Summary
שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.
Abstract
עיניים מולדות חריגות ואסטתיים משקפים שיבושים בתפקוד הרכס העצבי, אוכלוסיה ארעית של תאי גזע נודדות כי להצמיח סוגי תאים רבים בכל הגוף. הכרת הביולוגיה של הרכס העצבי הוגבלה, המשקף מחסור של מודלים צייתן גנטית שניתן למדה ויוו , בזמן אמת. דג זברה הוא מודל התפתחותי חשוב במיוחד ללמוד אוכלוסיות תאים נודדים, כגון הרכס העצבי. לבחון העברה הרכס העצבי לתוך העין המתפתח, שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של מיקרוסקופ עם אורך גל ארוך פוטון רב זריחה עירור סריקת לייזר בוצע כדי ללכוד וידאו ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של העין לפתח בדג זברה מהונדס עוברי, כלומר Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP), כמו sox10 ו- foxd3 הוכחו במודלים של בעלי חיים רבים כדי לווסת את הבידול הרכס העצבי מוקדם ומייצגים סביר סמנים עבור תאי הרכס העצבי. הדמיה בצילום מואץ פוטון מרובה שימש להבחין את ההתנהגות ואת תבניות הגירה של שתי האוכלוסיות תא של הרכס העצבי, תורם להתפתחות המוקדמת של העין. פרוטוקול זה מספק מידע ליצירת סרטונים בצילום מואץ במהלך ההעברה הרכס העצבי דג זברה, לדוגמה, יכול להיות מיושם עוד יותר להמחיש את הפיתוח המוקדם של מבנים רבים את דג זברה ואורגניזמים אחרים מודל.
Introduction
מחלות עיניים מולדות עלולה לגרום לעיוורון בילדות, הן לעיתים קרובות בשל ליקויים של הרכס העצבי הגולגולת. תאי הרכס העצבי הם תאי גזע ארעי זה נובעים הצינור העצבי ויוצרים רקמות רבות בגוף. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 תאי הרכס העצבי, נגזר מן prosencephalon ו mesencephalon, להצמיח העצם ואת הסחוס של midface, אזורים חזיתית, איריס, קרנית, trabecular meshwork לבין sclera במקטע הקדמי של העין. 4 , 6 , 7 , 8 תאים הרכס העצבי מן הטופס rhombencephalon שלועיים קשתות, הלסת, יצוא לב בדרכי. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 מחקרים הדגישו את תרומתם של הרכס העצבי כדי עינית ופיתוח periocular, הדגשת החשיבות של תאים אלה בהתפתחות העין חוליות. אכן, שיבוש נדידת תאים הרכס העצבי ובידול להוביל ואסטתיים, עינית החריגות כפי שנצפתה תסמונת Axenfeld-ריגר ותסמונת פיטרס פלוס. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . וכך, הבנה מקיפה של הגירה, התפשטות התמיינות של תאים אלה הרכס העצבי יספקו תובנה המורכבות הבסיסית מחלות עיניים מולדות.
דג זברה היא אורגניזם מודל חזק לומד פיתוח עינית, כפי המבנים של העין דג זברה דומים לכלים המקבילים יונקים, גנים רבים אבולוציונית נשמרים בין דג זברה, יונקים. 18 , 19 , 20 . בנוסף, דג זברה העוברים הם שקופים, oviparous, הקלה על הפריט החזותי של התפתחות העין בזמן אמת.
הרחבת העבודה שפורסמו בעבר,6,7,20 הדפוס הנדידה של תאי הרכס העצבי שתואר באמצעות פוטון רב זריחה זמן לשגות הדמיה בשורות דג זברה מהונדס המסומנת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטה תעתיק של זו מדיניות (קביעת מין אזור Y)-תיבת 10 (sox10) או Forkhead תיבת D3 אזורים הרגולציה של ג'ין (foxd3). 21 , 22 , 23 , 24. הדמיה בצילום מואץ פלורסצנטיות פוטון מרובה היא טכניקה עוצמה המשלב טכניקות אופטי מתקדם של מיקרוסקופ עם זמן אורך גל עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה כדי ללכוד תמונות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי של דגימות המתויגת fluorophores סריקת לייזר. 25 , 26 , 27 השימוש של הלייזר פוטון מרובה יש יתרונות ברורים על פני קונפוקלית רגיל, כולל חדירה לרקמות מוגברת, ירידה fluorophore הלבנה.
באמצעות שיטה זו, שתי האוכלוסיות ברורים של תאי הרכס העצבי משתנה בתזמון של העברת מסלולים נודדות היו תאי הרכס העצבי מאפלייה, כלומר foxd3-חיוביות periocular מזנכימה ועין המתפתח הרכס העצבי sox10-חיוביות תאי מזנכימה ואסטתיים. בשיטה זו, גישה כדי להמחיש את ההעברה של הרכס העצבי ו ואסטתיים ההעברה בדג זברה הוא הציג, ולכן קל להתבונן ההעברה הרכס העצבי מוסדר בזמן אמת במהלך הפיתוח.
פרוטוקול זה מספק מידע ליצירת סרטונים בצילום מואץ במהלך התפתחות מוקדמת העין Tg (sox10:EGFP), דג זברה מהונדס Tg (foxd3:GFP), כדוגמה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עוד יותר עבור הפריט החזותי ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של ההתפתחות המוקדמת של כל מבנה ו ואסטתיים שמקורם בתאי הרכס העצבי דג זברה. יתר על כן, ניתן ליישם שיטה זו נוספת להמחשת ההתפתחות של רקמות ואיברים אחרים דג זברה, דגמים בעלי חיים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדמיה בצילום מואץ פוטון רב זריחה להפיק סדרה של קטעי וידאו שגילה את דפוסי ההגירה של תאי הרכס העצבי הגולגולת להצמיח המקטע הקדמי של העין Tg (sox10:EGFP), Tg (foxd3:GFP) ודפי ואסטתיים דג זברה קווים. לדוגמה, העברת sox10 -תאי הרכס העצבי חיובי בין 12 ו-30 hpf מן הקצה של הצינור העצבי לתוך האזור ואסטתיים (Video 1, איור 2). תאי prosencephalon, mesencephalon להעביר הגבי ו הגחון לעין המתפתח כדי לאכלס את מזנכימה periocular. בנוסף, sox10 -חיובי תאים אלה יוצרים את התהליך frontonasal. הרכס העצבי תאים rhombencephalon להעביר ventrally, להצמיח הקשתות בלוע. זמן לשגות הדמיה של foxd3-תאי הרכס העצבי חיובי בין 30 ל 60 hpf הראה כי תאים אלה הועברו בין הראייה גביע ו האאקטודרם משטח ודרך של פיסורה עינית (סרטון 2, איור 3). אלה foxd3-תאים חיוביים התמזגו סביב העדשה, ויוצרים stroma איריס.
איור 1 . תוכנית ההתקנה. א כל רכיב של העובר להרכבת מכשיר, כולל חדר אמבטיה פתוח, מתאם פלטפורמה והבמה exchange מהירה. B. הרכבה של החדר אמבטיה פתוח. ג. תוספת של 2% agarose פתרון (60-70 ° C) לחדר אמבטיה פתוח. ד השמה של העובר בחדר אמבטיה פתוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אי העובר (24 hpf) ממוקם רוחבית במרכז הפתרון polymerized agarose בחדר האמבטיה פתוח. פ תוספת של המדיה על פני השטח של הפתרון polymerized agarose לכסות לגמרי את העובר בחדר אמבטיה פתוח. ג חדר אמבטיה פתוח הממוקם ברציף exchange מהירה וממוקמים המתאם הבמה. ה השמה של העובר להרכבת מכשיר על הבמה של המיקרוסקופ פוטון מרובה. אני תיבת בטיחות לייזר. דלתות הזזה (1 ו 2) עבור מילוי החדר פתוח מסומנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . נציג deconvolved ותמונות מוקרן-מקס של פוטון מרובה הדמיה בצילום מואץ של Tg (sox10:EGFP) העובר דג זברה מ- 12 ל- 30 hpf. Sox10 -התאים חיובי היגרו מן prosencephalon (P) ו mesencephalon (ז) כדי לאכלס את periocular מזנכימה (העיגול מנוקד מציין את העין) ואת תהליך frontonasal (פתוח חץ). Sox10 -תאים חיוביים מ- rhombencephalon (R) היגרו ventrally כדי ליצור הקשתות בלוע (חץ סגור). תמונות שהתקבל בכל 20 דקות במהלך מסגרת הזמן, תפור יחד ליצירת וידאו 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . נציג deconvolved ותמונות מוקרן-מקס של פוטון מרובה הדמיה בצילום מואץ של Tg(foxd3:GFP) דג זברה העובר בין 24 ל-48 hpf. Foxd3 -תאים חיוביים נכנס אל החדר הקדמי של העין (כוכבית מציין עדשה) בין משטח האאקטודרם גביע אופטיים, עם יותר תאים מקומית את הגבי ("D")-אחורי רביע ("P") לעומת הקדמי ("A") של הגחון הגזרות ("V"). בנוסף, תאי foxd3 -חיובי היגרו סמוכים, דרך של פיסורה עינית. תמונות שהתקבל בכל 20 דקות במהלך מסגרת הזמן, תפור יחד ליצירת סרטון 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . נציג deconvolved ותמונות מוקרן-מקס של פוטון מרובה הדמיה בצילום מואץ של Tg(foxd3:GFP) דג זברה העובר בין 30 ל-60 hpf. Foxd3 -תאים חיוביים נכנס אל החדר הקדמי של העין (בעיגול החיצוני מציין קצוות היקפיים של העין, בעיגול הפנימי מציין עדשה) בין משטח האאקטודרם גביע אופטיים, עם יותר תאים מקומית את הגבי ("d")-רביע האחורי ("p") לעומת הקדמי ("a"), הגזרות הגחוני / ("v"). בנוסף, תאי foxd3 -חיובי היגרו סמוכים, דרך של פיסורה עינית (חץ לבן מציין הרכס העצבי נודדים, קו מקווקו אדום demarcates פיסורה בעדשת העין). 60 hpf, foxd3-תאים חיוביים לחלוטין כיתרו את העדשה (חיצים סגור), המציין את סגירת פיסורה. בנוסף, ב-60 hpf, foxd3 היה גם לידי ביטוי photoreceptors (חץ פתוח), אשר לא היה קשור הביטוי של זה גורם שעתוק בתאי הרכס העצבי. תמונות שהתקבל בכל 20 דקות במהלך מסגרת הזמן, תפור יחד ליצירת וידאו 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
וידאו 1. צילומי הווידאו של Tg (sox10:EGFP) העובר דג זברה מ- 12 ל- 30 hpf. הכוכבית מציינת את העין. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו 2. צילומי הווידאו של Tg (foxd3:GFP) דג זברה העובר בין 24 ל-48 hpf. הכוכבית מציינת את העדשה. הכוכבית מציינת את עינית פיסורה. d, הגבי; v, הגחון; p, אחורי; , הקדמי. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו 3. צילומי הווידאו של Tg (foxd3:GFP) דג זברה העובר בין 30 ל-60 hpf. הכוכבית מציינת את העדשה. החץ מסמל את עינית פיסורה. d, הגבי; v, הגחון; p, אחורי; , הקדמי. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיה בצילום מואץ פוטון מרובות מאפשרת ויוו המעקב של אוכלוסיות תא ארעי, נודדים. טכניקה חזקה זו ניתן ללמוד תהליכים עובריים בזמן אמת, במחקר הנוכחי, התוצאות של שיטה זו משופרת הידע הנוכחי של נדידת תאים הרכס העצבי ופיתוח. מחקרים קודמים הדמיה בצילום מואץ לנצל בדרך כלל סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. 29 , 30 , 31 , 32 . כאן, אנו מציגים את השימוש טכניקה פוטון מרובות, שבו יש יתרונות רבים על פני המסורתית מיקרוסקופיה קונפוקלית. הבסיס של מיקרוסקופ רב פוטון הוא כי שני פוטונים של אורכי הגל האינפרא-אדום משמשים כדי לעורר את fluorophore. כתוצאה מכך, יש פחות פיזור ורקע ובכך ירד, ומאפשרת חדירה רקמות עמוק יותר, להשגת הדמיה לעומק העולה על 1 מ מ ברקמה ביולוגית עם זיהוי יעיל יותר מאשר מיקרוסקופיה קונפוקלית. מאפיינים אלה גם ירידה phototoxicity, אשר הוא שיקול חשוב עם רכישת התמונה חוזרים ותכופים. 25 , 26 , 27 מ מאפיינים אלה, מיקרוסקופ שני הפוטונים יכולים ליצור תמונות מערכת ההכנות שלם-איברים ורקמות במודלים קטנים מוצרים מהחי, (כגון עכברים, העוברים דג זברה 12 hpf - כמו במקרה שלפנינו). עוד, מודלים בעלי חיים קטנים אלה מאפשרים השימוש גנטית מקודד חלבונים פלורסנט, אשר יכול להיות מותאם הרקמה של ריבית. לפיכך, השימוש של מיקרוסקופיית פוטון מרובה יכולה להגביר מאד ייבוא תמונות בצילום מואץ לניסויים.
יש שלבים רבים של פרוטוקול זה, אשר תלויות בסוג של פוטון מרובה מערכת לייזר וזיהוי בשימוש. רוב הבעיות עם פרוטוקול זה להתעורר עם הגדרות לייזר, רכישת תמונות בהתבסס על מערכת הזיהוי בשימוש. ידע של המערכת הפרט וגישה לתמיכה הטכנית הם קריטיים. בנוסף, ניסיון העבר עם סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי שימושי לפתרון בעיות. יתר על כן, המערכת הראשונית להגדיר תארך זמן רב. עם זאת, עם סיום מערכת להגדיר, רק שינויים קטנים נדרשים בדרך כלל בעת שימוש באותם הקווים מהונדס.
במחקר הנוכחי, דג זברה העוברים בין 12 ל- 60 hpf שימשו ניסויים אלה. במהלך טווח גילאים זה, העוברים הם קטנים, בקלות מוטבע על agarose ברצון מרדימים עם tricaine. עם זאת, העוברים יכול להיות צמיחה ועיכוב התפתחותי בהתאם לתקופת הניסוי. לכן, יש לנקוט על מנת להבטיח כי העובר מתקיים בהתאם בסוף הניסוי.
הדמיה בצילום מואץ פוטון מרובה התשואות הדמיה ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של נדידת תאים, אשר לא רק משפר את היכולת ללמוד ויוו דג זברה מופרה, אך ניתן להחיל גם על מערכות רבות. למרות פרוטוקול מחולקת לרמות מתמקדת נדידת תאים הרכס העצבי דג זברה, טכניקה זו בקלות ניתן להתאים למטרות הדמיה אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
עבודה זו נתמכה כלכלית באמצעות מענקים מן העין המכון הלאומי של מכוני הבריאות הלאומיים (K08EY022912-01) ואת החזון לחקר הליבה (P30 EY007003).
Acknowledgments
המחברים מודים תומאס שילינג על בחביבות gifting של Tg (sox10:eGFP)-דגים, מרי הלורן עבור הדג(foxd3:GFP) Tg gifting בחביבות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope - FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
- Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
- Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
- Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
- Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
- Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
- Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
- Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
- Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
- Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984 (2010).
- Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
- Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
- Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
- Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
- Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
- Lesnik Oberstein,, S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
- Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
- Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
- Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
- Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525 (2013).
- Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
- McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).
