Summary
Una combinazione delle tecniche ottiche avanzate di scansione microscopia con lungo l'eccitazione di fluorescenza multi-fotone lunghezza d'onda del laser è stata implementata per catturare immagini ad alta risoluzione, tridimensionale, in tempo reale della migrazione dalla cresta neurale in embrioni di zebrafish di Tg (foxd3:GFP) e Tg (sox10:EGFP).
Abstract
Occhio congenita e anomalie craniofacciali riflettono imprevisti nella cresta neurale, una popolazione transitoria di migratori cellule staminali che danno origine a numerosi tipi di cellule in tutto il corpo. Comprensione della biologia della cresta neurale è stata limitata, che riflette una mancanza di modelli geneticamente trattabili che possono essere studiati in vivo e in tempo reale. Zebrafish è un modello di sviluppo particolarmente importante per lo studio di popolazioni di cellule migratorie, come la cresta neurale. Per esaminare la migrazione dalla cresta neurale nell'occhio in via di sviluppo, una combinazione delle tecniche ottiche avanzate di scansione microscopia con eccitazione di fluorescenza di multi-fotone lunghezza d'onda del laser è stata implementata per catturare video ad alta definizione, tridimensionali, in tempo reale dell'occhio in via di sviluppo negli embrioni di zebrafish transgenici, vale a dire Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP), come sox10 e foxd3 è stati dimostrati in numerosi modelli animali di regolare differenziazione iniziale dalla cresta neurale e probabilmente rappresentano gli indicatori per le cellule della cresta neurale. Time-lapse di immagini multi-fotone è stato utilizzato per discernere il comportamento e schemi migratori delle due popolazioni di cellule neurali della cresta che contribuiscono al precoce sviluppo dell'occhio. Questo protocollo fornisce informazioni per la generazione di video time-lapse durante la migrazione dalla cresta neurale di zebrafish, come esempio e possa essere applicato per visualizzare lo sviluppo precoce di molte strutture in zebrafish e altri organismi di modello.
Introduction
Malattie congenite dell'occhio possono causare la cecità di infanzia e spesso sono dovuti ad anomalie della cresta neurale cranica. Cellule della cresta neurale sono cellule staminali transitorie che derivano dal tubo neurale e formano numerosi tessuti in tutto il corpo. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 cellule della cresta neurale, derivate dal prosencefalo e mesencefalo, danno luogo all'osso e la cartilagine del midface e regioni frontali e l'iride, cornea, trabecolato e sclera nel segmento anteriore dell'occhio. 4 , 6 , 7 , 8 cellule neurali della cresta da romboencefalo forma che il pharyngeal arches, mascella e tratto di efflusso cardiaco. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 studi hanno evidenziato i contributi della cresta neurale all'oculare e perioculare sviluppo, sottolineando l'importanza di queste cellule in sviluppo dell'occhio dei vertebrati. Infatti, la rottura di differenziazione e migrazione delle cellule neurali della cresta condurre ad anomalie cranio-facciali ed oculari come osservato nella sindrome di Axenfeld-Rieger e sindrome di Peters Plus. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 in tal senso, una comprensione globale della migrazione, proliferazione e differenziazione di queste cellule della cresta neurale fornirà approfondimenti le complessità sottostanti malattie congenite dell'occhio.
Zebrafish è un organismo potente modello per studiare lo sviluppo oculare, come le strutture dell'occhio zebrafish sono simili alle loro controparti dei mammiferi, e molti geni sono evolutivamente conservate tra zebrafish e mammiferi. 18 , 19 , 20 inoltre, embrioni di zebrafish sono trasparenti e ovipari, facilitando la visualizzazione di sviluppo dell'occhio in tempo reale.
Espansione sul lavoro precedentemente pubblicato,6,7,20 il modello migratore delle cellule della cresta neurale è stata descritta usando la fluorescenza multi-fotone time-lapse di imaging su linee di zebrafish transgenici etichettati con la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo trascrizionale di SRY (regione dideterminazione Y)-scatola 10 (sox10) o Forkhead Box D3 nelle regioni regolatrici del gene (foxd3). 21 , 22 , 23 , 24. fluorescenza multi-fotone time-lapse imaging è una tecnica potente che combina le avanzate tecniche ottiche di microscopia con lungo l'eccitazione di fluorescenza di multi-fotone lunghezza d'onda di catturare immagini ad alta risoluzione, tridimensionale di esemplari con fluorofori etichettati di scansione laser. 25 , 26 , 27 l'uso del laser multi-fotone presenta chiari vantaggi rispetto la microscopia confocale standard, tra cui aumentata del tessuto vaginale e candeggio fluoroforo in diminuzione.
Utilizzando questo metodo, due popolazioni distinte delle cellule della cresta neurale varia in tempi di migrazione e percorsi migratori erano cellule della cresta neurale discriminata, vale a dire foxd3-positivo nel mesenchima periocular e occhio in via di sviluppo e le cellule di cresta neurale sox10-positivi nel mesenchima craniofacial. Con questo metodo, viene introdotto un approccio per visualizzare la migrazione della migrazione oculare e craniofacial cresta neurale in zebrafish, che lo rende facile osservare regolamentato dalla cresta neurale migrazione in tempo reale durante lo sviluppo.
Questo protocollo fornisce informazioni per la generazione di video time-lapse durante lo sviluppo iniziale di occhio in Tg (sox10:EGFP) e zebrafish transgenici Tg (foxd3:GFP), ad esempio. Questo protocollo possa essere applicato per la visualizzazione ad alta risoluzione, tridimensionale, in tempo reale dello sviluppo iniziale di qualsiasi struttura oculare e craniofacial derivato dalle cellule della cresta neurale in zebrafish. Inoltre, questo metodo possa essere applicato per la visualizzazione dello sviluppo di altri tessuti ed organi in zebrafish e altri modelli animali.
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Representative Results
Time-lapse imaging multi-fotone di fluorescenza generata una serie di video che ha rivelato i modelli di migrazione delle cellule neurali craniche della cresta che danno origine alle strutture craniofacial e segmento anteriore dell'occhio nel Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) linee di zebrafish. Ad esempio, sox10 -positivo dalla cresta neurale cellule tra 12 e 30 hpf migrano dal bordo del tubo neurale nella regione craniofacial (Video 1, Figura 2). Le cellule dal mesencefalo e prosencefalo migrano dorsale e ventrale all'occhio in via di sviluppo per popolare il mesenchyme periocular. Inoltre, queste cellule positive sox10 -formano il processo frontonasale. Cellule della cresta neurale del romboencefalo migrano ventralmente e danno luogo agli archi pharyngeal. Time-lapse di imaging di foxd3-positivo dalla cresta neurale cellule tra 30 e 60 hpf hanno mostrato che queste cellule migrarono tra la Coppa ottica e superficie ectoderma e attraverso la fessura oculare (Video 2, Figura 3). Questi foxd3-cellule positive si fusero intorno alla lente, formando nello stroma dell'iride.
Figura 1 . Programma di installazione. R. ogni componente dell'embrione apparecchi, tra cui il bagno aperto camera, adattatore di piattaforma e fase di cambio rapido di montaggio. B. montaggio della camera bagno aperto. C. aggiunta di soluzione di agarosio 2% (60-70 ° C) alla camera di bagno aperto. D. posizionamento dell'embrione nella camera di bagno aperto sotto un microscopio a fluorescenza. E. embrione (24 hpf) posizionati lateralmente al centro della soluzione di agarosio polimerizzato nel vano bagno aperto. F. aggiunta di media alla superficie della soluzione di agarosio polimerizzato per coprire completamente l'embrione nella camera di bagno aperto. G. camera bagno aperto collocato nella piattaforma di scambio veloce e posizionato nell'adattatore della fase. H. posizionamento dell'embrione Montaggio apparecchi sul palco del microscopio multi-fotone. Cassetta di sicurezza Laser I. . Sono indicate le porte scorrevoli (1 e 2) per il riempimento della camera aperta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Rappresentante deconvoluti e max-proiettate immagini da immagini time-lapse a multi-fotone di un Tg (sox10:EGFP) embrioni di zebrafish da 12 a 30 hpf. Le cellule positive sox10migrarono dal prosencefalo (P) e mesencefalo (M) per popolare il mesenchima periocular (il cerchio tratteggiato indica l'occhio) e il processo frontonasale (freccia aperta). Sox10 -cellule positive del romboencefalo (R) migrano ventralmente per formare gli archi pharyngeal (freccia chiusa). Immagini sono state ottenute ogni 20 min durante il lasso di tempo e cucite insieme per creare Video 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Rappresentante deconvoluti e max-proiettate immagini da immagini time-lapse a multi-fotone di un Tg(foxd3:GFP) embrioni di zebrafish da 24 a 48 hpf. Foxd3 -cellule positive inserite nell'alloggiamento anteriore dell'occhio (l'asterisco indica lente) tra la superficie ectoderma e ottica cup, con altre cellule localizzate per la dorsale ("D")-posteriore quadrante ("P") rispetto alla anteriore ("A") e ventrale quadranti ("V"). Inoltre, foxd3 -cellule positive migrarono adiacente e attraverso la fessura oculare. Immagini sono state ottenute ogni 20 min durante il lasso di tempo e cucite insieme per creare Video 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Rappresentante deconvoluti e max-proiettate immagini da immagini time-lapse a multi-fotone di un Tg(foxd3:GFP) embrioni di zebrafish da 30 a 60 hpf. Foxd3 -cellule positive inserite nell'alloggiamento anteriore dell'occhio (cerchio punteggiato esterno denota i bordi periferici dell'occhio, interno cerchio tratteggiato indica lente) tra la superficie ectoderma e ottica cup, con altre cellule localizzate per la dorsale ("d")-posteriore quadrante ("p") confrontato con l'anteriore ("a") e quadranti ventrale ("v"). Inoltre, le cellule positive foxd3 -migrarono adiacente e attraverso la fessura oculare (punta di freccia bianca indica la migrazione dalla cresta neurale, linea rossa tratteggiata delimita fessura oculare). A 60 hpf, foxd3-cellule positive completamente circondato la lente (frecce chiuse), che indica la chiusura della fenditura. Inoltre, a 60 hpf, foxd3 è stata espressa anche nei fotorecettori (Punta aperta), che non è stata associata con l'espressione di questo fattore di trascrizione in cellule neurali della cresta. Immagini sono state ottenute ogni 20 min durante il lasso di tempo e cucite insieme per creare Video 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1. Video time-lapse di un Tg (sox10:EGFP) embrioni di zebrafish da 12 a 30 hpf. L'asterisco indica l'occhio. Per favore clicca qui per scaricare questo video.
Video 2. Video time-lapse di un Tg (foxd3:GFP) embrioni di zebrafish da 24 a 48 hpf. L'asterisco indica la lente. L'asterisco indica la fessura oculare. d, dorsale; v, ventrale; p, posteriore; a, anteriore. Per favore clicca qui per scaricare questo video.
Video 3. Video time-lapse di un Tg (foxd3:GFP) embrioni di zebrafish da 30 a 60 hpf. L'asterisco indica la lente. La freccia indica la fessura oculare. d, dorsale; v, ventrale; p, posteriore; a, anteriore. Per favore clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Time-lapse di immagini multi-fotone consente il monitoraggio in vivo di popolazioni cellulari transitori e migratori. Questa potente tecnica può essere utilizzata per studiare i processi embrionali in tempo reale, e nello studio presente, i risultati di questo metodo ha migliorato la conoscenza attuale di sviluppo e migrazione delle cellule neurali della cresta. Precedenti studi di imaging time-lapse in genere utilizzano la microscopia a scansione laser confocale. 29 , 30 , 31 , 32 qui, presentiamo l'uso di una tecnica multi-fotone, che ha molti vantaggi rispetto al tradizionale microscopia confocale. La base di multi-fotone microscopia è che due fotoni di lunghezze d'onda a infrarossi sono usate per eccitare il fluoroforo. Di conseguenza, c'è meno dispersione e quindi sfondo in diminuzione, consentendo più profonda penetrazione del tessuto, raggiungendo profondità imaging superiori a 1 mm in tessuto biologico con rilevazione più efficiente di microscopia confocale. Queste proprietà anche diminuiscono la fototossicità, che è una considerazione importante con acquisizione di immagini ripetute e frequenti. 25 , 26 , 27 da queste proprietà, microscopia del due-fotone può immagine preparazioni intero-organo e tessuto in modelli di piccoli animali, (ad esempio topi, embrioni di zebrafish a 12 hpf - come nel caso del presente studio). Inoltre, questi modelli animali piccoli consentono uso di proteine fluorescenti geneticamente codificate, che può essere localizzato nel tessuto di interesse. Così, l'uso di microscopia di multi-fotone può migliorare notevolmente acquisizione immagine per esperimenti di time-lapse.
Ci sono numerosi punti in questo protocollo, che dipendono dal tipo di sistema di Multi-photon laser e di rilevamento in uso. Maggior parte dei problemi con questo protocollo con le impostazioni di laser e acquisizione di immagini in base al sistema di rivelazione utilizzato. Una conoscenza di funzionamento del sistema individuale e accesso al supporto tecnico sono critici. Inoltre, precedente esperienza con microscopia a scansione laser confocale è utile per la risoluzione dei problemi. Inoltre, il sistema iniziale potrebbe richiedere molto tempo. Tuttavia, una volta completato il sistema istituito, solo piccoli aggiustamenti sono in genere necessarie quando si utilizzano le stesse linee transgeniche.
Nello studio presente, gli embrioni di zebrafish fra 12 e 60 hpf sono stati utilizzati per questi esperimenti. Durante questa fascia di età, gli embrioni sono piccoli, facilmente incorporati in agarosio e prontamente anestetizzati con tricaina. Tuttavia, gli embrioni possono diventare crescita e ritardo inerente allo sviluppo a seconda della durata dell'esperimento. Pertanto, si deve prestare attenzione per assicurare che l'embrione è opportunamente messo in scena alla fine dell'esperimento.
Time-lapse di immagini multi-fotone produce una visualizzazione ad alta risoluzione, tridimensionale, in tempo reale della migrazione cellulare, che non solo migliora la capacità di studiare in vivo l'embriogenesi di zebrafish, ma può anche essere applicato a molti altri sistemi. Il protocollo descritto si concentra sulla migrazione delle cellule neurali della cresta di zebrafish, questa tecnica può essere facilmente adattata per altri scopi di formazione immagini.
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Disclosures
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente attraverso borse di studio dal National Eye Institute del National Institutes of Health (K08EY022912-01) e Vision Research Core (P30 EY007003).
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Thomas Schilling per gifting gentilmente il pesce di Tg (sox10:eGFP) e Mary Halloran per gifting gentilmente il pesce(foxd3:GFP) Tg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope - FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
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