Presenteras här är ett protokoll för provtagning av mänsklig placenta villösa vävnad följt av isolering av cytotrophoblasts för primär cellkultur. Behandling av trofoblaster med TNFα recapitulates inflammation i feta intrauterin miljö och underlättar upptäckten av molekylära mål regleras av inflammation i moderkakor med moderns fetma.
Moderns fetma är associerat med en ökad risk för negativa perinatala utfall som sannolikt medieras av nedsatt placenta funktion som kan hänföras till, i del, dysreglering av autofagi. Avvikande förändringar i uttrycket av autofagi tillsynsmyndigheter i moderkakor från feta graviditeter kan regleras av inflammatoriska processer i samband med både fetma och graviditet. Beskrivs här är ett protokoll för provtagning av villösa vävnad och isolering av villösa cytotrophoblasts från termen placenta hos människa för primär cellkultur. Detta följs av en metod för att simulera den inflammatoriska miljön i feta intrauterina miljön genom att behandla primära trofoblaster från lean graviditeter med tumörnekrosfaktor alfa (TNFα), en proinflammatoriska cytokiner som är förhöjd i fetma och graviditet. Genom genomförandet av protokollet som beskrivs här, är det funnit att exponering för exogena TNFα reglerar uttrycket av Rubicon, en negativ regulator av autofagi, i trofoblaster från lean graviditeter med kvinnliga foster. Medan en mängd biologiska faktorer i den feta intrauterina miljön upprätthålla potential att modulera kritiska vägar i trofoblaster, är detta ex vivo -system särskilt användbara för att avgöra om uttryck mönster observerade i vivo i mänsklig moderkakor med moderns fetma är ett direkt resultat av TNFα signalering. Slutligen, detta tillvägagångssätt ger möjlighet att tolka ut reglerings- och molekylär konsekvenserna av inflammation i samband med moderns fetma på autofagi och andra kritiska cellulära vägar i trofoblaster som har potential att påverka placenta funktion.
Fetma är en inflammatorisk tillstånd som kännetecknas av kronisk låggradig inflammation, följd av överskott adipose vävnad och näringsämnen tillgänglighet. Fetma, är proinflammatoriska cytokiner förhöjda i metabola vävnader samt systemiskt i omlopp. En robust mängd bevis har visat att TNFα betydligt är förhöjda i inställningen av fetma med konsekvenser i insulinresistens och metabolisk dysfunktion1. Aktivering av TNFα bidrar också till sjukdomspatogenes vid sjukdomar som cancer och autoimmunitet, vilket gör det till ett attraktivt terapeutiska mål2.
Inflammation i fetma förvärras av graviditet, också en proinflammatoriska tillstånd3,4. Det har tidigare visat att placenta TNFα innehåll ökar med moderns adiposity i graviditeter med kvinnliga foster. Dessutom hämmar TNFα behandling mitokondriell andning i kvinnliga men inte manliga trofoblaster celler, vilket tyder på att TNFα är involverad i reglering av placenta metabolism i en könsdimorfisk sätt5. Moderns fetma är associerade med den ökade förekomsten av en mängd komplikationer under graviditet, inklusive stillbirth, med manliga foster är mest mottagliga3,6,7,8 . På grund av dess nyckelroll vid maternell-fetal gränssnittet, kan förändringar i den funktionella kapaciteten hos placentan hos överviktiga intrauterina miljön svar på inflammatoriska signalering spela en viktig roll i att förmedla resultaten av feta graviditeter.
Cytotrophoblasts och syncytiotrophoblasts i villösa vävnaden av moderkakan är kritiska för endokrin signalering och näringsämnen och syre utbyte mellan mor och utveckla fostret9. Störningar i den funktionella kapaciteten av villösa cytotrophoblasts (hädanefter benämnd trofoblaster) kan äventyra fostrets hälsa och utveckling. Det här protokollet beskriver en metod för provtagning av villösa vävnad från mänskliga termen moderkakan genom att dissekera bort koriongonadotropin och basala plattorna tillsammans med en optimerad förfarande för isolering av trofoblaster för primär cellkultur. Detta protokoll härleds från etablerade metoder som involverar enzymatisk nedbrytning av villösa vävnad att släppa celler från den extracellulära matrixen följt av differentiell densitet centrifugering att isolera trofoblaster10, 11,12. Detta protokolldetaljer ett tillvägagångssätt där primära trofoblaster från moderkakor från lean graviditeter behandlas med kultur media kompletteras med TNFα att simulera en komponent i den inflammatoriska miljön förknippas med maternell övervikt. Slutligen beskrivs ett enkelt förfarande för skörd summacell lysates från TNFα-behandlade trofoblaster följt av Western blotting för att påvisa förändringar i genuttryck.
Medan denna modell inte sammanfatta fetmafrämjande i livmodern miljön i dess helhet, ger det ett kontrollerat system som gör att man kan tolka enskilda bidrag av TNFα-medierad inflammation i den trofoblaster svar på moderns fetma. Denna modell ger både möjlighet att upptäcka eller bekräfta molekylära mål direkt regleras av TNFα signalering i trofoblaster samt gör att man kan testa om förändringar i genen uttrycksmönster observerats i vivo i moderkakor med maternell fetma kan vara ett resultat av TNFα-medierad inflammation.
Den metod som beskrivs här genomfördes för att testa effekten av TNFα-medierad inflammation på regleringen av autofagi i mänskliga trofoblaster. Trofoblaster från feta graviditeter med manliga foster uppvisar störde autophagic omsättning eller autophagosome mognad13. Ett protein som kallas Rubicon (kör domän protein Beclin1-interagera och cystein-rika innehållande), som är lokaliserad till lysosomer och sena endosomes, har nyligen beskrivits som en ”broms” i processen autophagic omsättning eftersom det fungerar som en negativ regulator autophagosome mognad14,15. I själva verket är Rubicon ett sällsynt exempel på ett protein som hindrar autofagi, vilket gör det ett värdefullt terapeutiska mål. Det finns mycket lite information om patofysiologiska betydelsen av Rubicon, utom dess roller i medfödda immunsvaret mot antimikrobiella16,17 och hjärtmuskelcellen skydd18. Med hjälp av protokollet som beskrivs här, visar det sig att Rubicon är uppreglerad i kvinnliga primära trofoblaster svar på behandling med ökande koncentrationer av TNFα upp till 250 pg/mL. Regleringen av Rubicon kan spela en roll i hur kvinnliga foster fare bättre än män i graviditeter med moderns fetma. Går igenom inflammation i samband med moderns fetma ex vivo genom att exponera människors trofoblaster att exogena TNFα ger en plattform för att studera effekterna av feta intrauterina miljön på regleringen av kritiska vägar i trofoblaster och i förlängningen, placenta funktion.
Placenta, ansvarar för att reglera tillväxten av fostret, uppvisar nedsatt funktion i feta miljö6. Trots de höga metaboliska krav av trofoblaster uppvisar moderkakor med moderns fetma dysfunktionella mitokondriell respiration6,19. Förändringarna i placenta metabolism kan bidra till den ökade förekomsten av komplikationer och biverkningar fostrets utfall hos överviktiga graviditeter3,<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka kvinnor som donerade sin moderkakor för denna studie. Vi tackar också det arbete och leverans avdelningen på OHSU och mödra och fostrets forskargrupp för att samordna insamling av moderkakor. Vi är tacksamma att Eric Wang, Ph.D., och Kelly Kuo, VD för stöd och hjälp med experimentella metoder och optimering.
Detta arbete var finansierad av NIH HD076259A (AM) och AHA GRNT29960007 (AM).
10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
6 well plates | Corning | 353046 | |
Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |