Summary
Forståelse af indflydelsen af miljømæssige organochlorin pesticider (OCPs) på mitokondriel funktion i hepatocytes er vigtigt at udforske mekanismen af OCPs forårsager metaboliske lidelser. Dette papir præsenterer detaljerede metoder til påvisning af hepatisk mitokondriel funktion.
Abstract
Dette papir præsenterer detaljerede metoder til påvisning af hepatisk mitokondriel funktion for en bedre forståelse af årsagen til metaboliske lidelser forårsaget af miljømæssige organochlorin pesticider (OCPs) i hepatocytter. HepG2-celler blev eksponeret for β-hexachlorcyclohexan (β-HCH) i 24 timer ved en tilsvarende dosis intern eksponering i den almindelige population. Ultrastruktur i hepatocytter blev undersøgt ved transmission elektron mikroskopi (TEM) for at vise skaderne af mitokondrier. Mitokondriel funktion blev yderligere evalueret ved mitokondriel fluorescensintensitet, adenosin 5'-tripfosfat (ATP) niveauer, iltforbrug (OCR) og mitokondrielle membran potentiale (MMP) i HepG2 celler inkuberet med β-HCH. Mitokondrier fluorescens intensitet efter plettet af mitokondrielle grønne fluorescerende sonde blev observeret med en fluorescens mikroskopi. Luciferin-luciferase-reaktionen blev brugt til at bestemme ATP-niveauerne. MMP blev opdaget af det kationiske farvestof JC-1 og analyseret under flow cytometri. OCR blev målt med en ekstracellulær flux analysator. Sammenfattende, disse protokoller blev brugt til at opdage mitokondriel funktion i hepatocytes med at undersøge mitokondrier skader.
Introduction
Virkningerne af organiske chlorpesticier (OCP' er) på sundheden,1,2,f.eks. e.g. Metoderne til at opdage cellulære stofskifte og finde ud af mitokondriel dysfunktion har gjort det muligt for forskerne at forstå den rolle, mitokondrielle funktion(dvs., mitokondrielSTAT3 niveauer, laktat, pyruvat, laktat-til-pyruvat ratio, coenzym Q10, mitokondrielle proton lækage, bioenergeti, biogenese, og dynamik) på områder som aldring, fedme, diabetes, hjerte-kar-funktion, kræft, og sikkerhedtoksicitet 4,5,6,7. I dette dokument beskriver vi metoderne til vurdering af mitokondriel dysfunktion forårsaget af OCPs.
Vi eksponerede HepG2-celler for β-hexachlorcyclohexane (β-HCH), en repræsentativ OCPs, i 24 timer ved en dosis svarende til intern eksponering af mennesker. For det første blev TEM anvendt til at observere hepatocytternes ultrastruktur, såsom kerner, mitokondrier og endoplasmatisk reticulum8. Sammenlignet med almindelige mikroskoper gør TEM det muligt at udforske 2D- og 3D-ultrastrukturen af celler og cellekomponenter (cellelinjer eller væv), morfologien, den kemiske sammensætning samt funktionen af naturlige eller kunstige materialer, der spiller en central rolle i moderne videnskab og teknologi. Mitokondriel funktion blev yderligere evalueret ved mitokondriel fluorescensintensitet, adenosin 5'-tripfosfat (ATP) niveauer, iltforbrug (OCR) og mitokondrielle membran potentiale (MMP) i HepG2 celler inkuberet med β-HCH. Mito-tracker grøn er en mitokondrier grøn fluorescerende sonde, der kan bruges til levende celle mitokondrielle-specifikke fluorescerende farvning. Mitokondrierne i hepatocytter blev plettet af mito-tracker grøn opløsning og mitokondrielle fluorescens intensitet, antal og mønster blev observeret med en konfokal mikroskopi9. Mitokondrielle grønne fluorescerende sonde kan bruges til at plette levende celler. Sammenlignet med rhodamin 123 eller JC-1, mitokondrielle grønne fluorescerende sonde afhænger ikke af mitokondrielle membran potentiale for mitokondriel farvning. ATP niveauer blev bestemt af en luciferase-luciferin kit og normaliseret ved proteinkoncentration. ATP assay kit kan bruges til at opdage ATP niveauer i fælles løsninger, celler eller væv. Dette kit er baseret på firefly luciferase katalyseret af fluorescein at generere fluorescens, når ATP er forpligtet til at levere energi. Når firefly luciferase og fluorescein er overdreven, i en vis koncentration rækkevidde, generering af fluorescens er proportional med koncentrationen af ATP. Desuden er dette kit specielt designet til at optimere chemiluminescens af ATP. ATP, som de vigtigste energimolekyler, spiller en vigtig rolle i de forskellige fysiologiske eller patologiske processer i celler. Ændringer i ATP-niveauer kan afspejle fejl i cellefunktionen, især mitokondriel energiproduktion. Normalt under apoptose, nekrose eller i nogle giftige tilstand, cellulære ATP niveauer reduceret 10. MMPs assay kit med JC-1 er et kit, der bruger JC-1 som en fluorescerende sonde til at opdage celler, væv eller renset MMPs hurtigt og følsomt. Det kan bruges til tidlig påvisning af apoptose. Det kationiske farvestof JC-1 er en fluorescerende sonde, der anvendes til at detektere MMP, som kan analyseres under flowcytometri angivet ved ændringer af grønt og rødt fluorescensforhold. Når MMP er høj, er JC-1 aggregeret i matrix af mitokondrier til at danne en polymer (J-aggregater), som producerer rød fluorescens. Når MMP er lav, JC-1 kan ikke akkumulere, og danner monomer, der producerer grøn fluorescens11. Så forholdet mellem rød og grøn fluorescens kan afspejle niveauet af MMP. OCR af celler er en afgørende indikator for normal cellulær funktion12. Det betragtes som et parameter til forskning mitokondrielle funktion. Cell mito stress test kit giver en stabil metode til at analysere centrale parametre for mitokondrielle funktion. Sættet giver kvalitetskontrol og prædiktive reagenser samt en standard metode til at udføre celle mitokondrielle stresstest. Det kan bruges til at detektere alle celletyper, herunder primære celler, cellelinjer, suspenderede celler, og også for holme, nematoder, gær og isolerede mitokondrier.
OCR-måling kan give værdifuld indsigt i cellernes fysiologiske status eller ændringer. Det blev bestemt med en ekstracellulær flux analysator til at opdage vejrtrækning baseline, proton lækage, maksimal respiratorisk, ATP omsætning og reservekapacitet. Kort sagt, efter baseline målinger af OCR, OCR blev påvist efter sekventielt at tilføje til oligomycin (ATP Coupler), FCCP (mitokondriel oxidativ fosforylation uncoupler) og antimycin A/rotenon (en hæmmer af iltforbrug) per brønd.
I et forsøg på at lette udviklingen af mere specifik protokol til påvisning mitokondriel funktion i hepatocytter in vitro, præsenterer vi her eksperimenter med TEM, konfokal mikroskopi, luminometer, flow cytometri og ekstracellulære flux analysator med fremtidig anvendelse i at studere mitokondrier skader relaterede negative resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter og forsøgsprotokollerne blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og bestemmelser og godkendt af det lokale etiske udvalg ved Nanjing Medical University.
1. Mitokondriel ultrastruktur af TEM
- Indsamling HepG2 celler
- Frø HepG2 celler i 100 mm retter. Opbevares ved 37 °C og 5% CO2.
- Fordøje celler med 0,25% EDTA i 1,5 mLEP rør.
- Centrifuge ved 1000 x g i 3 min. ved stuetemperatur (RT). Kassér supernatanten.
- Saml 4-6 x 105 HepG2 celler.
- Der tilsættes 1 ml 5 % glutaraldehyd (opløsningsmiddel: dobbelt destilleret vand) med pipetter og inkuberes ved 4°C i 2 timer.
- Der tilsættes og vaskes i 4 ændringer af 1 ml fosfatbuffer (indeholdende Na2HPO4, KH2PO4,NaCl og KCl, pH 7,4), 15 min hver. Suge fosfat buffer med pipetter.
- Der tilsættes 200 μm 1% osmium (opløsningsmiddel: dobbelt destilleret vand) og inkuberes ved 4 °C i 2 timer til sort prøve.
Forsigtig: Osmium er meget giftigt og flygtigt stof. Det bør betjenes i narkoskabet omhyggeligt. - Tilsæt og vask i 2 ændringer af 1 ml fosfat buffer, 5 min hver. Suge fosfat buffer.
- Plet i 2% uranylacetatopløsning (Opløsningsmiddel: dobbelt destilleret vand og eddikesyre) i 1,5 ml EP-rør i 2 timer.
- Dehydrer og nedsænkes gennem 50% acetone, 70% acetone, 90% acetone (Solvent: dobbelt destilleret vand), 2 ændringer af absolut acetone, 15 min hver.
- Trænge ind i 2 dråber acetone (100%) / indlejring agent (1:1) for 1,5 h på RT. Epon812 indlejring agent, opskriften er som følger: A: Epon812, 62 ml og DDSA, 100 ml; B: Epon812, 100 ml og MNA 89 ml. A:B=2:8 (v:v, om vinteren), A:B=1:9 (v:v, om sommeren). Indlejring i indlejring forme (Blød plastplade med ternet gitter).
- Inkuber sekventielt ved 37 °C i 12 timer, 45 °C i 12 timer og derefter 60 °C i 48 timer.
- Forberede og observere ultratynde sektioner (det største område må ikke overstige 0,5 mm × 0,3 mm) af ultratynde sektioner maskine og TEM (2 μm og 500 nm).
2. Detektion af mitokondrielle fluorescensintensitet
- Seed 2x 104 HepG2 celler i 6-brønds plader. Der tilsættes β-HCH i 24 timer.
- Tilføj vandfri DMSO til at formulere en endelig koncentration på 1 mM mitokondrielle grøn fluorescerende sonde.
- Der tilsættes 1 ml mitokondriel grøn fluorescerende sondeopløsning (slutkoncentration: 200 nM) til hver brønd på 6-brøndplader, inkuberes ved 37 °C i 45 min.
- Mitokondriel grøn lysstofrøropløsning fjernes, og der tilsættes frisklavet cellekulturmedium (DMEM) ved 37 °C før billeddannelse.
- Overhold mitokondriel grøn fluorescens med et fluorescensmikroskop (10x). Den maksimale excitation bølgelængde ved detektion er 490 nm og den maksimale emission bølgelængde er 516 nm.
3. Analyse af de cellulære ATP-niveauer
- Frø HepG2 celler i 6-brønd plader. Der tilsættes β-HCH i 24 timer.
- Der tilsættes 200 μL lysisbuffere fra luciferase-luciferin ATP-analysesættet til hver brønd med 6-brønds plader. Centrifuge ved 12.000 x g i 5 min ved 4 °C opsaml supernatanten med pipetter i nye rør.
- ATP-detektionsreage er fortyndet med ATP-fortyndingen i et forhold på 1: 5, som ATP-detektionsbuffer.
- Bestemmelse af standardkurve: Fortyndes 0,5 mM ATP-standardopløsningen til 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 μM med ATP lysis-buffere.
- Der tilsættes 100 μL ATP-detektionsbuffer i en 96-brøndplade i 5 min. ved RT, og der tilsættes 100 μL supernatant i cellen, detekteres ved hjælp af et luminometer (chemiluminescensdetektor). DER beregnes ATP-koncentration (nmol/L) gennem standardkurven.
- Detekter proteinkoncentrationen ved hjælp af et BCA Protein Assay Kit med multimodelæser.
- Bestemmelse af standardkurve: Fortyndes 5 mg/ml proteinstandardopløsning til 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 og 0,5 mg/ml ved dobbelt destilleret vand.
- Der tilsættes 1 μL supernatant celle i en 96-brøndplade, og der tilsættes 19 μL dobbelt destilleret vand.
- Der tilsættes 200 μL BCA-detektionsløsninger til hver brønd. Inkuber ved 37 °C i 30 min. Detekter OD-værdien (optisk massetæthed) af en flermodelæser med 562 nm. Proteinkoncentrationen (mg/ml) beregnes gennem standardkurven.
- Atp-indholdet pr. mg proteinkoncentration korrigeres (enhed: ATP-koncentration/proteinkoncentration, nmol/mg).
4. Vurdering af mitokondriel membranpotentiale (MMP) af JC-1
- Saml HepG2 celler seedet i 6-brønd plader. Fordøje celler med 0,25% EDTA i 1,5 ml EP rør, centrifuge ved 1000 x g i 3 min, kassér supernatant og indsamle celler.
- Der tilsættes 50 μL JC-1 (200X) til 8 ml destilleret vand til vortex og blandes. Der tilsættes 2 ml JC-1 (5X) farvningsfarvningsbuffer som JC-1-detektionsløsning.
- Inkuber celler med en blanding af 0,5 ml cellekulturmedium og 0,5 ml JC-1 detektionsopløsning i 20 minutter ved 37 °C.
- Centrifuge ved 600 x g i 3 min. ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Skyl i 2 ændringer af 1 ml JC-1 (1X) farvning buffer, centrifuge ved 600 x g i 3 min ved 4 °C. Og kassér supernatanten.
- Suspendere celler i 0,5 ml JC-1 (1X) farvning buffer, analysere via flow cytometri at opdage grøn og rød fluorescens. Når JC-1-polymeren detekteres, indstilles excitationslyset til 490 nm, og emissionslyset til 530 nm. Når JC-1-polymeren detekteres, indstilles excitationslyset til 525 nm, og emissionslyset indstilles til 590 nm.
5. Målinger af iltforbrug (OCR)
- Frø HepG2 celler i cellekultur mikroplader af 96-brønd på en massevis af 4500 celler/100 μL per brønd. Sørg for celler dækket med hver godt efter 24 timer.
- Der tilsættes det relevante volumen af de forberedte reagenser i den relevante injektionsport i henhold til tidligere litteratur13. Port A: 25 μL 1 μM oligomycin (ATP-kobling); Port B: 25 μL 0,75 μM FCCP (elektronisk gasspjældskontrol, ETC accelerator) Port C: 25 μL 0,5 μM antimycin A/rotenon (mitokondriel inhibitor A og mitokondriel hæmmer B).
- Patronen opbevares i en 37 °C-inkubator uden CO2, før den er klar til brug.
- Lav en medium ændring af cellepladen ved at fjerne løbemediet fra hver brønd og tilføje til den nye DMEM. Endeligt volumen for hver brønd er 180 μL.
- Cellepladen opbevares i en 37 °C-inkubator uden CO2 i 1 time før analysen.
- Optag OCR automatisk af software.
- Åbn OCR-softwaren.
- Vælg Cell Mito Stress Test Kit i rullemenuen Apps.
- Klik på knappen Start app.
- Klik på knappen Kør stresstest. Skærmbilledet Opsætning af cellestresstest vises.
- Gør følgende trin:
- Indtast antallet af celler, der er seedet pr. brønd, i feltet Cellesåningseedet #
- Angiv den gennemsnitlige OCR i feltet Gennemsnitligt basal OCR.
- Den endelige arbejdskoncentration for hvert reagens ind og injicer reagenserne.
BEMÆRK: Den gennemsnitlige basale OCR-værdi for cellen skulle have været opdaget, før optimeringsanalysen køres, når der optimeres til cellesåningskoncentration. - Klik på knappen Næste. Skærmbilledet med gruppeoplysninger vises.
- Tildel en gruppe til de ikke-tildelte brønde ved at vælge en farve og give et navn, og klik derefter på de relevante brønde.
BEMÆRK: De forskellige grupper defineres som forskellige behandlinger, før cellen Mito-stresstesten køres. Alle brønde af mikroplader vil få de samme reagens injektioner, når stresstesten køres. - Klik på knappen Næste. Skærmbilledet StressTest Injection Layout vises.
- Klik på Start. Stresstesten køres nu på Analysatoren. Når løbet er overstået, skal du følge punkterne i softwaren, fjerne patronen og cellepladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mitokondrier cristae af HepG2 celler udsat for β-HCH blev markant beskadiget. Spredte mitokondrier var mildt til markant udvidet, uregelmæssigt formet, og mitokondrielle højderyg forsvandt med relativt unormal mitokondriel arkitektur (Figur 1).
Den gennemsnitlige mitokondrielle grønne fluorescensintensitet, som repræsenterer mitokondrier, faldt i HepG2-celler, der blev eksponeret for β-HCH (Figur 2) samt i ATP-niveauer (Figur 3). Fluorescensintensiteten og ATP-niveauet faldt gradvist med stigende eksponeringskoncentrationer. Reduktionen i mitokondriers antal eller beskadigede mitokondrier forårsagede potentielt den observerede mitokondrielle fluorescensintensitet og dermed den reducerede produktion af ATP.
Resultaterne af flowcytometri viste, at forholdet mellem rød/grøn JC-1 fluorescens i β-HCH-gruppen var betydeligt lavere end i kontrolgruppen (Figur 4). OCR af HepG2-celler blev reduceret på en dosisafhængig måde efter eksponering af β-HCH. Sammenlignet med kontrolgruppen faldt antallet af basale respirationsrater, protonlækage, maksimal respiratorisk kapacitet og ATP-omsætning betydeligt i HepG2-celler, der blev eksponeret for β-HCH (Figur 5). Disse resultater viste, at mitokondriel funktion var nedsat efter β-HCH eksponering.
Alle de instrumenter, der blev anvendt i disse forsøg, blev vist i supplerende figur 1.
Figur 1: Repræsentative TEM-mikrografer af HepG2-celler, der eksponeres for β-HCH (A: 6000×, B: 25000×). Typiske skader viste mildt forstørret mitokondrier (M), elektron-lucent matricer, beskadiget cristae og løse organelle huller. M: mitokondrier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Påvisning af mitokondriel fluorescens i HepG2-celler behandlet med β-HCH13. Mængden, placering og fluorescensintensiteten af mitokondrier (A) blev vist i fluorescensmikroskopiske billeder, og kvantitative niveauer af mitokondriel fluorescensintensitet var baseret på mitokondrielle grønne fluorescerende pr. celle (B). *: P < 0,05, ***: P < 0,001 sammenlignet med styringen. Hvert datapunkt var det gennemsnitlige ± SEM fra tre separate forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: ATP-niveauer i HepG2-celler13. ***: P < 0,001 sammenlignet med kontrolelementet ##: P < 0,01 sammenlignet med 10 ng/ml β-HCH.Data blev præsenteret som gennemsnitlig ± SEM af tre separate eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Virkninger på MMP ved JC-1 farvning og flowcytometri13. (A) Flow cytometri plots. Y-aksen viste forholdet mellem rød og grøn fluorescens. PE: Rød fluorescens, FITC: Grøn fluorescens. (B).**: P < 0,01 sammenlignet med styringen. Hvert datapunkt var det gennemsnitlige ± SEM fra tre separate forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Påvisning af cellulært iltforbrug (OCR). (A) Effekten af β-HCH på cellulær OCR blev målt af den ekstracellulære fluxanalysator. De fire perioder repræsenterer cellulære basalrespirationshastighed, ATP-syntasehæmmet hastighed, maksimal frakoblet hastighed og rotenon-eller antimycin-A-hæmmet hastighed. B) Kvantitative histogrammer af OCR-resultater for baseline, protonlækage, maksimal respiratorisk kapacitet, ATP-omsætning ogreservekapacitet. *: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001 sammenlignet med kontrolelementet. Hvert datapunkt var det gennemsnitlige ± SEM fra tre separate forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Alle de instrumenter, der anvendes i protokoller. (A) Transmission elektron mikroskopi. (B) Laserscanning konfokal mikroskop. (C) Luminometer. (D) Multimode læser. (E) Flow cytometri. (F) Ekstracellulær flux analysator. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Afgørende for detektionsprotokollens succes er brugen af en række forsøgsmetoder, der er blevet dækket undersøgelsen fra fænotype til mekanisme. I denne undersøgelse blev HepG2-celler dyrket i DMEM med penicillin og streptomycin og 10% føtalt kvægserum. Når cellerne nåede 40-50% sammenløb, β-HCH (0, 10, 100 ng/ml) blev tilføjet og inkuberet i 24 timer. Vi brugte for det første TEM, som viste de ultrastrukturelle ændringer i hepatocyte forårsaget af de repræsentative OCPs, β-HCH, viser forringelse af mitokondrier struktur (Figur 1). Desuden blev fluorescerende farvestofanalyse (figur 2), luciferase-luciferin ATP-analyse (figur 3), JC-1-analyse (figur4) og celle mito stresstestanalyse (figur 5),somalmindeligvisvurderer mitokondriers dysfunktion, udført. Disse resultater danner grundlag for undersøgelse af de underliggende molekylære mekanismer.
I ovenstående metoder, efterforskere bør være opmærksomme på forholdsregler i nogle trin. For eksempel, ved fremstilling af elektronmikroskopicelle, bør antallet af celler være opmærksomme, for at undgå dårlig fiksering forårsaget af for stort væv eller celleblok. 5% glutaraldehyd fungerer som fiksativ, er det bedre ikke at gemme mere end et halvt år for at undgå svigt af detektion. Faste prøver anbringes ved 4 °C i 24 timer eller op til 1 måned før næste trin. Mitokondrielle grønne fluorescerende farvestof er let at slukke, og lys bør undgås for at bremse fluorescens dæmpning. I cellulære ATP niveauer assay, når du bruger en multifunktionel luminometer, der kan detektere chemiluminescens, uigennemsigtig tavle eller whiteboard 96-brønd plader bør anvendes for at undgå gensidig interferens mellem tilstødende huller. ATP, specielt spaltning af ATP i prøven, er ikke stabil ved stuetemperatur, og erfaringen skal anvendes ved 4 °C eller på is. ATP kan være stabil på is i op til 6 timer. Ved fremstilling af JC-1 detektionsopløsning kan JC-1 farvningsfarvningsbuffer (5X) tilsættes, når JC-1 (200X) er grundigt opløst og blandet med ultrapurevandet, så JC-1 detektionsopløsningen bliver let at opløse helt. JC-1-sonden skal lastes og vaskes inden for 30 minutter og gemmes ved 4 °C eller is for at fuldføre opfølgningstesten. I OCR-målinger skal den gennemsnitlige basale OCR-værdi for cellen påvises før optimeringsanalysen, når der optimeres til cellesåningskoncentration.
Der er nogle begrænsninger af disse metoder. OCR-måling foretaget af en ekstracellulær fluxanalysator er begrænset til celleeksperimenter. Påvisning af mitokondriel funktion er ikke dyb nok, da de metaboliske produkter ved mitokondrier ikke måles, såsom måling af fedtsyrer og metabolitter i TCA-cyklusser i hepatocytter. Endvidere kan ekspressionen af gener og proteiner med hensyn til hepatisk fedtsyresyntese og nedbrydning påvises ved real-time polymerase kædereaktion og vestlige blot, som yderligere kan bekræfte de molekylære lidelser af fedtsyrer metabolisme og mitokondrielle dysfunktion13. Digitale billeder af mitokondrier kan fanges i levende celler under konfokal mikroskopi og analyseres for ændringer af mitokondriel morfologi baseret på formfaktor (FF) og billedformat (AR) værdier. Mitokondriers metaboliske funktion blev også vurderet ved måling af ekstracellulær forsuring (ECAR) ved hjælp af en bioenergetisk analysator14. Nogle mitokondrielle markørantistoffer (cytokrom c, HSP60, PHB1, SOD1, VDCA og STAT3) kan måles ved western blot4,15,16,17. Aktiviteterne i enzymer, der respekterer mitokondriel funktion og tricarboxylsyre (TCA) cyklus, såsom malisk dehydrogenase, succinate dehydrogenase, citrat syntetase, ATPase, isocitrat dehydrogenase og α-ketoglutarat dehydrogenase er dokumenteret18. Elektrontransportkædens funktion i celler og i isolerede levereokondrier påvises ved hjælp af respirometri med høj opløsning19.
Vores protokoller fokuserer på påvisning af mitokondriel morfologi, struktur, placering, mængde, kapacitet, membranpotentiale og respiratorisk kædefunktion. Disse er dybest set i stand til at vurdere mitokondrielle funktion fra forskellige aspekter. Hvad mere er, disse metoder er enkle og nemme at betjene. Mitokondrielle funktionsundersøgelser er blevet gennemført bredt på forskellige områder, såsom lever20, gut mikrobiota21,pluripotente stamceller22, og i nogle almindelige sygdomme, såsom type 2 diabetes23, Parkinsons sygdom24 og inflammatorisk tarmsygdom25. Der kan være flere sygdomme forbundet med mitokondrier, og vores protokoller kan være nyttige i undersøgelsen af relevante mekanismer. Desuden er der også behov for en yderligere empirisk arbejde med hensyn til disse virkningers omfattende og dybtgående omfang med mere eksperimentelle metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 81573174, 81570574); Den udestående ungdomsfond i Jiangsu-provinsen (SBK2014010296) det kinesiske undervisningsministeriums forskningsprojekt (213015A) den prioriterede akademiske program udvikling af Jiangsu videregående uddannelsesinstitutioner (PAPD), flagskibet større udvikling af Jiangsu videregående uddannelsesinstitutioner; og det åbne projektprogram for statens nøglelaboratorium for miljøkemi og økotoksikologi (KF2015-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
References
- Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
- Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
- Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
- Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
- Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E.
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
- Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
- Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
- Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
- Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
- Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
- Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
- Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
- Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
- Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
- Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
- Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
- Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
- Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
- Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
- Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
- Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).
