Summary
I denne artikel beskrives en protokol for storstilet axenic isolation og samling af fritsvømmende miracidia af den menneskelige blod fluke Schistosoma mansoni og deres efterfølgende behandling for indslæbning i vitro kultur.
Abstract
Humant blod flukes, Schistosoma spp., har en kompliceret livscyklus, der involverer ukønnet og seksuel udviklingsmæssige faser inden for en snegl mellemliggende og pattedyr slutvært, henholdsvis. Evnen til at isolere og opretholde de forskellige livscyklus faser under i vitro kultur betingelser har høj grad lettet undersøgelser af de cellulære, biokemiske og molekylær mekanismer regulere parasit vækst, udvikling og vært interaktioner. Transmission af schistosomiasis kræver ukønnet formering og udvikling af flere larve faser inden for sneglen vært; fra den smitsom miracidium, gennem primær og sekundær sporocysts, at cercarial slutfase, er smitsom for mennesker. I dette papir præsenterer vi en trinvis protokol for masse rugeæg og isolation af Schistosoma mansoni miracidia fra æg fra lever af inficerede mus, og deres efterfølgende indslæbning i vitro kultur. Det forventes, at den detaljerede protokollen vil tilskynde nye forskere til at engagere sig i og udvide dette vigtige område af schistosome forskning.
Introduction
Menneskelige blod flukes Schistosoma spp., er de udløsende agenter for Bilharziose, et forsømt tropisk sygdom hærger en anslåede 230 millioner mennesker over hele verden1. Den mest udbredte arter, Schistosoma mansoni, er geografisk fordelt i Sydamerika, det caribiske øhav, Mellemøsten og Sahara Afrika2. S. mansoniog andre schistosomes livscyklus er kompleks, der omfatter et pattedyr endelige vært og ferskvand snegle af slægten Biomphalaria , der tjener som obligat mellemliggende værter.
S. mansoni mandlige og kvindelige voksne orm par lever i de posteriore mesenteriallymfeknuderne vener i pattedyr vært reproducere, hvilket resulterer i frigivelse af befrugtede æg (embryoner) at blive indgivet i de lille venules af tarmslimhinden. Æg og derefter bryder igennem fartøj vægge, vandrer gennem slimhinden væv, og til sidst indtaste intestinal lumen, hvor de er annulleret med afføring. Når æg ind ferskvand og fritsvømmende larver (miracidia) hatch, skal, de i korte orden, finde en egnet Biomphalaria sneglen at inficere for at fortsætte sin livscyklus. Denne infektion proces indebærer miracidial tilknytning til sneglens ydre kroppens overflade efterfulgt af aktive penetration og løsning af larve i værten. Snart efter indrejse begynder miracidium at kaste sin ydre ciliated epidermal plader, så det danner en syncytium, der bliver den nye ydre overflade (tegument) af den næste larve fase, den primære eller mor sporocyst. Gennem ukønnet formering, hver primære sporocyst producerer og frigiver en anden generation af sporocysts, kaldes sekundær eller datter sporocysts, som til gengæld genererer og frigive store mængder af de endelige intramolluscan stadium, cercaria3 . På flugt fra sneglen vært er fritsvømmende cercariae i stand til at vedhæfte til og trænge direkte ind i huden af en menneskelig eller andre egnede pattedyr vært. Træder i deres ny vært cercariae omdanne den parasitære schistosomula fase og invadere det vaskulære system. De, til gengæld vandrer til lungerne og derefter til leverens vene hvor de modnes til voksne orme, danne par mandlige og kvindelige og rejse til mesenteriallymfeknuderne vener til at fuldføre deres livscyklus.
Vellykket intramolluscan eller "sneglen fase" udvikling af larve schistosomes er afgørende for fortsættelsen af cyklussen af menneskelig vært til vært transmission. Er de følgende Lagerperiodeposter af de fritsvømmende miracidium ind i sneglen vært og dens tidlige transformation til den primære sporocyst fase af afgørende betydning. Afhængigt af den fysiologiske og immunologiske kompatibilitet mellem vært og parasit er det i denne fase af larve udvikling denne første succes eller fiasko at etablere infektioner er fast besluttet på4,5,6 . Efterfølgende udvikling af primær sporocysts kan ukønnet producere sekundære sporocysts, som derefter generere menneske-infektiøst cercariae, kræver desuden en eftergivende fysiologiske værtsmiljøet, der sørger for alle de parasittens vækst og reproduktiv brug.
Til dato har lidt er kendt om de underliggende fysiologiske, biokemiske og molekylære processer, der kontrollerer schistosome-sneglen interaktioner, især molekyler og veje er involveret i regulering af larve udvikling og reproduktion, eller modulerende værten immunrespons. Klar adgang til store mængder af disse larver faser under i vitro kultur betingelser, som tillader eksperimentelle manipulation ville i høj grad lette opdagelsen af udviklingsmæssige veje og underliggende mekanismer for cellevækst, differentiering og reproduktion. Kritiske parasit veje eller mekanismer, identificeret gennem in vitro- eksperimenter, kan derefter bruges, forstyrre larve vækst/reproduktion i sneglen vært eller identificere sneglen vært immun mekanismer involveret i anerkendelse og afskaffelse af miracidial eller sporocyst etaper.
I denne artikel og video-præsentation, vi giver en detaljeret beskrivelse af en metode til at isolere stort antal fritsvømmende S. mansoni miracidia for indslæbning i vitro kultur, der kan blive udsat til opfølgning eksperimentelle manipulation (Se figur 1 for en skematisk oversigt over arbejdsprocessen protokol). Selv om lignende procedurer er blevet beskrevet tidligere7,8,9, vi følte, at en detaljeret protokol vil være nyttig for forskere, der ønsker at ansætte denne model til at løse stadig ubesvarede spørgsmål relateret til intramolluscan larve udvikling, cellulære spredning og schistosome-sneglen immun interaktioner. Denne tilgang kan desuden nemt tilpasses til isolation af æg fra andre lægeligt vigtigt trematodes såsom blære-bolig S. haematobium, leveren flukes eller lunge flukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrs pleje og eksperimentelle procedurer blev godkendt af institutionelle dyrs pleje og brug Udvalget af University of Wisconsin-Madison under protokollen ingen. V005717. Følgende protokol omfatter arbejder i en biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) facilitet for menneskelige patogener, selv om ingen af de schistosome stadier afbildet i denne protokol er smitsom for mennesker eller andre pattedyr. Følg institutionelle politikker til håndtering af risiko gruppe 2 (RG2) menneskelige patogener.
Bemærk: Vi bruger kvindelige Swiss-Webster mus (6 - uger gamle) på grund af deres højere modtagelighed for infektion10, hvilket giver større æg byrder. Tucker et al. beskriver mus og sneglen infektion protokoller, der bruges i denne model systemet11. Tabel af materialer lister alle specifikke udstyr, materialer, reagenser og animalske kilder skal varetage denne forsøgsplan.
1. behandling af inficerede lever
- Aflive mus, 6-7 uger efter infektionen, af CO2 kvælning (sats på 10-30% af kammerets volumen pr. minut). Overvåge mus til ophør med åndedræt og hjerterytme.
Bemærk: Typisk op til 20 mus kan blive behandlet på et givet tidspunkt. - Efter overføre aflivede mus til en biosikkerhed kabinet, placere mus på ryggen og spray deres ventrale overflader med 70% ethanol. Lad blød i 1 min.
- Knivspids og trækker op huden af den nederste del af maven og går på tværs i bunden af den sammenklemte hud tættest på maven med en steril kirurgiske saks. Trække afskårne huden anteriorly (dvs, mod hovedet) at afsløre leveren. Bemærk, at leveren bør udvides og plettet på grund af en æg-induceret granulomatøs reaktion (figur 2A).
- Fjerne leveren og placere den i et bægerglas, der indeholder 200 mL sterilt 1,2% NaCl opløsning indeholdende pen/strep.
- Gentag trin 1.3 og 1.4 med resterende mus.
Bemærk: Tyve mus behandles normalt i en enkelt høst. - Placer Leverne i en steril petriskål og fjerne ikke-lever fedt/bindevæv med steril pincet.
- Overføre trimmet/renset lever til en steril 250 mL centrifugeres flaske der indeholder ~ 200 mL sterilt 1,2% NaCl opløsning med pen/strep.
- Energisk Ryst flasken indeholder lever, og ved hjælp af et sterilt engangs pipette, Fjern den overskydende overflade skum/flydende vragrester. Langsomt hæld den resterende saltvandsopløsning ind i en beholder eller synke indeholdende 1% blegemiddel (desinfektionsmiddel).
- ~ 200 mL frisk saltopløsning tilsættes til lever og Gentag trin 1.8 tre flere gange.
2. lever udvinding og miracidial isolation
- Læg lever i en lille sterile rustfrit stål blenderen kop og tilføje ~ 2 mL 1,2% NaCl opløsning (figur 2B).
- Dække cup med folie og en petriskål til at forhindre udslip, og blend i 1 minut ved vekslende lav og høj hastighed (20 s lav hastighed/10 s høj hastighed, repeat) (figur 2 c).
- Jævnt blandet lever suspension i sterile 250 mL centrifugeres flasker (til 20 lever 4 flasker).
- Tilføje sterilt saltvand med antibiotika til ~ 200 mL samlede volumen/flaske. Veje/balance flasker inden centrifugering.
- Centrifuge blandet lever ved 290 x g i 15 min. ved 4 oC. forsigtigt hæld supernatanter i en beholder med blegemiddel forud for udsmid.
- Gentag trin 2,4-2,5 én gang. Vær sikker på at grundigt resuspend lever sediment inden centrifugering.
- Efter kassering sidste saltvand vask (trin 2.6), tilsættes 200 mL sterilt Dam vand med pen/strep pelleted levervævet, ryste resuspend sediment, og overføre suspension til en steriliseret 1 L målekolbe, der har været helt dækket med aluminium folie, undtagen øverst 3 cm af halsen (figur 2D).
Bemærk: Brug to flasker (= 10 lever) per 1 L målekolbe. Dam vand simulerer ferskvand naturen behov for at stimulere miracidial klækning af æg. - Brug af sterile Dam vand, fylde kolben til ca 3 cm over folien dækker på halsen. Derefter, uden forsinkelse (som miracidia snart begynde at luge), fjerne resterende skum og levervævet flyder på overfladen af hurtigt pipettering op ~ 12 mL Dam vand indeholdende debris og kassere det i et særskilt kassér tube. Erstatte med frisk sterile Dam vand.
- Gentag rengøring trin 2.8, yderligere tre gange, kontrol for tilstedeværelse af miracidia i udsmid tube. Ophøre med gentagelse af rengøring skridt, hvis miracidia vises i Vaskeopløsningen.
- Efter den sidste vask, tilsættes langsomt ~ 12 mL varm sterile Dam vand (pre-hjertelig til 30 oC) for at oprette en temperaturgradient med rene og sterile varmt vand på toppen.
Bemærk: Dette er bedst opnås ved langsomt udleder vand langs siden af kolbens hals til at undgå at blande. - Placer en lille petriskål dække over kolbens åbning og skinne en lys over toppen af kolben over dækslet folie til at belyse den øvre overflade af vand.
Bemærk: Typisk, indenfor 5-10 min, svømning miracidia, tiltrukket af lys, vil koncentrere sig i stort tal inden for de første 2-3 cm Dam vand (figur 3A).
3. Miracidial høst og dyrkning
- Når miracidia har tjent på overfladen efter 10 min, ved hjælp af en steril overførsel pipette, fjerne ~ 8 mL Dam vand og overførsel til en steril 15 mL centrifugeglas. Placer røret indeholder miracidia på is.
- Tilføje tilbage 8 mL varm sterile Dam vand langs indersiden af den målekolbe og vente en anden 10 min.
- Ved hjælp af nye rør hver gang, Gentag trin 3.1 og 3.2 tre flere gange. Efter samlingen 4th , holde det endelige rør i isbad i 10 min at tillade miracidia at afgøre. Dette sæt rør består af den første høst.
- Centrifugeglas indeholdende miracidia 290 x g i 1 min på 4 oC i en pre afkølede nedkølet centrifuge.
- Straks at fjerne de fleste af supernatanten (~ 7 mL) være omhyggelig med ikke at forstyrre parasit pellet (figur 3B).
- Pool alle miracidia fra denne første høst i en tube, så skyl alle af de oprindelige rør med ~ 1 mL sterilt Dam vand og tilføje til de "samles" tube.
- Tillad parasitter at bosætte sig på isen for ~ 5 min, og igen centrifugeres parasitter på 290 x g i 1 min på 4 oC.
- Omhyggeligt Fjern supernatanten og tilsæt 6-8 mL sterilt Chernin afbalanceret saltopløsning (CBSS +, se tabel af materialer) indeholdende pen/strep.
- Forsigtigt suspendere miracidia og prøve dem i en 24-godt kultur plade (1 mL pr. brønd), efterfulgt af skylning røret i 6-8 mL CBSS + og tilsætning af 1 mL af skyl til hver brønd. Inkuber parasitter på 26 oC normoxic betingelser. Koncentrationer af isolerede miracidia vil variere, men vil normalt gennemsnit ~ 7000/mL.
- Hvis parasitter stadig koncentreret på lyskilden, Gentag trin 3.1 til 3,9 fortsat høster sent-rugeæg miracidia men øge tidsintervallet mellem samlinger til 15-20 min.
Bemærk: Denne nye sæt rør repræsenterer den anden høst. Men fordi miracidial numre typisk er lav, larver fra alle rør normalt sammenlægges i en fælles kultur godt indeholdende 2 mL CBSS +. - På 24 timer efter høst og dyrkning, forsigtigt resuspend sporocysts i deres brønde af pipettering.
- Vente et par minutter til at tillade parasitter at bilægge til bunden af brøndene. Når de har afgjort, forsigtigt fjerne supernatanten (~1.5 mL), som vil indeholde de fleste af ciliated epidermal pladerne udgydt af miracidia under larve transformation. Denne "transformation" supernatanten kan enten kasseres eller indarbejdet i follow-up studier af larve sekretoriske produkter.
- Tilsættes 1,5 mL frisk CBSS + til hver brønd og forsigtigt pipette til resuspend sporocysts. Gentag trin 3.12 hvis yderligere vask eller skifte til et andet medium ønskes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Størstedelen af miracidia vil typisk være opsamlet i de to første "høsten". Inkubation af isolerede miracidia i CBSS + udløser miracidium til sporocyst transformationsproces (Figur 4A- C). Inden for den første time wells følgende overførsel til kultur, som indeholder CBSS +, fleste af miracidia cease svømning (figur 4A). På 6 h i kultur er miracidia ved at aktivt udgyde deres ciliated epidermal plader (figur 4B). Sammenfaldende med denne udgydelse processen, larver danne deres ydre syncytial tegumental dækker som de forvandler til primære sporocysts. De fleste af parasitterne vil have afsluttet larve transformation, bliver fuldt dannet sporocysts, af 24-48 h efter dyrkning i CBSS + (figur 4 c). Efter 4 dage af kultur i CBSS + alene, kan sporocyst overlevelse forventes at falde til ~ 80%. Dog sporocysts kulturperler i 1 dag i CBSS + og derefter overført til komplet Bge (cBge) medium for 3 dage typisk resultere i bedre overlevelse og larver med en mere robust udseende (figur 4D). Sporocyst levedygtighed generelt forbliver stabil mellem 4 og 7 dage i cBge med fortsatte stigning i larve vækst i løbet af denne tid i kultur i forhold til CBSS + alene.
Figur 1 . Oversigt over protokollen arbejdsproces. Skematisk oversigt over de vigtigste trin involveret i isolering og dyrkning af miracidia stammer fra mus inficeret med den menneskelige blod fluke, S. mansoni. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Behandling af de inficerede lever. (A) mus lever stærkt inficerede med S. mansoni æg. Bemærk den udvidede størrelse, unormal farve og tilstedeværelsen af granulomer i inficerede leveren (højre) i forhold til en normal uinficeret leveren (venstre). (B) Washed mus lever efter overførsel til sterile rustfrit stål blender cup. Lever blev derefter blandes i et minut ved hjælp af steril folie og petriskål til at dække cup, så man undgår spild (C). Efter blanding, blev den lever homogenatet, der indeholder æg, vasket flere gange i saltvand og genopslemmes i sterilt Dam vand, før de overføres til en 1 L målekolbe dækket med alufolie (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Høst S. mansoni miracidia. Aktivt svømning miracidia koncentreret ved tiltrækning til lys i toppen af målekolbe (A). Med 10 min mellemrum, er parasitter høstet med pipette og placeret ved 4 ° C til at immobilisere larver. Miracidia er derefter vaskes i CBSS + ved centrifugering og indsamles i en enkelt rør (B) lige før distribution til wells af en kultur plade. CBSS +; Chernins afbalanceret saltopløsning (Tabel af materialer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Miracidial transformation til primære sporocysts og deres vedligeholdelse in vitro- . S. mansoni miracidia og sporocysts placeret i in vitro- kultur til forskellige tidspunkter efter høst. Nyligt fældet miracidia inden for 1 h af kultur i CBSS + (A). Efter 6 h af kultur, er miracidia begyndt at kaste deres ciliated epidermal plader (pile), som de forvandler til primære sporocysts (B). Efter 24 h i CBSS + har de fleste af miracidia fuldstændig forvandlet til primære sporocysts (C). Sporocysts blev omdannet i CBSS + i 24 timer, og derefter overført og vedligeholdes i cBge medium for 3 dage (D). Sporocysts generelt vises mere robuste og har højere overlevelsesrate på 4 dage efter dyrkning i cBge, i forhold til CBSS + alene. CBSS +, Chernins afbalanceret saltopløsning; cBge medium, komplet B. glabrata embryonale celler medium (Se Tabel af materialer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miracidia af S. mansoni, isoleret og manipuleres som beskrevet heri, kan inficere kun sneglen mellemliggende værten, og udgør derfor ikke en menneskelig biohazard i denne fase af larve udvikling. Men, for at undgå utilsigtet eksponering/infektion af snegle, pleje bør tages til at udføre miracidial isolering i et andet sted fra områder, hvor modtagelige Biomphalaria sneglen arter kan være til stede eller vedligeholdt. Et separat rum, registreret som BSL2 rum, er stærkt anbefales. Endvidere er alle vask løsninger, der anvendes i behandlingen af lever, rogn og larver isolation skal behandles med desinfektionsmiddel (fx, 1% blegemiddel) inden bortskaffelse.
Det skal bemærkes, at kirurgisk fjernelse af lever fra inficerede mus og deres efterfølgende forarbejdning inden blanding/homogenisering er udført i en biologisk sikkerhed kabinet (BSC) under aseptiske forhold. Men af praktiske grunde (lethed i manipulere bulk prøver) alle andre procedurer er gjort på en desinficeret benchtop udnytter sterile beholdere (f.eks., blender kopper, flasker, flasker og rør, overførsel pipets, osv.) og sterile løsninger indeholdende antibiotika (saltvand, Dam vand, CBSS). Antibiotika er tilføjet alle løsninger som en yderligere sikkerhedsforanstaltning mod indførte mikrobiel kontaminering. Desuden, under miracidial isolationen og høst trin (protokollen afsnit 2 og 3), er en lille petriskål dækning placeret over kolbens åbning for at minimere udvendige forurening under indledende fjernelse af skum/leveren debris og efterfølgende overdragelse af koncentreret miracidia fra kolben til centrifugeres rør.
Typisk, vi høster miracidia fra 20 inficerede mus lever i en enkelt sending, hvorfra vi anslår larve udbytter af omkring 5000 larver pr. leveren. Udbytter kan imidlertid variere betydeligt afhængigt af infektion intensiteten af individuelle mus resulterer i batch til batch variationer i miracidial inddrivelser. Isolering kan udføres ved hjælp af færre start lever, selv om metoden vi har beskrevet er generelt gældende for 10-20 lever. Når 20 lever behandles, efter den endelige resuspension af leveren pellets i sterile Dam vand (protokoltjenesten 2, trin 2.7), skal suspensioner fordeles ligeligt i to 1000-mL målekolber (2 flasker/kolbe). Hvis der anvendes 10 lever eller færre, den oprindelige lever homogeniseret (protokollen afsnit 2, trin 2.3) kan distribueres til 2 flasker og vasket suspensioner derefter overføres til en enkelt målekolbe til videreforarbejdning. Et eller 2 lever også kan blive behandlet, men mængder (mængder) af udvinding, vask og rugeæg løsninger bør nedsættes forholdsmæssigt, med endelige vasket sediment i Dam vand overføres til en 10-mL folie-dækket målekolbe at koncentrere sig miracidia.
For at maksimere miracidial udbytter med et minimum af leveren vragrester forurening, er det også vigtigt at udføre Dam vand vasker (protokollen afsnit 2, trin 2,7-2.9), som hurtigt og effektivt som muligt. Når æggene er udsat for Dam vand, opstår miracidial rugeæg snart derefter, selv om tiden før larve udseende på lyskilden i kolbens hals kan variere fra 5-20 min efter klækning påbegyndes. For at begrænse tabet af parasitter under Dam vand rengøring vask trin er det afgørende at visuelt kontrollere hver Dam vand for tidlige ankommende miracidia i øvre vandet lag af kolbens hals. Desuden, når miracidia er overført til 15 mL indsamling rør og anbringes på is, vil de ophøre med svømning aktiviteter og bilægge til rør bunden. Men efter centrifugering til pellet larver (afsnit 3, trin 3.4-3.5), miracidia vil igen begynde at svømme hvis vand er tilladt at varme. Derfor er det vigtigt at fjerne Dam vand hurtigt, men uden at forstyrre pelleten eller pipettering op svømning parasitter.
Som tidligere nævnt, udbyttet af isolerede miracidia kan variere afhængigt af antallet af voksne orm par stede i individuelle mus (infektion intensitet) og konsistens af initiale infektion protokoller. Miracidia er stærkt fototropiske og fleste (80-90%) vil fokusere på lyskilden for første høst perioden. De resterende 10-20% af miracidia vil fortsætte med at klække og mere ophobes langsomt i den anden periode, høst. Mest (> 95%) miracidia indført i kultur og vedligeholdes på 26 oC i CBSS + medium vil have omdannet til primære sporocysts inden for 24-48 h dyrkning. På dette tidspunkt, er larver levedygtighed typisk > 90%. Efter 4 dage i CBSS + alene levedygtighed falder betydeligt (70-80%). Dog resulterer skifter næringssubstratet fra CBSS + at fuldføre Bge medium 24 h følgende indledende CBSS dyrkning i højere overlevelsesrate og mere robuste vækst. Vi opretholde rutinemæssigt kortsigtede sporocyst kulturer under normoxic forhold. Men sporocysts er nok så nærtagende ilt niveauer, og især reaktive ilt arter, der kan påføre skadelig oxidative skader7. C.J. Bayne4 og andre har rapporteret, at den generelle sundhed og levedygtighed af sporocysts i vitro er væsentligt forbedret når kulturer vedligeholdes hypoksiske betingelser. Sænket ilt niveauer kan opnås ved gasning (med kvælstof) individuelle lukbare kolber eller nitrogen-berigelse af gasfasen af inkubator4.
Som citeret ovenfor, metoder til axenic isolering og dyrkning af schistosome miracidia og sporocysts er blevet beskrevet tidligere. Det var anerkendt tidligt at miracidial Fototropisme kunne anvendes til at tiltrække og koncentrere svømning larver og det isolerede miracidia kunne være hurtigt immobiliseret i hyperosmotic saltopløsninger (mellem 120-160 mOs/Kg)8. Det blev yderligere observeret, at vedligeholdelse i saltopløsninger resulterede i omdannelsen af miracidia til primære sporocysts, den første intramolluscan larve stadie9,12. Komplekse medier er også blevet formuleret for at støtte langsigtede in vitro- vækst og udvikling af S. mansoni sporocyst etape9,13,14,15, samt celler afledt af sneglen vært Biomphalaria glabrata16. Disse formuleringer indarbejdet forskellige kommercielle medier, og kan have været suppleret med aminosyrer, salte, lipider, reduktionsmiddel og sukker. Komplet media formuleringer omfattede også varme-inaktiverede føtal kvæg eller hest serum i forskellige koncentrationer. Vi har fundet, at ordentlig varme-inaktivering (HI) blev afgørende for sporocyst overlevelse og langsigtet udvikling i vitro. Vi fandt at inkubation af serum (optøede, 100 mL flasker) i vandbad 60 oC for 60 min, med blide blanding hver 10 min for ensartet varme var mest effektive. Derudover tester vi normalt flere masser af serum fra en kommende leverandør for larver kultur kompatibilitet. Endelig, oprettelsen af den første (og i øjeblikket kun) autentiske smeltevandstemperatur cellelinje, B. glabrata embryonale (Bge) cellelinie af Hansen16 var et stort gennembrud, at den væsentligt lettere forskud i larve schistosome dyrkning indsats. Isoleret S. mansoni miracidia, når placeret ind i fælles kultur med Bge celler udviklet sig fra primær til sekundær/datter sporocysts17, og i sidste ende til cercarial slutfase18,19. Således er løbende i vitro dyrkning af hele sneglen fase af livscyklus S. mansoni opnået. Bge celle mediet bruges i vores kultur system understøtter både sporocyst vækst/udvikling og vedligeholdelse af Bge cellelinie.
Sammenfattende har vi beskrevet og visuelt illustreret en detaljeret protokol til masse axenic isolering og dyrkning af S. mansonifritsvømmende miracidial etape. Disse miracidia, når de udsættes for passende dyrkningsbetingelser, er i stand til at udvikle til flere på hinanden følgende primære og sekundære sporocyst generationer, og til sidst cercariae. Med den udvikling og løbende forfinelse af værktøjer, der i øjeblikket findes for at manipulere med gener og gen expression in vitro- gennem transgene, RNA-interferens og genom redigering (f.eks. CRISPR/Cas9) tilgange, det er forestillede sig så effektiv metoder til isolering og dyrkning af miracidia fra forskellige trematode arter20 vil fortsætte med at være nødvendig for at skaffe materialer til yderligere fremme af forskning i dette felt. Denne metode pænt supplerer en tidligere beskrevne protokol til isolering og dyrkning fritsvømmende cercariae af S. mansoni at lette in vitro- transformation til pattedyr schistosomula fase21, for eventuel dyrkning til ovigerous voksne orme22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Delvis finansieret af NIH grant RO1AI015503. Schistosome-inficerede mus blev leveret af NIAID Bilharziose Resource Center på Biomedical Research Institute (Rockville, MD) gennem NIH-NIAID kontrakt HHSN272201000005I for distribution gennem BEI ressourcer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S.
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
