Summary
Denne protokollen beskriver hvordan å stimulere celler med mitokondrie-avledet peptider og vurdere signalnettverk cascade og lokalisering av phospho-proteiner.
Abstract
Mitokondrielt-avledet peptider (MDPs) er en ny klasse av peptider som kodes ved små åpent lesing rammer i andre kjente gener i mitokondrie genomet. MDPs har et bredt spekter av biologiske effekter som beskytter neurons fra apoptose, forbedre metabolske markører og beskytte celler fra kjemoterapi. Humanin var den første MDP å bli oppdaget og er den mest studerte peptid blant MDP familie. Av membran reseptorer og nedstrøms signalveier av humanin har blitt nøye preget. Flere MDPs som MOTS-c og SHLP1-6 har oppdaget nylig og signalnettverk mekanismer har ennå å bli belyst. Her beskriver vi en celle kultur basert metode for å bestemme funksjonen av disse peptider. Spesielt tillate celle fraksjoneres teknikker i kombinasjon med vestlige blotting kvantitative fastsettelse av aktivisering og translokasjon av viktig signalnettverk molekyl. Det finnes andre metoder for celle fraksjoneres, er beskrevet her en enkel og grei metode. Disse metodene kan brukes til å belyse ytterligere virkningsmekanismen av disse peptider og andre terapeutiske agenter.
Introduction
Nye studier viser at mitokondrie-avledet peptider (MDPs) spille en viktig rolle i cytoprotection og metabolisme1,2,3. Forstå signal signaltransduksjon veien i nærvær av MDPs gir oss innsikt i mekanismen som MDPs modulerer ulike funksjoner. Den første identifiserte MDP, humanin, har vist seg å øke ekstracellulære signal regulert kinase 1/2 (ERK1/2) fosforylering gjennom reseptor bindende4,5. Nedstrøms virkningen av ERK1/2 aktivisering er imidlertid fortsatt underexplored.
ERK1/2 kaskade fungerer som en viktig megler i en rekke cellulære prosesser inkludert spredning, celle migrasjon, cellenes stoffskifte, overlevelse og apoptose6,7,8. For å organisere alle reguleres disse ulike cellulære prosesser, aktivitet og subcellular lokalisering av ERK1/2 tett av phosphatases og stillaset proteiner9,10. I tillegg til post-translasjonell modifikasjon regulerer det dynamiske skytteltrafikk av ERK1/2 også sin signalnettverk funksjon, aktivitet og spesifisitet11,12. ERK1/2 er hovedsakelig lokalisert i stoffer13. Et sett med forankring og stillaset proteiner hjelpe beholde ERK1/2 i cellen cytoskjelett elementer, på overflaten av organeller eller diffust i cytoplasma13. Ved stimulering, ERK1/2 er fosforylert og blir skilt fra sin forankring proteiner, slik at translokasjon av ERK1/2 til andre subcellular rom, inkludert kjernen, mitokondrier, Golgi og lysosomer14, 15 , 16.
Selv om humanin er kjent for å aktivere den ERK1/2 signalveien, er aktivering av ERK1/2 bare observert i totalt-cellen lysates. Som beskrevet tidligere, siden ERK1/2 subcellular lokalisering spiller en avgjørende rolle i sin nedstrøms effekt, analyse av både den subcellular lokaliseringen og totale nivåer av er fosforylert ERK1/2 nødvendig for å gi en omfattende forståelse humanin-indusert ERK1/2 aktivisering og aktivering av nedstrøms mål.
For å forstå målet organeller aktivert ERK1/2, ble subcellular fraksjoneres etterfulgt av vestlige blotting fosforylert ERK1/2 utført. Denne metoden kan implementeres enkelt som det benytter standard laboratorieutstyr og reagenser. Isolerte subcellular seksjonene er av høy renhet, slik at resultatene tolkes oversiktlig. Immunostai-av ERK1/2 kan gi lignende resultater. Men er visse subcellular rom relativt vanskelig å visualisere og krever spesielle fiksering og permeabilization metoder. ERK1/2 nivåer varierer i subcellular rom, og denne varianten kan føre falske positive og falske negative signaler når du ser på hele cellen lysates. Derfor gir en immunoblot med isolert subcellular rom oss en bedre forståelse av ERK1/2 lokalisering.
Allsidigheten til metoden gjør endringer av protokollen for å undersøke effekten av andre sentralstimulerende stoffer inkludert andre MDPs eller translokasjon av andre signalnettverk molekyler som STAT3. Nylig er oppdaget små humanin-lignende peptider (SHLPs) kodet fra 16S rRNA regionen der humanin er kodet, og de har lignende, men forskjellige egenskaper sammenlignet HN17. For eksempel aktivere SHLP2 og SHLP3 ERK1/2 etter 8 timer selv om humanin aktiverer ERK1/2 i 5 min. undersøke subcellular lokalisering av ERK1/2 forskjellige peptider som svar vil gi oss en bedre forståelse av biologi av disse peptider. Nye bevis viste at den subcellular lokaliseringen signalnettverk molekyler spiller en avgjørende rolle i deres nedstrøms effekter. For eksempel STAT3 tradisjonelt er kjent for å være hovedsakelig lokalisert i stoffer i hvile celler, og deretter det translocates til kjernen å aktivere genuttrykk svar cytokiner18. STAT3 også translocates til mitokondrier og regulerer TCA syklus og ATP produksjonen19. Om autophagy regulering modulerer forskjellige subcellular lokalisering av STAT3 autophagy i ulike måter20. For eksempel kjernefysiske STAT3 transcriptionally regulerer autophagy-relaterte gener og fungerer som en autophagy-modulator. Cytoplasmatiske STAT3 hemmer constitutively autophagy av samspill med autophagy signalnettverk molekyler. Mitokondrielt STAT3 hemmer og hindrer mitophagy ved å undertrykke oksidativt stress indusert autophagy. Denne subcellular kupé isolasjon metoden er derfor avgjørende for forståelsen av andre signalnettverk molekyler i tillegg til ERK1/2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. peptid behandling celler
- Plate to millioner SH-SY5Y eller HEK293 celler (2 x 10 6) i en 10 cm rett og vokse dem for 2 dager
- (valgfritt) neste dag, vaske cellene med serum-free Dulbecco ' s endret Eagle Medium (DMEM) media når og Inkuber med serum gratis DMEM over natten hvis behandlingen må gjøres i serum frie medier.
- På dag 3, oppløse S14G-humanin-peptider i 0,2 µm filtrert, destillert vann og gjeninnføre dem som 1mM lagerløsning.
Merk: Peptidene skal oppløses i det aktuelle løsemiddelet, som kan bestemmes av rekkefølgen kjennetegner peptid (f.eks, total kostnad) og kan leveres av produsenten hvis peptidene er kommersielt tilgjengelig. For eksempel løses S14G-humanin, SHLP2, og SHLP6 og MOTS-c i vann. Aliquot peptider i et riktig volum (f.eks, 50 μL) for å unngå fryse og tine sykluser. Når tint, ikke bruker dem igjen. - Aliquot den forvarmes serum inneholder eller serum-frie medier i en 50-mL konisk rør og legge til romtemperatur 1 mM lagerløsning for å gjøre det til en fungerende konsentrasjon (f.eks, 1 µM, 10 µM).
- Erstatte media med 6 mL peptid løsning fra trinn 1.4. og Inkuber cellene for det aktuelle tid.
Merk: Velge inkubasjon tid avhengig av din tilstand som aktiverer ERK.
2. Subcellular fraksjoneres for stoffer og kjernen
- vask cellene to ganger med 10 mL av iskalde PBS skrape cellene av platen i 5 mL av iskalde PBS og overføre celle suspensjon i en 15 mL konisk tube.
- Sentrifuge cellene på 500 x g i 5 min på 4 ° C.
- Sug opp PBS og å avbryte pellet 200 µL av iskalde, fraksjoneres buffer (10 mM HEPES pH = 7.6, 3 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 5% (v/v) glyserol, 1% ikke-ioniske surfactant (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) n), protease/fosfatase hemmere).
Merk: for å holde proteiner i fosforylering statusen, den fosfatase inhibitor som samt protease hemmer burde være fersk addert og eksempler bør holdes på is hele tiden. Gjenta freeze- og thaw sykluser av prøver bør unngås. Aliquot prøver i lite (f.eks 50 μg) før fryse dem på-80 ° C. - Ruge re suspendert pellet på isen i 15 min og deretter virvel 250 x g i 5 min på 4 ° C.
- Samle nedbryting som de cytoplasmatiske brøken og holde pellets for kjernefysisk brøken.
- Sentrifuge nedbryting for å fjerne mobilnettet rusk og andre forurensninger på 18 000 x g i 10 min på 4 ° C og deretter overføre nedbryting til en ny microcentrifuge tube. Dette er stoffer brøken.
- Resuspend pellet i 200 μL iskald vaskebuffer (10 mM HEPES pH = 7.6, 1,5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glyserol, 0.2 mM EDTA, protease/fosfatase hemmere) og sentrifuge 250 x g for 5 min på 4 ° C
- Fjerne nedbryting og resuspend pellet 100 μL iskald, kjernefysiske utvinning buffer (20 mM HEPES pH = 7.6, 1,5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glyserol, 0.2 mM EDTA, protease/fosfatase hemmere) og sonicate 10 ganger (5 s på, 10 s av, 30% amp.) på ice.
- Sentrifuger 18.000 x g i 10 min på 4 ° C.
- Overføre nedbryting til en ny microcentrifuge tube. Dette er en kjernefysisk brøkdel.
- Kvantifisere protein beløpet hjelp en BCA analysen
3. råolje mitokondrie brøkdel
- vask cellene i hver 10 cm rett med 10 mL iskald PBS, legge til 5 mL iskald PBS og koble celler ved hjelp av en celle skraper.
Merk: Bruk tre 10 cm retter av celler for å få en god avkastning av mitokondrier for Western Blotting. - Overføre celle suspensjon slik 15 mL koniske og kombinere alle fra tre 10 cm retter i en 15 ml konisk tube.
- Sentrifuge cellene på 600 x g i 10 min 4 ° C.
- Sug opp PBS og å suspendere pellet i 1 mL av iskalde mitokondrier isolasjon buffer (10 mM Tris-MOPPER, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM sukrose, justere pH = 7.4).
- Homogenize cellene med 25 strøk med en 2 mL homogenizer med polytetrafluoroethylene belagt støter på ice.
Merk: Dette trinnet er avgjørende for å opprettholde mitokondrie integritet og maksimere avkastningen av mitokondrie brøken. De skal være optimalisert for hver celle. Nedkjøling i homogenizer før du starter prosedyren. - Overføre homogenate til et microcentrifuge rør og sentrifuge det 600 x g i 10 min på 4 ° C fjerne kjerner og ubrutt celler.
- Samle nedbryting, overføre det til en ny microcentrifuge tube og sentrifuge det 7000 x g i 10 min 4 ° C.
NOTE Pellet er løs, samle nedbryting med forsiktighet og prøver ikke å forstyrre pellet. - Fjerne nedbryting, nytt utsette pellets med 200 μL iskald mitokondrier isolasjon bufferen og overføre løsningen til en ny microcentrifuge tube. Sentrifuge røret 7000 x g i 10 min 4 ° C.
- Gjenta trinn 3.8 å vaske pellet. Det er ikke nødvendig å overføre nedbryting til en ny microcentrifuge tube i dette trinnet.
- Fjerne nedbryting fra vasket pellets og re suspendere pellet inneholder mitokondrier med 50 μL RIPA bufferen.
- Incubate suspensjon på is 10 min.
- Sentrifuge suspensjon 16.000 x g i 15 min 4 ° C.
- Overføre nedbryting til en ny microcentrifuge tube. Dette er en mitokondrie brøkdel.
- Kvantifisere protein beløpet hjelp en BCA analysen.
4. Western Blotting for Phospho-spesifikke proteiner
- utføre en SDS-polyakrylamid gel geleelektroforese (8-16% forhåndslagde gel) og overføre protein til en PVDF membran 4.
- Ruge membranen med 5% BSA i TBST (0,1% polysorbat 20) i 30 min ved romtemperatur å blokkere bakgrunn uspesifisert bindende.
Merk: For fosforylert proteinet oppdagelsen, blokkere membranen med BSA ikke melk. Melk inneholder kasein, en rikelig fosfoprotein som, som resulterer i høy uspesifikke signalet. - Ruge membranen med det primære antistoffet (anti-phospho-ERK1/2) på 4 ° C over natten.
- Neste dag, vaske membranen med TBST (0,1% polysorbat 20) tre ganger i 5 minutter ved romtemperatur.
- Ruge membranen med sekundær antistoff (anti-kanin HRP) 1t ved romtemperatur.
- Vask membranen med TBST (0,1% polysorbat 20) tre ganger i 5 minutter ved romtemperatur.
- Ruge membranen ECL løsning og image membranen i bildet analyzer.
- Strip membranen med stripping buffer i 15 min ved romtemperatur og vask membranen med TBST tre ganger i 5 min.
- Gjenta trinn 4.2 til 4.7 bruke anti-totalt ERK1/2 antistoffer.
- For å sjekke renheten av hver fraksjon, kjøre SDS side og utføre immunoblots ved hjelp av antistoffer gjenkjenner markører for hvert kammer (f.eks ved B1 for kjernen, GAPDH for stoffer, og TOM20 for mitokondrier).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, vi behandlet HEK293 og SH-SY5Y celler med 1 μM og 100 μM, S14G-humanin, en potent humanin analoge21, i komplett media for de angitte tidsrommene (figur 1A og figur 1 B). vi så undersøkt total og fosforylert form av ERK1/2 på Thr202/Tyr204 fra total protein ekstrakter. S14G-humanin-behandling viste økning i fosforylering ERK1/2 på sin regulatoriske Thr202/Tyr204 området. Den subcellular lokaliseringen av ERK1/2 spiller en viktig rolle i sin signalnettverk funksjon, spesielt i å få sine spesifisitet. For å forstå målet for S14G-humanin-mediert ERK1/2 aktivisering, vi analysert den subcellular lokaliseringen av totalt og fosforylert ERK1/2 etter S14G-humanin behandling. I HEK293 celler, phosphorylated ERK økt i begge cytoplasma og kjernen, men ikke i mitokondrier (figur 2A). Interessant, redusert fosforylert ERK i cytoplasma, kjernen og mitokondrier i SH-SY5Y celler (figur 2B). Disse resultatene tyder på at S14G-humanin-mediert ERK fosforylering kan spille en annen rolle i ulike celletyper og ulike forhold. Derfor videre studier er nødvendig å analysere lokalisering av S14G-humanin-mediert fosforylering av ERK1/2 i andre subcellular avdelinger, som fosforylert ERK1/2 translocates til kjernen, mitokondrier, endosomes/lysosomer, og ulike membraner.
Figur 1: S14G-humanin øker fosforylering ERK1/2 i HEK293 og SH-SY5Y celler. Kvantifisering og representant vestlige blots ERK aktivisering i (A) HEK293 og (B) SH-SY5Y celler. Totalt celle lysates etter (A) 1 µM eller (B) 100 µM S14G-humanin behandling i DMEM med 10% FBS for angitt tidsperioder var immunoblotted med anti-phospho - og totalt-ERK 1/2 (Thr202/Tyr204). Dette tallet har blitt endret fra Kim et al. 4 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Fosforylert ERK1/2 er lokalisert stoffer, kjernen og andre subcellular avdelinger på S14G-humanin behandling i HEK293 og SH-SY5Y celler. Representant vestlige blots viser ERK1/2 subcellular lokalisering (n = 3). (A) HEK293 celler ble behandlet med 1 µM S14G-humanin. Cytosolic (15 µg), kjernefysiske (15 µg og 50 µg), og mitokondrie (15 μg) lysates var immunoblotted bruker phospho - og totalt-ERK antistoff. (B) SH - SY5Y celler ble behandlet med 100 µM S14G-humanin. Mitokondrielt fraksjoner ble innhentet 30 min etter S14G-humanin behandling. Cytosolic, kjernefysiske og mitokondrie (15 µg) lysates var immunoblotted bruker phospho - og totalt-ERK antistoff. Anti-GAPDH, Anti-ved B, anti-Tom20 antistoff ble brukt som cytosolic, kjernekraft, mitokondrie brøkdel markører, henholdsvis. Dette tallet har blitt endret fra Kim et al. 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Bufferne for stoffer, kjernekraft, og mitokondrie fraksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viste vi at humanin peptid-mediert ERK1/2 aktiveringen skjer i to forskjellige celletyper, og den subcellular lokaliseringen av aktivert ERK1/2 kan være forskjellig avhengig av forholdene (f.eks, dose peptid, tidspunkt og celle type). Det har vist at humanin signalene via to forskjellige reseptorer22,23, noe som kan forklare forskjellene i signalering mellom de to linjene samt behovet for forskjellige doser av humanin. Fysiologiske implikasjonene av dette har ikke blitt fullt studert, men det kan tyde på en mulig mekanisme for vev avhengige Svar å HN.
Fosforylering ERK1/2 spiller en avgjørende rolle i ERK1/2 signalering og fosforylering status ERK1/2 viser dynamiske endringer. Det er viktig å optimalisere forutsetninger for å finne når ERK1/2 er fosforylert under en bestemt betingelse/stimulans. For å oppnå dette, prøve forskjellige stimulering forhold (f.eks, dose og middels) og gjennomføre tiden kurs å finne når høyeste fosforylering oppnås. Et flertall av studier har bare fokusert på ERK1/2 fosforylering i totalt-cellen lysates. Resultatene kan imidlertid gi begrenset funksjonell informasjon ERK1/2 kan samhandle med ulike mål og modulere forskjellige nedstrøms kaskader i bestemte subcellular rom. Derfor gir undersøke den subcellular lokaliseringen av fosforylert ERK1/2 en bedre forståelse av rollen som ERK1/2 aktivisering.
Subcellular fraksjoneres etter ERK1/2 aktivering kan brukes som en kilde til videre studier (f.eks, co-immunoprecipitation) til å identifisere romanen nedstrøms mål fordi den subcellular fraksjoneres kan berike for nedstrøms mål av ERK1/2. Denne metoden kan brukes til andre signalnettverk molekyler som er translocated i ulike subcellular rom på stimuli etter optimalisering av betingelsene.
Selv om ulike metoder for å isolere mitokondrier foreslått i de siste tiårene, er det delvis forurensning fra andre subcellular avdelinger. Råolje mitokondrie isolasjon metoden foreslått her inneholder også begrenset mengde cytoplasma forurensninger. Mengden av forurensning er liten, anser vi at det er fortsatt en gyldig metode for å oppdage lokaliseringen av ERK1/2 i mitokondrier ved aktivering. Som peptider ikke er nødvendigvis stabil i løsningen, er det noen ganger vanskelig å opprettholde konsekvensen mellom eksperimenter. Husk å gjøre små dele peptid løsning å unngå fryse-Tin effekter og forbedre konsistensen av peptid aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Pinchas Cohen er aksjonær og konsulent for CohBar, Inc. Kelvin Yen har fungert som konsulent for CohBar, Inc.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Ellison/AFAR postdoktorstipend i aldring forskningsprogram som SJK, og en Glenn Foundation Award og NIH tilskudd til PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Alle forfattere vises i filmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
References
- Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
- Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
- Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
- Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
- Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).
- Cagnol, S., Chambard, J. -C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
- Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
- Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
- Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
- Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
- Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
- Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
- Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
- Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
- Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
- You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
- Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).
