Summary
Meest voorkomende analyses van de inhoud van de darm van macroinvertebrates zijn visueel. Waarbij intensieve kennis over morfologische diversiteit van organismen van de prooi, ze missen zachte lijf prooi en, als gevolg van de sterke trimventilatoren van de prooi, zijn bijna onmogelijk voor sommige organismen, met inbegrip van vlokreeftjes. Wij bieden gedetailleerde, roman genetische methoden voor macroinvertebrate ten prooi identificatie in het dieet van vlokreeftjes.
Abstract
Analyseren van voedsel webs is essentieel voor een beter begrip van de ecosystemen. Bijvoorbeeld kunnen voedselweb interacties ondergaan grote veranderingen veroorzaakt door de invasie van uitheemse soorten. Een nauwkeurige identificatie van veld van predator en prooi interacties is echter moeilijk in veel gevallen. Deze analyses zijn vaak gebaseerd op een visuele beoordeling van de inhoud van de darm of de analyse van stabiele isotopenverhoudingen (δ15N en δ13C). Dergelijke methoden vereisen uitgebreide kennis over, respectievelijk, de diversiteit van de morfologische of isotopische handtekening van individuele prooi organismen, wat leidt tot hindernissen in de nauwkeurige identificatie van prooi organismen. Zachte lijf prooi organismen, onderschatten visuele gut inhoud analyses vooral omdat maceratie, opname en vertering van prooi organismen identificatie van specifieke soorten moeilijk maken. Vandaar, polymerase kettingreactie (PCR) gebaseerde strategieën, bijvoorbeeld het gebruik van een groepspecifiek primer ingesteld, bieden een krachtig hulpmiddel voor het onderzoek van voedselweb interacties. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen om te onderzoeken van de darm-inhoud van macroinvertebrate consumenten uit het veld met behulp van groepsspecifieke primer sets voor nucleaire ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA kan worden geëxtraheerd hetzij uit hele monsters (in het geval van kleine taxa) of uit de inhoud van de darm van specimens verzameld in het veld. Aanwezigheid en functionele efficiëntie van de DNA-sjablonen moeten worden bevestigd vanuit de geteste persoon met behulp van universele primer ingesteld gericht op de respectieve subeenheid van DNA. We laten ook zien dat verbruikte prooi kan worden bepaald verder tot op het niveau van soorten via PCR met ongewijzigde groepsspecifieke inleidingen gecombineerd met latere enkele streng conformatie polymorfisme (SSCP) analyses met behulp van polyacrylamide gels. Bovendien laten we zien dat het gebruik van verschillende fluorescente kleurstoffen als labels kan parallelle screening voor DNA-fragmenten van verschillende prooi groepen uit meerdere inhoud monsters van de darm via geautomatiseerde fragment analyse.
Introduction
Predator en prooi interacties, die de meerderheid van de trofische interacties en voedselweb dynamiek vormen, zijn belangrijke aspecten te karakteriseren de fluxen van materie en energie in de hele voedsel webs binnen en tussen de ecosystemen, die behoort tot de belangrijkste doelstellingen van ecologie 1. de bepaling van de bron en stroom van koolstof en voedingsstoffen is het bevorderen van het inzicht in ecologische verbinding tussen ecosystemen2. Echter, ecosystemen, zoals rivieren en hun stroomgebieden, zijn niet alleen gekoppeld door stromen van organisch materiaal en organische voedingsstoffen, maar ook door de bewegingen van organismen3. Dus, habitat wijzigingen onderbreking van de stroom van middelen die een link van deze systemen kunnen sterk veranderen de voedsel vliezen van beide ecosystemen, niet alleen rechtstreeks maar ook onrechtstreeks door het veranderen van de respectieve samenstelling van predator en prooi Gemeenschappen. Bijvoorbeeld, zijn wijzigingen van voedsel webs aangetoond moet worden gekoppeld aan de bewegingen van één predator soorten (bijvoorbeeld, regenboogforel)4. Dergelijke wijzigingen worden potentieel biodiversiteit en het functioneren van aquatische ecosystemen bedreigen. Daarom is analyseren van predator en prooi interacties in het veld essentieel voor het bepalen van de invloed van de mens veroorzaakte veranderingen in het milieu, zoals water managementpraktijken, op de inheemse biodiversiteit van aquatische ecosystemen.
Aangezien het bijhouden van trofische verbanden moeilijk in complexe systemen is, zijn verschillende benaderingen vastgesteld waarmee de beoordeling van het voederen van interacties in het veld5. Traditioneel, onderzoeken van het voederen van interacties in het veld zijn gebaseerd op visuele identificatie van prooi blijft in ontleed lef en vereist een uitgebreide kennis over morfologische prooi diversiteit. Visuele gut inhoud analyses hebben verstrekt inzicht in het gebruik van de hulpbronnen van verschillende groepen consumenten (bijvoorbeeld seizoensgebonden variatie in de voeding van kreeft6 en vis7,8 of voeding voorkeuren van roeipootkreeften). Echter het fysieke proces van spijsvertering visuele gut inhoud analyses bemoeilijkt en mist meestal zacht carrosserie prooi-organismen9. Voor soorten voeden door vloeibare inslikken of voor sommige ongewervelde consumenten die intensief Vermaal hun voedsel voor inslikken, zoals vlokreeftjes, is visuele identificatie van prooi soorten in de inhoud van de darm niet onmogelijk10. Vanwege deze beperkingen biedt moleculaire analyse een veelbelovend alternatief.
Moleculair analyses zijn geworden een gemeenschappelijk instrument waardoor de prooi van snelle en nauwkeurige detectie in de inhoud van de darm. Het bereik van dergelijke technieken is divers: strategieën op basis van monoclonal antilichamen of polymerase-kettingreactie (PCR) worden vaak gebruikt, vanwege hun hoge gevoeligheid en specificiteit11. De ontwikkeling van nieuwe monoclonal antilichamen is tijd - en kostenintensieve, daarom de toepassing van andere moleculaire technieken is nuttiger wanneer antilichamen11niet reeds bestaan. Een andere gemeenschappelijke benadering is de versterking van de regio's van deoxyribonucleic acid (DNA), zoals ribosomal RNA acid (RNA) genen aanwezig zijn in de meeste soorten, met behulp van universele primer ingesteld12,,13. Wanneer u deze techniek gebruikt, is het vaak niet mogelijk om te identificeren van het hele scala van prooi organismen in gemengde bronnen van DNA14. Een effectieve aanpak om te voorkomen dat de teruggave is groepsspecifieke primer gebruiken wordt ingesteld voor genetische gut inhoud analyses. Ontworpen om te versterken alleen DNA regio's van bijzondere doelgroepen en uitsluiten van alle andere soorten15,16, inschakelen groepsspecifieke inleidingen identificatie van prooi organismen op het taxonomische niveau van de opgegeven groepen zonder tijd - en kostenintensieve secundaire analyses. Zoals alle inhoudsanalyse gut, evenwel dergelijke analyses slechts een momentopname van het voederen van gedrag. Daarom, moleculaire gut inhoud analyses combineren met analyses van integratie van de tijd natuurlijke traceurs (bijvoorbeeld stabiele isotopen) wordt beschouwd als gunstig1,2.
Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor PCR-gebaseerde onderzoek van predator en prooi interacties met behulp van groepsspecifieke primer sets voor nucleaire ribosomal DNA (rDNA) regio's worden gecombineerd met stabiele isotoop analyses van het hetzelfde model. We beschrijven de opsporing van het DNA van één prooi groepen via agarose gelelektroforese. Daarnaast presenteren wij gelegenheid voor verder stroomafwaarts analyses van PCR producten van dergelijke groepsspecifieke inleidingen die van toepassing zijn wanneer een hogere taxonomische resolutie dan de inleidingen specificiteit vereist is. Omdat één gestrande DNA (ssDNA) tertiaire conformaties vorm die wordt bepaald door hun primaire reeks17 fragmenten, leiden kleine variaties in fragmenten versterkt door dergelijke groepsspecifieke inleidingen tot conformationele veranderingen. Dergelijke veranderingen kunnen worden gedetecteerd door enkele streng conformatie polymorfisme (SSCP) analyses met polyacrylamide gels17,18, waardoor een meer nauwkeurige identificatie van prooi organismen (tot op het niveau van de soorten).
Terwijl de Elektroforese van het gel van de agarose is een gemeenschappelijk en goedkope tool om DNA-fragmenten te visualiseren en bepalen hun lengte19, de resolutie is afhankelijk van de hoeveelheid DNA en de kleuring kleurstof gebruikt20. Meestal de visualisatie is ongecompliceerd bij het werken met zuivere DNA-monsters, maar potentieel lage bedragen van havikachtigen DNA in de inhoud van de darm van de consument kan bemoeilijken het scoren van agarose gel elektroforese resultaten. Nog, deze detectiemethode is haalbaar is om het scherm van een laag aantal consument exemplaren van het veld voor een of een paar prooi groepen, maar complicatie in het scoren maakt de screening van een groot aantal monsters voor meerdere prooi taxa tijd uiterst intensieve en dus onuitvoerbaar. Een meer gevoelige detectiemethode is de geautomatiseerde analyse van fragmenten via capillaire elektroforese, waarmee bovendien de bepaling van de exacte lengte van fragmenten21. Verschillende microsatelliet gebaseerd studies hebben aangetoond dat met behulp van verschillende fluorescente kleurstoffen als labels, het mogelijk is om te ontdekken en bepalen verschillende fragmenten van vergelijkbare lengte door geautomatiseerde fragment analyse22,23, 24. Daarom ook presenteren we een gedetailleerd protocol voor parallelle opsporing van DNA van meerdere prooi groepen met behulp van PCR met gelabelde groepsspecifieke primer sets en detectie via geautomatiseerde fragment analyse met een geautomatiseerde sequencer. Daarnaast presenteren wij de resultaten van een case studie waaruit blijkt dat de detectie van prooi DNA via geautomatiseerde fragment analyse een aanpak waarmee ook een relatieve kwantificering van geconsumeerde prooi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. verzamelen van Macroinvertebrates uit het veld en voorbereiding van de monsters voor genetische Gut inhoud Analyses.
- Collect macroinvertebrates op elke site, uitzoeken van personen van belang in één buizen soorten consument en bevriezen ze rechtstreeks in vloeibare stikstof of droog ijs gut opruiming en afbraak van DNA te voorkomen.
Opmerking: Vermijd monsters opslaan in alcohol, omdat sommige macroinvertebrates neiging om uitbraken voordat de alcohol hen doodt. - Alleen gebruik maken van het maag-darmkanaal van middelgrote en grote (ongeveer > 3 mm) macroinvertebrate soorten voor genetische gut inhoud analyses zodat de resterende kwestie van het model kan worden gebruikt voor andere procedures (b.v., stabiele isotoop analyse). Merk op dat dit is niet van toepassing bij het onderzoeken van zeer kleine taxa zoals water mijten. Daarom stappen 1.2.1 en 1.2.2 kunnen worden overgeslagen.
- Licht het ontdooien van een individu en zorgvuldig ontleden de gastro-intestinale tractus onder een stereomicroscoop met fijne RVS pincet. Zorg ervoor dat u niet aanprikken van het maag-darmkanaal Voorkom verlies van materie.
- Schone pincet met decontaminatie oplossing te verwijderen van DNA en RNA verontreinigingen na de voorbereiding van elke maag-darmkanaal. Daarom, incubeer pincet voor 10 min in de decontaminatie-oplossing. Spoel ze daarna af met steriel water te verwijderen van de restsporen en veeg ze met een pluisvrije papieren handdoek.
- Overdracht de ontleed gastro-intestinale tractus reageren safe-lock 2,0 mL tube met 440 µL (450 µL mogelijk voor gebruik van repetitieve pipet) zout winning buffer [SEB; 0,4 M natriumchloride (NaCl), 10 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethane Waterstofchloride (Tris-HCl) pH 8.0, en 2 mM ethyleendiamminetetra zuur Dinatrium zout uitdrogen (EDTA) pH 8,0]. Winkel bereid de monsters op − 20 ° C onmiddellijk tot de extractie van DNA. Zorgen dat DNA binnen een paar dagen zal worden geëxtraheerd.
- Uitpakken van DNA met behulp van een gemodificeerde high-zout winning protocol 25.
- Te nemen monsters uit de vriezer. Pincet gebruiken één 5 mm roestvrij staal parel toevoegen aan elke monsterbuisje, en laat bevroren monsters op de Bank bij kamertemperatuur (RT) te ontdooien. Gebruik een kraal molen te homogeniseren monsters voor 1 min bij 15 Hz.
- Spin down monsters met een korte termijn van een centrifuge. Microliter pipetten gebruiken om toe te voegen 90 µL (mogelijk voor gebruik van repetitieve Pipetteer 100 µL) 10% natrium dodecyl sulfaat oplossing (SDS) en 5 µL van 10 mg/mL proteïnase K.
- Vortex monsters grondig en incubeer mengsels gedurende 1 uur bij 60 ° C met constante schudden bij 400 t/min op een thermomixer. Bovendien grondig vortex monsters elke 10 min ter verdere bevordering van lysis.
- Spin down monsters met een korte termijn van een centrifuge, Voeg 350 µL van 5 M NaCl met een microliter pipet en vortex grondig voor ongeveer 0.5 - 1 min. Centrifuge-monsters voor 40 min bij 16,200 x g bij 5 ° C.
Opmerking: Als meerdere sets in een rij worden gedaan moeten, de instelling van de temperatuur van de centrifuge moet worden iets verhoogd (niet hoger dan 10 ° C) omdat SDS neiging om te flocculate als de temperatuur te laag is. - Gebruik microliter pipettes ongeveer 600 µL supernatant overbrengen naar een nieuwe reactiebuis van 1,5 mL. Wees voorzichtig niet om om het even wat van de pellet.
- Tip RVS kralen uit de reactie buizen in een theezeef van roestvrij staal, maak ze schoon met stromend water en broeden ze in een petrischaal met de decontaminatie-oplossing voor 10 min. grondig afspoelen van de decontaminatie-oplossing met steriele water en slaan schoongemaakte kralen in ethanol (> 99%, p.a. rang) of droge tot hergebruik.
Opmerking: Reiniging van kralen hoeft niet te worden gedaan in deze stap direct, maar eerder kan worden gedaan wanneer er wachttijd in de volgende stappen. - Toevoegen 600 µL van ijskoude isopropanol (p.a. grade) naar de bovendrijvende substantie met een microliter Pipetteer en zorgvuldig het omkeren van de buis een paar keer. Opslaan van monsters 's nachts bij -20 ° C.
- Monsters te nemen uit de vriezer en centrifugeer ze gedurende 20 min 16,200 × g en bij kamer temperatuur. Zorgvuldig Verwijder het supernatant en de buis zorgvuldig met papieren zakdoekje pluisvrije droge. Merk op dat als de omringende temperatuur is hoog (meer dan 25 ° C), centrifugeer bij 5 ° C om te voorkomen dat de pellets uitglijden tijdens het teruggooien het supernatant.
- -Wash pellets met DNA met 70% ethanol. Om dit te doen, voeg 200 µL van ijskoude ethanol (70%, p.a. rang) met behulp van een pipet microliter en centrifuge monsters gedurende 10 minuten bij 16,200 x g en kamertemperatuur (of 5 ° C, indien nodig). Zorgvuldig Verwijder het supernatant en de buis zorgvuldig met papieren zakdoekje pluisvrije droge. Gebruik een 10 µL pipet aangepast aan ongeveer 8 µL aan zorgvuldig uit het resterende supernatant Pipetteer. Zorg ervoor dat niet te verstoren de pellet.
- Droog de pellet gedurende ongeveer 5-20 minuten bij 60 ° C of bij kamertemperatuur bij de bank totdat alle de ethanol wordt ingedampt.
- Los pellet in 50-100 µL nuclease-gratis (stoom gesteriliseerd en DEPC behandeld) water (ddH 2 van O), wacht ten minste 1 h (hoewel betere resultaten zal 's nachts worden verkregen bij 4 ° C).
- Meten de hoeveelheid DNA die zijn opgenomen in elk monster met een micro-volume spectrofotometer, volgens de fabrikant ' s instructies. Maak een werkverdunning van elk monster met ongeveer 2-10 ng DNA / µL. Houd de stockoplossing in de vriezer. De werkoplossing in de koelkast bewaren en ervoor te zorgen dat verdere monster verwerking gebeurt binnenkort.
2. Controleren van functionele efficiëntie van DNA-fragmenten voor latere detectie van onlangs ingenomen havikachtigen.
- Om de aanwezigheid en functionele efficiëntie van sjablonen, testen elke DNA-extract (stappen 1.1 tot en met 1.3.11) met behulp van universele primer ingesteld geschikt voor de respectieve voedselbron (bijvoorbeeld ongewervelden 16 , 26) die zijn gericht op de dezelfde nucleaire subeenheid als de groepsspecifieke primer, gebruikt voor latere detectie van prooi 25 , 27. De volgende stappen verwijzen naar het gebruik van universele primer sets NSF1419/20 en NSR1642/16 16 en LSU D1, D2 fw1 en LSU D1, D2 rev2 of LSU D1, D2 rev4 26. Om te bewijzen dat de PCR reactie succesvol is geweest en dat geen besmetting zich heeft voorgedaan, een positieve controle met DNA dat al met succes had zijn versterkt en één controlemonster met ddH 2 O in plaats van DNA binnen elke PCR uitvoeren gebruiken.
- Te bereiden primer werkoplossing die bevatten een eindconcentratie van 10 µM van de primer, de juiste hoeveelheid van de respectieve primer stock oplossing en ddH 2 O (afhankelijk van de concentratie van de stockoplossing) Pipetteer in een verse 1,5 mL reactiebuis met micropipetten.
- Toevoegen inleidingen, deoxynucleotide mix (dNTPs), reactie buffer, DNA van Taq polymerase en ddH 2 O in een 1.5 of 2.0 mL (afhankelijk van het aantal monsters dat moet worden verwerkt) reactiebuis, dan vortex dit mengsel. Gedetailleerde volumes voor de standaard reactiemengsel voor een 10 µL PCR reactie worden gegeven in tabel 1 (Zie voor de details van de chemicaliën die worden gebruikt, Tabel of Materials).
- Gebruik microliter pipetten overdracht van elk 1 µL van DNA halen in 9 µL van the standaard reactiemengsel binnen een PCR-buis (of een putje van een PCR-plaat). Sluit de reactiebuis of de reactie putjes van de plaat (met GLB strepen).
- Program de thermocycler: het standaardprotocol voor de NSF1419/20 en NSR1642/16 16 primer set is: 94 ° C gedurende 4 min (denaturatie), gevolgd door 30 cycli van 94 ° C voor 30 s, 50 ° C (onthardende temperatuur) voor 30 s, 72 ° C gedurende 90 s, en laatste uitbreiding bij 72 ° C gedurende 10 minuten. Voor de LSU primer ingesteld 26, gebruikt u het volgende: 94 ° C gedurende 4 minuten, gevolgd door 45 cycles van 94 ° C voor 20 s, 52.5 ° C gedurende 20 s, 72 ° C gedurende 90 s, en de uiteindelijke extensie bij 72 ° C gedurende 8 min.
- Plaats PCR buizen of platen in de thermocycler, sluit het deksel van de fietser, en start het respectieve programma.
- Voorbereiden een 1,5% agarose gel met behulp van een bufferoplossing met Tris base, boorzuur en EDTA (TBE buffer) en agarose. Voor voorbereiding van een 1,5% agarose gel, een gel gieten lade met totale afmetingen van 10 × 7,5 cm × 3 cm, weeg 0,45 g agarose in een erlenmeyer, gebruik een maatcylinder te meten van 30 mL van de 1 x TBE buffer (89 mM Tris pH 7,6, boorzuur 89 mM en 2 mM EDTA, pH 8,0) en giet het in de erlenmeyer. Verwarm het mengsel met behulp van een magnetron. De magnetron stoppen wanneer er grote luchtbellen en de kolf zorgvuldig swirl totdat de oplossing slechts één fase is.
- Oplossing tot ongeveer 60 ° C, afkoelen swirl de kolf in een waterbad. Snel giet de oplossing in een gel gieten lade, verwijderen van luchtbellen en invoegen van kammen. Gel is gehard ongeveer 20 min wachten.
- Vulling elektroforese eenheid met 0,5 x FSME en invoegen gel gieten lade bevattende van het agarose gel. Zorg ervoor dat de gel "slots" vrij van luchtbellen zijn.
- Spin down de PCR-producten met behulp van de korte run optie van een centrifuge mini (plaat). Gebruik een pipet microliter te mengen elke 3 µL van het PCR-product met 1 µL van 6 x laden kleurstof (40% sucrose en 0,25% bromophenol blauw) en laadt u deze in de gel "slots" van de agarose gel. Pipetteer 1.5 µL van een 100 bp DNA-ladder in een sleuf van elke regel met een pipet microliter als standaard formaat. Vervangen van de klep van de eenheid van de elektroforese correct en sluit leidt aan een voeding. Stel de gel 100 V/cm voor 35 min.
- Ter voorbereiding van een kleuring bad, pour 1000 mL voor 1 x TBE in een vierkant-vormige plastic doos ondoordringbaar zijn voor licht. Voeg 50 µL van ethidiumbromide met een pipet microliter, sluit het deksel van de plastic doos en schudden zodat de gelijke verdeling van de ethidiumbromide.
- Verwijderen van de gel van de Elektroforese van eenheid en leg deze in de kleuring bad gedurende ongeveer 10 minuten. Vervolgens nemen de gel uit het kleuring bad en plaats deze op een gel documentatiesysteem en visualiseren het volgens de handleiding.
- Analyseren van enige monsters die positieve resultaten (fragmenten van voldoende grootte visuele in agarose gel) in termen van aanwezigheid en functionele efficiëntie van sjablonen voor latere detectie van onlangs ingenomen havikachtigen toonde.
| PCR-Mix | concentratie werkoplossing | Mix voor 10 µl PCR reactie | eindconcentratie in PCR |
| Primer FW | 10 µM | 0,5 μl | 0,5 µM |
| Primer RW | 10 µM | 0,5 & #956 ; l | 0,5 µM |
| reactie buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.55, 16 mM (NH4) 2SO4 en 2 mM MgCl2 eindconcentraties) | 1 µM | 1 μl | 1 µM |
| dNTP | 10 mM | < t d > 0,25 μl0,25 mM | |
| polymerase Taq | 5 U | 0,1 μl | 0.05 U |
| ddH 2 0 | 6.65 μl | ||
| < stro ng > Total bedrag reactiemengsel | 9 μl | ||
| DNA | 1 μl | ||
Tabel 1: gedetailleerd protocol voor de bereiding van de standaard reactiemengsel voor een 10 µL PCR reactie.
3. onlangs ingenomen prooi/voedselpunten met groepsspecifieke Primer Sets met behulp van de Elektroforese van het Gel detecteren.
- PCR uitvoeren met behulp van die de werkoplossing voor DNA extracten (bereid volgens stappen 1.1 tot en met 1.3.11) en de groepsspecifieke primer set (labelloze, dat wil zeggen, zonder enige wijziging) geschikt is voor de groep van de prooi gericht zoals beschreven in 2.1.1 naar 2.1.3 stappen (voor variaties in het reactiemengsel voor de respectieve primer set, zie tabel 2). Uitvoeren van PCR met behulp van het standaardprotocol gegeven in stap 2.1.4 (voor temperaturen voor de respectieve primer set gloeien, zie tabel 2).
- Één besturingselement gebruiken met zuivere DNA uit een specimen behorend tot de respectievelijke doelgroep (positieve controle) en één negatieve controle met zuivere DNA van de soorten van de consument in elke PCR uitvoeren.
- Het succes van de PCR-reactie met behulp van agarose gelelektroforese beschreven in stappen 2.1.6 aan 2.1.11 controleren. De PCR-reactie was succesvol zijn als een fragment van de juiste lengte (Zie tabel 2) zichtbaar is voor de positieve controle maar niet voor de negatieve controle. Als een of beide van deze criteria onvervulde zijn, herhaal PCR.
- Gebruik agarose gel elektroforese, zoals beschreven in stappen 2.1.6 aan 2.1.11, om te detecteren of de prooi groep gericht had zijn verbruikt door de specimens van de verschillende consument getest (via arrest van of het fragment van de juiste lengte of niet zichtbaar is). Zorg ervoor dat niet te missen fragmenten met een lage resolutie van de visuele.
- Winkel PCR producten bij 4 ° C, als verdere analyses zal gebeuren binnen de volgende 24 uur of bij-20 ° C als analyses kunnen worden uitgevoerd later.
4. Vervolgens bepalen verbruikte prooi verder stroomafwaarts via SSCP analyse via polyacrylamidegel.
- Een 9% acrylamide gel voorbereiden op SSCP elektroforese. Voorbereiden van de werkoplossing in een laboratorium kap.
- Om te bereiden een 200 mL acrylamide werkoplossing, vul een maatcylinder met 20 mL 10 x TBE (109 g voor Tris base, 55 g boorzuur en 40 mL 0,50 M EDTA, pH 8,0 opgelost in 1000 mL van ddH 2 O) en een andere met 45 mL van 40% (29:1) acrylamide mix. Giet FSME en acrylamide mix in een maatkolf (een gegradueerde glazen fles met een 200 mL-mark is ook hier aangewezen) en voeg ddH 2 O tot het mark van 200 mL. Blijven werken oplossing in de koelkast (4 ° C) totdat het nodig is. Gebruik geen werkoplossing die ouder zijn dan één week.
- Weeg 0,1 g van ammoniumnitraat persulfate (APS; gebruik een balans met een nauwkeurigheid van ten minste 0,01 g) in een maatkolf van 1 mL en los het door toevoeging van ddH 2 O tot het afstuderen markeren voor te bereiden op een APS-stockoplossing van 10%. Pipetteer aliquots (ongeveer 350 µL) in verse reactie buizen.
Opmerking: Één aliquot is nodig voor elke polyacrylamide-gel. Opslaan van de resterende aliquOts bij-20 ° C en alleen ontdooi aliquots kort voordat ze nodig zijn. - Assemble een gel cassette uit twee glazen platen, één blanco en een ingekeepte glasplaat (elk 20 cm x 20 cm), met spacers (1.5 mm dik) tussen hen gecompromitteerd aangelopen aan de zijden van het glas. Gebruik van elke drie fold-rug-clips (32 mm) aan de rechter en linker kant te fixeren gel cassette ( Figuur 1).
- Mix 5 g van agarose en 250 mL voor 1 x TBE buffer in een erlenmeyer oplossing om voor te bereiden een 2% agarose gel. Verhit en daarna zoals beschreven in stappen 2.1.6 en 2.1.7 mengsel afkoelen. Snel giet de oplossing in een kunststof doos met vierkant-vormige (21 x 6,5 cm x 5 cm) en de onderkant van de gel cassette (stap 4.1.3) plaats in de agarose oplossing. De clips van de vouw-rug aan de onderkant van de gel-cassette tot een hoogte zodanig aanpassen dat ze op de rand van de vierkant-vormige plastic doos ( Figuur 1 zitten). Ongeveer 20-30 min wachten totdat de agarose plug is volledig gehard.
- Vul een 100 mL cilinder met de werkoplossing acrylamide (stap 4.1.1) tot het mark 60 mL en giet de oplossing in een bekerglas. Gebruik een micropipet 300 µL van een aliquoot deel van de APS-stockoplossing (stap 4.1.2) toevoegen en vervolgens Voeg 37,5 µL van tetramethylethylenediamine (TEMED). Snel, giet de oplossing tussen de glasplaten van de gel-cassette. U kunt ook de oplossing tussen de glazen platen met een disposable spuit van 100 mL met een 1.000 µL pipette uiteinde aangepast aan het hoofd van de injectie van de spuit te injecteren.
- Steek voorzichtig een 1,5 mm dikke standaard kam aan de bovenkant tussen de glasplaten. De kam moet worden omgeven door de polyacrylamide-oplossing. Wacht ongeveer 1 h tot het polyacrylamidegel is polymeervorm. Ventilatie tijdens de polymerisatie zoveel mogelijk vermijden, want het verhoogt de tijd die nodig is voor de gel te polymeriseren.
Opmerking: Het is mogelijk om op te slaan van gegoten gels in verzegelde plastic zakken met vochtige tissues in de koelkast tot tot 3 dagen.
Figuur 1: afbeelding ter illustratie van de bouw pour polyacrylamide gels. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- plaats de gel cassette, met het polyacrylamidegel bereid, in een verticale elektroforese eenheid. Vul de elektroforese eenheid met de juiste hoeveelheid (afhankelijk van het soort elektroforese eenheid) 0,5 x FSME en cool de eenheid tot 10 ° C met behulp van een gekoelde rondpompthemostaat.
- Voor denaturatie van de DNA, Verwarm een thermische-blok /-cycler tot 96 ° C. voorbereiden denaturatie buffer met 95% formamide (99,5% p.a. grade) en 5% waterige oplossing bevattende 0,25% bromophenol blauw en 40% (m/v) sacharose.
- Nemen de PCR producten uit de koelkast of de vriezer en ontdooi ze. Spin down de PCR-producten met behulp van de korte run optie van een centrifuge mini (plaat). Meng vervolgens elke 4 µL van het PCR-product met 4 µL van denaturatie buffer. Verwarm mengsels gedurende 5 minuten bij 96 ° C onmiddellijk gevolgd door een koeling stap in ijs water voor 10 min.
Opmerking: Monsters moeten worden geladen op het polyacrylamidegel (stap 4.5) onmiddellijk na dit. - Kam verwijderen uit het polyacrylamidegel (stap 4.1.6) en gebruik een micropipet om volledig laden elk monster op een gel-sleuf. Elektroforese op 8 W per gel uitvoeren terwijl voortdurend de elektroforese aggregaat met 10 ° C. Running tijd die nodig is afhankelijk van de grootte van het fragment worden gescheiden. Voor fragment grootte van ongeveer 210 bp, een looptijd van ongeveer 3,5 h wordt passend geacht.
- Ter voorbereiding van een kleuring bad, pour 1000 mL 1 x TBE in een plastic vierkant-vormige vak ondoordringbaar zijn voor licht en Voeg 30 µL van kleuring van kleurstof (geschikt om enkele gestrande DNA vlek) met een precisiepipet microliter. Sluit het deksel van de plastic doos en schudden zodat de gelijke verdeling van de kleuring kleurstof.
- Verwijderen van de gel-cassette uit de elektroforese zaal en zorgvuldig de ingekeepte glasplaat te scheiden van de gel. Schuif het polyacrylamidegel van het lege glazen plaat in de kleuring bad. Plaats de kleuring bad op een schudden platform en vlek gel voor 20 tot 30 min met constante schudden.
- Neem de gel zorgvuldig uit de kleuring bad en plaats het op de tafel van de UV van een documentatiesysteem.
Opmerking: Als gevolg van de instabiliteit van de gel is het raadzaam om de voorafgaande stap met twee mensen. Één persoon moet houden de kleuring Bad naast de UV-tabel en een andere moet bereiken onder de gel met beide handen, neem het uit, en schuif deze op de tafel UV. - Sluit het deksel of deur van het documentatiesysteem en neem een foto volgens de fabrikant ' s instructiehandleiding.
5. Detecteren van meerdere onlangs ingenomen prooi groepen parallel met behulp van geautomatiseerde Fragment Analyses.
- Analyseren de inhoud van de darm DNA geëxtraheerd met behulp van de 16 groepsspecifieke primer ingesteld gegeven in tabel 2, met een primer van een set geëtiketteerd als gevolg van de wijziging met een kleuring kleurstof (zie tabel 2 kolom getiteld wijziging), en de parallelle detectiemethoden gebruiken van een geautomatiseerde sequencer.
- Gebruik de werkoplossing DNA extracten (bereid volgens stappen 1.1 tot en met 1.3.11) en gedrag scheiden PCRs voor elke primer instellen zoals beschreven in stappen 2.1.1 naar 2.1.5 (variaties in het mengsel zijn gegeven in tabel 2). Ten minste één besturingselement gebruiken met zuivere DNA uit een specimen behorend tot de respectievelijke doelgroep (positieve controle) en één negatieve controle met zuivere DNA van de soorten van de consument in elke PCR uitvoeren.
- PCRs uitvoeren in de thermocycler met behulp van het standaard PCR protocol gegeven in stap 2.1.4, aangepast aan de respectievelijke onthardende temperatuur (en aantal cycli) voor elke primer instellen gegeven in tabel 2.
Opmerking: Gebruik de hetzelfde DNA-toewijzing van reactie wells voor PCR met elk van de 16 verschillende primer sets te vereenvoudigen latere bundeling van PCR producten voor uitzenden geautomatiseerd fragment analyses. - Winkel PCR producten bij-20 ° C tot alle PCRs die behoren tot een partij voor de geautomatiseerde fragment analyses (Zie tabel 2) zijn afgewerkt. Houden van PCR producten in het donker en bewaar ze niet langer dan 1 week voorafgaand aan fragment analyses.
tabel 2: Details van de 2 partijen van 15 groepsspecifieke primerparen Koester et al. ingestelde (2013) en de nieuw ontworpen Jae28S primer paar regio's van het 18S of 28 rDNA uit 16 doelgroepen van aquatische macroinvertebrates frequentiebanden te versterken. f, voorwaartse inleidingen; r, omgekeerde inleidingen; 18s, primer richt zich op de 18S rDNA subeenheid; 28, primer richt zich op de 28 rDNA subeenheid. " Hydrobiologia, Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) Is een ' moordenaar garnalen ' in de rivier de Rijn systeem?, 768, 2016, tabel S1, aanvullend materiaal pagina 2, Koester Meike Bastian Bayer, Gergs René, (© Springer Internationale publiceren Zwitserland 2015) " met toestemming van Springer. Klik hier voor een grotere versie van deze tabel.
- te detecteren de versterkte fragmenten van alle 16 primer verzamelingen voeren geautomatiseerde fragment analyses in de 2 partijen is gegeven in tabel 2. Gebruik een interne grootte standaard (DNA grootte Standaardkit - 400 [Batch B] en -600 [Batch A], respectievelijk) om te bepalen van de lengte van het fragment. Bereiden de sequencing plaat en automatische sequencer zoals beschreven in de volgende stappen. Merk op dat deze procedure worden aangepast moet misschien indien met behulp van een ander platform dan dat vermeld in de materialen tabel.
- Uit te voeren elke batch-monster, bereiden een mengsel met monster laden oplossing (SLS) en de respectieve omvang standaard. Pipetteer 21.6 µL van SLS en 0.4 µL van DNA grootte Standaardkit - 600 per monster van partij A en, respectievelijk, 21.7 µL van SLS en 0,3 µL van DNA grootte Standaardkit- 400 per monster van Batch B.
- Nemen de PCR producten van de 8 PCRs die behoren tot de respectieve partij uit de vriezer en ontdooi ze. Zorgen dat zij nog steeds in het donker worden bewaard.
- Gebruiken een microliter pipet voor het laden van het aantal putjes van een sequencing plaat nodig (aantal monsters worden geanalyseerd) met elke 22 µL van het respectieve mengsel in stap 5.2.1 beschreven. Spin down de PCR-producten van elk van de 8 PCRs met behulp van de korte run optie van een centrifuge mini (plaat). Elke 1 µL per PCR-product van elk van de 8 PCRs Pipetteer in de respectieve putjes van de plaat sequencing met een pipet microliter.
- Zorgvuldig spin down dit mengsel binnen de sequencing-plaat met een korte termijn van een centrifuge mini plaat en overlay van elk van de putten gebruikt dan met een druppel van minerale olie. Vullen van de respectieve reactie putjes van de plaat van een buffer met 250-300 µL van DNA scheiding buffer.
- Het gebruik van de software voor de capillaire sequencer maken een monster Setup volgens de fabrikant ' s instructies. Toewijzen van de methoden om te controleren steekproef sets en bepalen van de volgorde van de methoden om te worden gebruikt voor het verwerken van de gegevens (Zie tabel 3 voor het uitvoeren van voorwaarden die geschikt zijn voor gebruik met de standaard van de grootte die in de Tabel van de materialen). Merk op dat het is essentieel dat de verdeling van de monsters binnen de Setup van het monster overeenkomt met de toewijzing van het monster in de sequencing-plaat (met inbegrip van de positieve en negatieve controles, zie stap 5.1.1) en dat de methode geschikt voor fragment met de respectieve analyseert standaard grootte is gekozen.
- Een lade bevochtiging Vul met gedeïoniseerd water en plaats de sequencing plaat, buffer plaat en bevochtiging lade in de capillaire sequencer. Plaats de cartridge van een gel met een voldoende hoeveelheid verse scheiding gel van DNA die nodig is voor het monster uitgevoerd. De plaat van de sequencing met behulp van het bereide monster Setup uitvoeren.
| denatureren | aparte | Capillaire | injecteren | ||||
| Temperatuur | tijd | spanning | tijd | Voltage | tijd | ||
| grootte standaard 600 | 90 ° C | 120 s | 4.8 kV | 60 min | 50 ° C wachten op Temp: Ja | 2.0 kV | 30 s |
| grootte standaard 400 | 90 ° C | 120 s | 6 kV | 45 min | 50 ° C wachten op Temp: Ja | 2.0 kV | 30 s |
tabel 3: specifieke voorwaarden voor fragment analyses op de geautomatiseerde sequencer met behulp van de normen van de grootte die in de tabel materialen.
- om de resultaten te analyseren ruwe gegevens exporteren en deze gegevens uploaden naar een fragment analyseprogramma. Kies standaard kleurstof bestellingen van de kleur van de respectieve fabrikant instellen kleurstof kleurkanalen.
- Een overzicht van het verwachte bereik van fragment lengte versterkt door de interne groepsspecifieke primer Panel ingesteld binnen een partij volgens de handleiding van het programma maken.
- Voor het verwerken van de gegevens, selecteert u de respectieve Panel, juiste grootte standaard, standaard kleur en type analyse en uitvoeren. Kies de optie electropherogram fluorescent signaal intensiteit van capillaire elektroforese instrumenten berichtsymbool een trace van één regel voor elke kleur kleurstof. Markers/primer verzamelingen wordt weergegeven met vermelding van de respectieve fragment bereik en de exacte lengte van de gedetecteerde fragment gekoppeld aan het midden van elke genaamd piek wordt gemarkeerd (in de meeste programma's door verkleuring of naam die is toegewezen) automatisch.
- Voor elk monster, berekenen hoe nauw het monster ' s interne grootte standaard overeenkomt met de geselecteerde grootte standaard ter geruststelling van het succes van de roeping van de grootte. Meeste fragment analyses programma's hebben een optie om automatisch te berekenen en visualiseren van deze wedstrijd. Als de grootte roeping is mislukt, herhaal fragment analyses voor deze monsters.
- Visueel gecontroleerd of de electropherogram van elk monster en bevestigen/unconfirm elke piek genaamd voor elke markering/primer afzonderlijk instellen. Handmatig invoegen ongepast bergtoppen die passen de criteria van een markering/primer set of verwijderen verkeerde die volgens de handleiding van het programma gebruikt. Toepassing van de basenpaar grootte of bin naam in de '-allel Label '. Berekenen en weergeven van de specificaties van de piek in de ' piek tabel '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We stappen die in dit protocol voor dieet analyses binnen verschillende studies beschreven voor het met succes gebruikt. In dit gedeelte geven we voorbeelden met een beschrijving van de toepasbaarheid van de verschillende secties van het protocol.
Als voorbeeld, om aan te tonen de effectiviteit van groepsspecifieke primer sets opgericht door de auteurs28 en het potentieel van verder stroomafwaarts analyses van PCR producten door SSCP analyses, werd een voeding experiment uitgevoerd. Individuen van Dikerogammarus villosus als roofdieren en Caenis spp. larven als prooi werden gevangen in de Rijn en de backwaters in de buurt van Karlsruhe (Duitsland). In het laboratorium, predator en prooi taxa afzonderlijk werden gehouden in gefilterde stream water bij 20 ° C en waren uitgehongerd voor 36 uur. Voor het experiment werden zeekomma exemplaren geplaatst in bekerglazen met gefilterde stream water (100 mL) individueel, gevoed met twee tot drie Caenis larven gedurende 30 minuten en vervolgens ingevroren in vloeibare stikstof. Het maag-darmkanaal van elke D. villosus werd ontleed en DNA zoals beschreven in Protocol 1 werd gewonnen. DNA-extracten werden getest met de primer van de Caep28S geschikt voor het detecteren van Caenis spp., met de juiste PCR protocol28 zoals beschreven in Protocol 3 instellen. Om te controleren of de verschillen tussen versterkte fragmenten van verschillende plantensoorten, Caenis , werd PCR uitgevoerd met de darm inhoud samples en zuivere DNA-monsters van drie Caenis referentie soorten. Agarose gelelektroforese leidde tot enkele bands van dubbele gestrande DNA, die niet kunnen worden onderscheiden tussen de verschillende soorten van de Caenis met dit soort elektroforese (figuur 2A). Daarentegen door de Elektroforese van het gel van de SSCP konden zoals beschreven in het Protocol 4, het determineren prooi organismen naar soorten niveau door het vergelijken van de darm-inhoud monsters met de referentiemonsters (figuur 2B). Het SSCP fragment patroon van de drie referentie taxa Caenis beskidensis (figuur 2B, lane 1), Caenis horaria (figuur 2B, lane 2), en Caenis-uil (figuur 2B, lane 3) bestond uit vier bands met differentieerbare patronen. Twee gut inhoud monsters (figuur 2B, lane 4 en 5) had een fragment patroon gelijk is aan die van C.-uil (figuur 2B, lane 3). Het patroon van het fragment van het derde gut inhoud monster (figuur 2B, lane 6) was identiek aan die van C. horaria (figuur 2B, lane 2). Reeks analyses van de twee darm inhoud monsters geïdentificeerd als C.-uil en C. horaria (figuur 2B, lane 4 en 6) en de referentie van de respectieve soorten geverifieerd dit resultaat (zie elektronische aanvulling uitlijning fasta bestand).
Figuur 2: Oorspronkelijke afbeelding van (A) agarose de Elektroforese van het gel en (B) SSCP analyse van PCR fragmenten voor gut inhoud en referentiemonsters versterkt met de Caep28S primer set. 1-3 rijstroken Toon de referentiemonsters van de soort Caenis beskidensis (1), Caenis horaria (2) en Caenis-uil (3). In rijstroken 4-6, het fragment patroon van verschillende inhoud monsters van de zeekomma Dikerogammarus villosus worden gepresenteerd. Lane 7 toont het fragment patroon van een 100 bp DNA-ladder. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Bovendien, een laboratorium experiment werd uitgevoerd in welke water mijten die behoren tot de soorten Hygrobates fluviatilis werden gevoed op chironomid larven niet alleen bepalen als DNA van chironomid personen verbruikt kan worden opgespoord in de water-mijten, maar ook om te testen of de hoeveelheid DNA gedetecteerd is afhankelijk van de verstreken tijd sinds de consumptie van de prooi29. Na het verhongeren de mijten voor ongeveer een week, werd elke mijt aangeboden een larve van de chironomid als voedsel. Elke 3-4 personen voor de mijt van de water waren opgelost in ethanol (absolute) voor genetische analyse met behulp van de Chiro18S primer set specifiek voor de dipteran familie dansmuggen28 op 1, 2, 3, 7, 9, 24, 32 of 50 h na29gevoed. Als een graad van consumptie door de water mijt personen, de respectieve prooi personen waren ingedeeld in de volgende vijf voeding Categorieën: 1 = volledig gezogen, omhulling volledig leeggemaakt (> 90%), 2 = bijna volledig gezogen uit (> 75-90%), 3 = halve gezogen uit (> 50-75%), 4 = alleen gedeeltelijk gezogen uit (> 5-50%), 5 = geen zichtbare wijzigingen in van de prooi lichaam structuur (≤5%)29. DNA werd onttrokken aan de mijten water zoals beschreven in Protocol 1 (zonder stappen 1.2.1 en 1.2.2) en de aanwezigheid van 18S rDNA in het extract en de functionele efficiëntie van de sjabloon werden gecontroleerd zoals beschreven in Protocol 2. Detectie van prooi DNA werd uitgevoerd volgens Protocol 4 met behulp van alleen de Chiro18S primer instellen met de voorwaartse primer aangeduid met een fluorescerende kleurstof (Zie tabel 2) en de DNA grootte Standaardkit - 400. Om vergelijkingen tussen de monsters geanalyseerd binnen verschillende punten van een geautomatiseerde sequencer, de verhouding tussen monster piekhoogte en de piekhoogte van de dichtstbijzijnde interne standaard (d.w.z., 360 bp in dit geval) van elk monster werden berekend en gebruikt als een proxy voor de hoeveelheid DNA aangetroffen. Resultaten toonde aan dat DNA van de chironomid in vrijwel alle individuen van Hygrobates fluviatilis gevoed op chironomid larven29worden opgespoord. Vanaf de kortste interval (1 h na de voeding) naar de langste periode na voeding (50 h) de relatieve hoeveelheid DNA van de gedetecteerde prooi aanzienlijk was verminderd (figuur 3A)29. Bovendien is de relatie tussen tijd na de voeding en de prooi-indeling als een proxy voor de geconsumeerde hoeveelheid prooi die DNA kon worden bevestigd (figuur 3B)29. Het verminderen van prooi DNA aangetroffen met toenemende tijd nadat de voeding werd waarschijnlijk volledig tot uiting door de afbraak van DNA en de spijsvertering van de prooi, omdat egestion van prooi DNA is zeer ongeloofwaardig als gevolg van het ontbreken van een anus in water mijten29. Deze resultaten bevestigen de geschiktheid van deze benadering voor de kwantificering van de geconsumeerde prooi.
Figuur 3: Relaties tussen de nationale ln hoogte-breedteverhouding (monster-piek hoogten/standaard360 piekhoogte) en (A) tijd na het voederen van mijten en (B) voeding categorie (n = 23). "Experimentele en toegepaste acarologie, eerste detectie van prooi DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): een nieuwe aanpak voor het bepalen van de predator-prooi relaties in water mijten, 67, 376, Martin van de P. M. Koester, L. Schynawa, R. Gergs, (© Springer International publiceren Switzerlen 2015) "met toestemming van Springer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Voor het onderzoek naar het belang van predatie door de invasieve zeekomma D. villosus in het veld, intensieve stabiele isotoop analyses van δ13C en δ15N van D. villosus en mogelijke voedselbronnen werden bevorderd door moleculaire detectie van onlangs ingenomen prooi binnen de inhoud van de darm van de exacte dezelfde personen. In totaal 206 D. villosus individuen van verschillende sites werden verzameld en het maag-darmkanaal van elk individu werd ontleed en DNA volgens Protocol 1 werd gewonnen. De aanwezigheid en functionele efficiëntie van de sjablonen gebruikt werd verzekerd zoals beschreven in Protocol 2. Recente predatie door de D. villosus personen op meerdere macroinvertebrate prooi taxa werd getest zoals beschreven in het Protocol 4. Over het algemeen slechts 16% van de inhoud van de darm D. villosus positief getest voor DNA die behoren tot een van de 16 gerichte macroinvertebrate prooi taxa, en steunen daarom de resultaten van de stabiele isotoop analyses die aangegeven van een lage predacious voeding gedrag van de invasieve zeekomma in het veld27. Terwijl binnen de genetische analyses, DNA van 12 geteste prooi taxa werd gevonden in ten minste 1 gut inhoud monster, was DNA van de 4 andere prooi taxa nooit gevonden (Figuur 4)27.
Figuur 4: Histogram ter illustratie van de respectieve aantal D. villosus individuen van alle tien sites waarvan darm de inhoud positief op macroinvertebrate getest prooi DNA. PCR werd uitgevoerd met 16 groepsspecifieke primer sets zoals aangegeven. "Hydrobiologia, Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) Is een 'killer garnalen' in de rivier de Rijn systeem?, 768, 2016, 310, Koester Meike, Bastian Bayer, Gergs René, (© Springer International Publishing Zwitserland 2015)" met toestemming van Springer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende bestand. Sequence_alignement_feeding_trial.fasta Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een gemakkelijke en kosten-efficiënte methode voor PCR-gebaseerde bepaling van predator en prooi interacties van veldmonsters via groepsspecifieke inleidingen voor rDNA regio's, die kunnen worden gecombineerd met andere niet-moleculaire analyses van de dezelfde specimens. Er zijn echter verschillende kritische stappen binnen het protocol. Ten eerste, het verzekeren van de specificiteit van de inleidingen gebruikt is essentieel. Ten tweede, is het voorkomen van verontreiniging en verlies van gut inhoud materiaal tijdens de voorbereiding van het maag-darmkanaal en de daaropvolgende extractie van DNA van essentieel belang. Terwijl de Kruis-monster verontreiniging kan leiden tot onjuiste positieve detectie van prooi DNA, verbruikt verlies voor gut inhoud materiaal zou kunnen leiden tot ontbrekende zelden prooi soorten. Verificatie van de aanwezigheid van rDNA behorend tot de respectieve subeenheid en de functionele efficiëntie van sjablonen gebruikt voor de analyses (punt 2 van het protocol) is essentieel voor het verzamelen van representatieve informatie over de prooi verbruikt. Dit is met name cruciaal, als geen DNA van prooi groepen die de consument wordt verondersteld te voeden kan worden gedetecteerd25,27. Bovendien, bij de voorbereiding van de PCRs (stap 3.1, 5.1.1 en 5.1.2) het is cruciaal dat het mengsel en het protocol gebruikt precies voldoen aan de criteria waarin de respectieve primer is opgegeven voor een bepaalde groep van taxa. Anders, versterking van DNA in de PCR reactie volledig mislukken, of het DNA van taxa niet gericht kan ook worden versterkt. Daarom is het verplicht gebruik van positieve en negatieve controles binnen elke PCR uitgevoerd om te verzekeren dat de PCR reactie gewerkt en geen besmetting is opgetreden. Bovendien is het noodzakelijk dat de matrix van de monsters voor elke run PCR precies zodat de juiste toewijzing van prooi verbruikt met de respectieve consument model is gedocumenteerd. Voor deze taak moet bijzondere voorzichtigheid worden genomen terwijl het bundelen van PCR producten voor parallelle detectie van meerdere prooi groepen via geautomatiseerde fragment analyses (stap 5.2.3).
Voor de detectie van versterkte fragmenten met behulp van agarose gel elektroforese (stap 3.2 en 3.3) agarose gel moet zo dun mogelijk en zorg moet worden genomen tijdens de visuele inspectie van het beeld om te voorkomen dat het ontbreken van fragmenten met een lage resolutie van de visuele. Voor resultaten en een juiste conclusie over prooi verbruik door een consument is het cruciaal dat zelfs zelden gebruikte prooi taxa worden erkend. Dikke agarose gel verminderen de zichtbaarheid van de potentieel lage bedragen van prooi DNA en dus vermindering van de kans om te missen zelden verbruikte prooi en de invoering van de onzekerheden in de conclusies van de analyse. Bovendien, vanuit het oogpunt van gezondheid met behulp van een minder - of niet-toxisch alternatief dan ethidiumbromide voor de kleuring van de gels misschien wel aan te raden. Het protocol voor de daaropvolgende verder stroomafwaarts analyse van versterkte fragmenten via SSCP analyses met behulp van polyacrylamide gels bevat enkele stappen die moeten worden uitgevoerd met bijzondere voorzichtigheid. Het is belangrijk dat gel cassette gemonteerd lekvrije (stap 4.1.3 is) en de oplossing van polyacrylamide genoeg tijd krijgen is om te polymeriseren volledig (stap 4.1.6). Openen van de cassette te vroeg zal leiden tot lekken vloeibare acrylamide oplossing en, ondanks het feit dat de voorbereiding moet worden gestart vanaf het begin, uitgebreide schoonmaken moet eveneens worden gedaan. Bovendien overdracht van het polyacrylamidegel in de kleuring bad (stap 4.7) en vanaf daar naar de UV tabel (stap 4.8) moet zeer zorgvuldig gebeuren als gevolg van de instabiliteit van deze gels. Anders, de gel kan scheuren en fragmenten kunnen worden onderbroken, wat leidt tot de noodzaak de procedure herhalen.
Een belangrijke voorwaarde voor het succesvol verwerken gegevens ontvangen van geautomatiseerde fragment analyses is dat het monster van de grootte van de interne standaard overeenkomt met de grootte van een standaard patroon gegeven door de fabrikant (stap 5.3.3) om de bepaling van de fragment van de juiste lengte. Dit is vooral belangrijk omdat anders de verschillende fragmenten, geëtiketteerd met de dezelfde fluorescerende kleurstof, kleuring kunnen worden toegewezen aan de verkeerde prooi taxa en daarom tot een volledige miskenning van predator en prooi interacties leiden. Bovendien tonen de electropherograms vaak achtergrondgeluiden. Om het vertrouwen in de interpretatie te scheppen, is het essentieel dat de pieken van de interne grootte-standaard aanzienlijk hoger is dan de achtergrondgeluiden van het monster zijn. Bijgevolg, pieken voor elke markering/primer alleen wilt meetellen als ze aanzienlijk hoger is dan de achtergrondgeluiden zijn.
Dit protocol kan worden aangepast voor het detecteren van de verschillende groepen van prooi taxa van belang binnen verschillende consumenten van belang. Toegegeven, groepsspecifieke inleidingen al mogelijk niet beschikbaar voor elke potentiële prooi taxon van belang. Groep-specifieke primers zijn echter niet alleen beschikbaar voor verschillende zoetwater macroinvertebrate taxa28, maar ook voor een breed scala aan andere taxa (bijvoorbeeld verschillende mariene macroinvertebrate taxa16,30 en gemeenschappelijke taxa van vliegende insecten31). Daarmee de selectie groepsspecifieke primer ingesteld geschikt om DNA van alle soorten van de prooi van een bepaalde taxon te vergroten, maar mislukt in de versterking van DNA van soorten die niet tot dit taxon behoren, is essentieel32. Vele groepsspecifieke inleidingen die nu beschikbaar zijn opgegeven voor een bepaald bereik van taxa (bijv., 130 taxa van zoetwater macroinvertebrates gemeenschappelijk in de rivier de Rijn systeem28). Daarom, om te voorkomen van vals-negatieve of vals-positieve resultaten, het specifieke karakter van dergelijke inleidingen moet wordt opnieuw gecontroleerd voor het bereik van taxa gemeenschappelijk in het ecosysteem van belang voorafgaand aan hun toepassing voor doel taxa en consumenten niet opgenomen in het bereik van taxa voor die de inleidingen waren vastgesteld. Bovendien, als die moleculair analyses niet worden gecombineerd kunnen met andere analyses van de exacte dezelfde individuele, dissectie van het maag-darmkanaal kunnen worden overgeslagen.
Niettemin ontrafeling van het maag-darmkanaal van de grotere exemplaren ook voorkomt falen van DNA-extractie vanwege teveel materiaal, en vermindert de aanwezigheid van consument-DNA in het monsterextract. Studies hebben echter aangetoond dat specifieke blokkerende primers, die hechten aan het DNA van de consument en daarmee blokkeren voor de PCR reactie effectief door de amplificatie van zeldzame opeenvolgingen in gemengde monsters33 verbeteren kunnen. Daarom kan dissectie van het maag-darmkanaal worden vermeden, zelfs wanneer het behandelen van grotere exemplaren van de consument, door het gebruik van specifieke blokkerende primers. Voor de parallelle detectie van waarbij meerdere groepsspecifieke primer sets via geautomatiseerde fragment analyses afgeleid, moet worden gezorgd bij de keuze van de kleuring van kleurstof als label. Daarmee moeten primer sets versterken fragmenten van ongeveer dezelfde lengte worden geëtiketteerd met duidelijk te onderscheiden fluorescente kleurstoffen. Bovendien zijn er een aantal capillaire elektroforese systemen beschikbaar van verschillende fabrikanten. Sommige van deze systemen kunt zogenaamd de bepaling van meerdere fragmenten zelfs via aspecifieke kleurstoffen. Het hier gepresenteerde protocol kan gemakkelijk worden aangepast om te detecteren versterkte fragmenten met om het even welk van deze systemen. Afgezien van dat, om de tijd die nodig is voor tHij analyseert, zou het mogelijk voor het optimaliseren van enkele multiplex-PCR testen om te versterken van DNA van prooi groepen van één fragment analyse partij gelijktijdig (bijvoorbeeld gelijktijdige versterking van 12 prooi organismen kevers34 of maximaal zes vliegende insecten taxa31).
Een potentieel nadeel van gut inhoud analyses in het algemeen, en dus ook de analyses die zijn beschreven in dit protocol, is de lage temporele resolutie. Met dergelijke methoden is het alleen mogelijk om te identificeren onlangs ingenomen organismen, die tot onzekerheden in het belang van enkele prooi organismen2 leiden kunnen. Echter toonden we aan dat genetische analyse volgens dit protocol kan gemakkelijk gecombineerd worden met analyses van stabiele isotopen (δ15N en δ13C) van de exacte dezelfde consument exemplaren25,27. Als een tijd-integratie van natuurlijke tracer van predator en prooi interacties, stabiele isotoop analyses worden vaak gebruikt om te karakteriseren voedselweb structuren1, maar potentieel overlappende isotopische waarden uit verschillende prooi soorten belemmeren vaak een exacte definitie van predator en prooi interacties2. Dus, met behulp van dit protocol voor genetische analyses in combinatie met stabiele isotoop analyses te overwinnen van de nadelen van elke methode kan verder ons begrip van voedsel webs en hun relatie tot nutriënt of energie stromen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Silke Classen van het onderzoeksinstituut voor ecosysteem analyse en beoordeling (gaiac), RWTH Aachen voor haar bijstand bij de opstelling van de in dit protocol gebruikte groepsspecifieke primer-sets. Wij danken Peter Martin en Laura Schynawa van de Universiteit van Kiel voor de samenwerking in het water mijten experimenten. Wij danken ook de assistenten van de technische lab om het lab soepel en het voorbereiden van het register van bedrijven en de catalogus nummers. Dit werk werd gesteund door de Duitse Research Foundation (DFG; project GE 2219/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
References
- Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
- Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool. Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones. Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies. Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer. Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).
- Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur. Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).
- Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef. J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).
- Akin, S., Winemiller, K. O. Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary. Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).
- Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster. Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).
- Gergs, R. Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer? Universität Konstanz. , (2009).
- Sheppard, S. K., Harwood, J. D. Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs. Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).
- Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns. Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).
- Verma, S. K., Singh, L. Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).
- Deagle, B. E., et al. Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).
- Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples. Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).
- Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica. Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).
- Hayashi, K., Yandell, D. W. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).
- Glavač, D., Dean, M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).
- Mülhardt, C. Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).
- Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , InTech. (2012).
- Wang, X. W., et al. A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles. Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).
- Gemmer, I., Gergs, R. Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda). Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).
- Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar). Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).
- Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes. Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).
- Koester, M., Gergs, R. No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland. Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).
- Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification. Front Zool. 4 (6), 6 (2007).
- Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system? Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).
- Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates. Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).
- Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites. Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).
- Deagle, B. E., et al. Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus). PLoS One. 2 (9), e831 (2007).
- Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey. PLoS One. 9 (12), e115501 (2014).
- Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances. Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).
- Vestheim, H., Jarman, S. Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs. Front Zool. 5 (1), 12 (2008).
- Harper, G. L., et al. Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets. Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).
