forud for deres ansøgning om target taxa og forbrugerne ikke inkluderet i rækken af taxa til som primere var blevet etableret. Desuden, hvis disse molekylære analyser ikke skal kombineres med andre analyser af den nøjagtige samme individuelle, dissektion af mave-tarmkanalen kan hoppet.
Ikke desto mindre dissekere mavetarmkanalen hos større fisk også forhindrer fejl i DNA-ekstraktion på grund af for meget materiale, og reducerer forekomsten af forbruger-DNA i prøveekstraktet. Undersøgelser har dog vist, at ved hjælp af specifikke blokerende primere, som tillægger DNA af forbrugeren og dermed blokere det, for PCR reaktionen kan effektivt øge forstærkningen af sjældne sekvenser i blandet prøver33. Derfor kan dissektion af mave-tarmkanalen undgås, selv når der beskæftiger sig med større forbrugernes prøver, ved brug af specifikke blokerende primere. For parallelle påvisning af amplikoner stammer fra flere gruppe-specifikke primer sæt via automatiseret fragment analyser, bør det sikres i valget af farvning farvestof som etiket. Dermed bør primer sæt forstærke fragmenter af omtrent samme længde mærkes med tydeligt kan skelnes fluorescerende farvestoffer. Derudover er der en række kapillær elektroforese systemer tilgængelig hos flere producenter. Nogle af disse systemer kunne give angiveligt flere fragmenter selv via uspecifik farvestoffer. Protokollen præsenteres her kunne nemt justeres for at opdage forstærket fragmenter med nogen af disse systemer. Ud over at reducere den nødvendige tid til than analyserer, ville det være muligt at optimere enkelt multiplex-PCR assays for at forstærke DNA af bytte grupper af et fragment analyse batch samtidigt (f.eks samtidige forstærkning af 12 bytte organismer af biller34 eller op til seks flyvende insekt taxa31).
En potentiel ulempe af gut indhold analyser i almindelighed, og derfor også de analyser, der er beskrevet i denne protokol, er den lave tidsmæssige opløsning. Med sådanne metoder er det kun muligt at identificere seneste indtaget organismer, som kan føre til usikkerhed i betydningen af enkelt bytte organismer2. Men vi viste, at genetisk analyse efter denne protokol kan nemt kombineres med analyser af stabile isotoper (δ15N og δ13C) af den nøjagtige samme forbruger prøver25,27. Som en integration af tid naturlige tracer rovdyr-byttedyr interaktioner, stabile isotop analyser er ofte bruges til at karakterisere fødekæde strukturer1, men potentielle overlappende isotopiske værdier fra forskellige byttedyr hindrer ofte en nøjagtig definition af rovdyr-byttedyr interaktioner2. Derfor bruger denne protokol for genetiske analyser i kombination med stabil isotop analyser til at overvinde ulemperne ved hver metode kan yderligere vores forståelse af mad webs og deres forhold til næringsstoffer eller energi strømme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Silke Classen fra Research Institute for økosystemet analyse og vurdering (gaiac), RWTH Aachen for hendes hjælp i etablering af gruppe-specifikke primer sæt bruges i denne protokol. Vi takker også Peter Martin og Laura Schynawa fra universitetet i Kiel for samarbejde i vand mider eksperimenter. Vi takker også tekniske lab assistenter for at holde lab kørende og forberede register over virksomheder og katalog numre. Dette arbejde blev støttet af den tyske Forskningsfonds (DFG; projekt GE 2219/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
References
- Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
- Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool. Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones. Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies. Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer. Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).
- Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur. Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).
- Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef. J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).
- Akin, S., Winemiller, K. O. Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary. Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).
- Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster. Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).
- Gergs, R. Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer? Universität Konstanz. , (2009).
- Sheppard, S. K., Harwood, J. D. Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs. Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).
- Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns. Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).
- Verma, S. K., Singh, L. Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).
- Deagle, B. E., et al. Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).
- Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples. Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).
- Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica. Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).
- Hayashi, K., Yandell, D. W. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).
- Glavač, D., Dean, M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).
- Mülhardt, C. Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).
- Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , InTech. (2012).
- Wang, X. W., et al. A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles. Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).
- Gemmer, I., Gergs, R. Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda). Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).
- Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar). Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).
- Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes. Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).
- Koester, M., Gergs, R. No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland. Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).
- Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification. Front Zool. 4 (6), 6 (2007).
- Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system? Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).
- Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates. Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).
- Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites. Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).
- Deagle, B. E., et al. Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus). PLoS One. 2 (9), e831 (2007).
- Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey. PLoS One. 9 (12), e115501 (2014).
- Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances. Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).
- Vestheim, H., Jarman, S. Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs. Front Zool. 5 (1), 12 (2008).
- Harper, G. L., et al. Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets. Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).
