Summary
Понимание влияния экологических органохлоринных пестицидов (OCPs) на митохондриальную функцию в гепатоцитах имеет важное значение для изучения механизма OCPs вызывает нарушения обмена веществ. В настоящем документе представлены подробные методы обнаружения печеночным митохондриальной функции.
Abstract
В настоящем документе представлены подробные методы обнаружения печеночным митохондриальной функции для лучшего понимания причины метаболических нарушений, вызванных экологическими органохлоринными пестицидами (OCPs) в гепатоцитах. Клетки HepG2 подвергались воздействию гексахлороциклогексана (З-ГХГ) в течение 24 ч при эквивалентной дозе внутреннего воздействия в общей популяции. Ультраструктура в гепатоцитах была исследована с помощью электронной микроскопии передачи (TEM), чтобы показать повреждение митохондрий. Митохондриальная функция была дополнительно оценена по интенсивности митохондриальной флуоресценции, уровням аденозина 5'-трифосфата (АТФ), скорости потребления кислорода (OCR) и митохондриальному мембранальному потенциалу (MMP) в клетках HepG2, инкубированных С-ГХГ. Интенсивность митохондрий флуоресценции после окрашенных митохондриального зеленого флуоресцентного зонда наблюдалась с помощью микроскопии флуоресценции. Реакция люциферина-люциферазы была использована для определения уровней АТФ. MMP был обнаружен катионом красителя JC-1 и проанализирован под цитометрией потока. OCR измерялся с помощью внеклеточного анализатора потока. Таким образом, эти протоколы были использованы в обнаружении митохондриальной функции в гепатоцитах с для исследования повреждений митохондрий.
Introduction
Влияние органохлорных пестицидов (OCPs) на здоровье, например, репродуктивное вмешательство, иммунологическая токсичность, метаболические изменения былиранее изучены 1,,2,,3. Методы обнаружения клеточного метаболизма и выявления митохондриальной дисфункции позволили ученым понять роль митохондриальной функции,,,(т.е.митохондриальных уровней STAT3,лактата, пирувата, соотношения лактата к пирувату,коэнзима No10, митохондриальной утечки протонов, биоэнергетики, биогенеза идинамики) втакихобластях, как старение, ожирение, диабет, сердечно-сосудистая функция, рак и токсичность.6 В этом документе мы описываем методы оценки митохондриальной дисфункции, вызванной OCPs.
Мы подвергли клетки HepG2 воздействию гексахлороциклогексана (З-ГХГ), одного репрезентативного OCP, на 24 ч в дозе, эквивалентной внутреннему воздействию человека. Во-первых, TEM был применен для наблюдения за ультраструктурой гепатоцитов, таких как ядра, митохондрии и эндоплазмическийритикулум 8. По сравнению с обычными микроскопами, TEM позволяет исследовать 2D и 3D ультра-структуру клеток и клеточных компонентов (клеточные линии или ткани), морфологию, химический состав, а также функции природных или искусственных материалов, которые играют ключевую роль в современной науке и технике. Митохондриальная функция была дополнительно оценена по интенсивности митохондриальной флуоресценции, уровням аденозина 5'-трифосфата (АТФ), скорости потребления кислорода (OCR) и митохондриальному мембранальному потенциалу (MMP) в клетках HepG2, инкубированных С-ГХГ. Мито-трекер зеленый митохондрии зеленый флуоресцентный зонд, который может быть использован для живых клеток митохондриальных флуоресцентных окрашивания. Митохондрии в гепатоцитах были окрашены мито-трекер зеленый раствор и митохондриальной интенсивности флуоресценции, количество и картина наблюдались с конфокальноймикроскопии 9. Митохондриальный зеленый флуоресцентный зонд может быть использован для окрашивания живых клеток. По сравнению с роданом 123 или JC-1 митохондриальный зеленый флуоресцентный зонд не зависит от митохондриального мембранного потенциала митохондриального окрашивания. Уровни АТФ определялись набором люциферазы-люциферина и нормализовались концентрацией белка. Набор анализа АТФ может быть использован для обнаружения уровней АТФ в общих растворах, клетках или тканях. Этот комплект основан на светлячка люцифераза катализа флуоресценции для создания флуоресценции, когда АТФ требуется для обеспечения энергией. Когда светлячок люцифераза и флуорессейн являются чрезмерными, в определенном диапазоне концентрации, генерация флуоресценции пропорциональна концентрации АТФ. Кроме того, этот комплект был специально разработан для оптимизации химилюминесценции АТФ. АТФ, как наиболее важные молекулы энергии, играет важную роль в различных физиологических или патологических процессах клеток. Изменения в уровнях АТФ могут отражать дефекты в функции клеток, особенно митохондриальной выработки энергии. Обычно при апоптозе, некрозе или в каком-то токсичном состоянии уровень клеточного АТФ снижается на 10. MMPs анализ комплект с JC-1 является комплект, который использует JC-1 в качестве флуоресцентного зонда для обнаружения клеток, тканей или очищенных MMPs быстро и чувствительно. Он может быть использован для раннего выявления апоптоза. Катионый краситель JC-1 является флуоресцентным зондом, используемым для обнаружения MMP, который может быть проанализирован под цитометрией потока, указанной изменениями зеленого и красного соотношения флуоресценции. Когда MMP высок, JC-1 агрегируется в матрице митохондрий, чтобы сформировать полимер (J-агрегаты), который производит красную флуоресценцию. Когда MMP низок, JC-1 не может накапливаться, и образует мономер, который производит зеленую флуоресценцию11. Таким образом, соотношение красной и зеленой флуоресценции может отражать уровень MMP. OCR клеток является важнейшим показателем нормальной клеточной функции12. Он рассматривается как параметр исследования митохондриальной функции. Комплект стресс-теста Cell mito обеспечивает стабильный метод анализа ключевых параметров митохондриальной функции. Комплект обеспечивает контроль качества и прогностические реагенты, а также стандартный метод для выполнения клеточного митохондриального стресс-теста. Он может быть использован для обнаружения всех типов клеток, в том числе первичных клеток, клеточных линий, подвесных клеток, а также для островков, нематод, дрожжей и изолированных митохондрий.
Измерение OCR может обеспечить ценное понимание физиологического состояния или изменения клеток. Он был определен с помощью внеклеточного анализатора потока для обнаружения дыхания базовых, протонной утечки, максимальных дыхательных путей, оборота АТФ и резервной мощности. Короче говоря, после базовых измерений OCR, OCR был обнаружен после последовательного добавления к олигомицину (ATP Coupler), FCCP (митохондриальное окислительное фосфорилирование uncoupler) и антимицин а/ротенон (ингибитор потребления кислорода) на колодец.
В целях содействия разработке более конкретного протокола для обнаружения митохондриальной функции в гепатоцитах in vitro, мы представляем здесь эксперименты TEM, конфокальной микроскопии, люминометра, цитометра потока и внеклеточного анализатора потока с будущим применением в изучении митохондрий повреждения, связанные с неблагоприятными исходами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты и протоколы экспериментов проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами и были одобрены местным комитетом по этике Нанкинского медицинского университета.
1. Митохондриальная ультраструктура TEM
- Сбор клеток HepG2
- Семенные клетки HepG2 в 100 мм посуде. Хранить по 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
- Дайджест клеток с 0,25% ЭДТА в 1,5 мЛЕП трубки.
- Центрифуга при температуре 1000 x г в течение 3 мин при комнатной температуре (RT). Откажитесь от супернатанта.
- Соберите 4-6 х 105 клеток HepG2.
- Добавьте 1 мл 5% глутаралдегида (Solvent: двойная дистиллированная вода) с пипетки и инкубировать при 4 градусов по Цельсию в течение 2 ч.
- Добавить и вымыть в 4 изменения 1 мл фосфатного буфера (содержащий Na2HPO4, KH2PO4, NaCl и KCl, рН 7,4), 15 мин каждый. Высосать фосфатный буфер с пипетки.
- Добавьте 200 мкм 1% осмия (Solvent: двойная дистиллированная вода) и инкубировать при 4 градусов по Цельсию для 2 ч в черный образец.
Внимание: Осмий является высокотоксичным и летучим веществом. Его следует тщательно оперировать в наркологом кабинете. - Добавить и промыть в 2 изменения 1 мл фосфатного буфера, 5 мин каждый. Высосать фосфатный буфер.
- Пятно в 2% уранил ацетат раствор (Solvent: двойной дистиллированной воды и уксусной кислоты) в 1,5 мл EP трубки для 2 ч.
- Обезвоживать и погружать через 50% ацетон, 70% ацетон, 90% ацетон (Solvent: двойная дистиллированная вода), 2 изменения абсолютного ацетона, 15 мин каждый.
- Проникнуть в 2 капли ацетона (100%)/встраивания агента (1:1) за 1,5 ч на RT. Epon812 встраивание агента, рецепт заключается в следующем: A: Epon812, 62 мл и DDSA, 100 мл; Б: Epon812, 100 мл и MNA 89 мл. A:B-2:8 (v:v, зимой), A:B-1:9 (v:v, летом). Встраивание в встраивание форм (мягкая пластиковая пластина с клетчатой сеткой).
- Инкубировать последовательно при 37 градусов по Цельсию в течение 12 ч, 45 градусов по Цельсию для 12 ч, а затем 60 градусов по Цельсию для 48 ч.
- Подготовка и соблюдение ультратонких секций (самая большая площадь не может превышать 0,5 мм и 0,3 мм) ультратонкими секциями машины и TEM (2 мкм и 500 нм).
2. Обнаружение митохондриальной флуоресценции интенсивности
- Семя 2x 104 HepG2 клетки в 6-хорошо пластин. Добавить З-ГХГ на 24 ч.
- Добавьте ангидроус DMSO, чтобы сформулировать окончательную концентрацию митохондриального зеленого флуоресцентного зонда 1 мМ.
- Добавьте 1 мл митохондриального зеленого флуоресцентного раствора зонда (окончательная концентрация: 200 нМ) к каждой пластине из 6-колодец, инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 45 мин.
- Удалите митохондриальный зеленый флуоресцентный раствор зонда и добавьте свежеприготовленную среду клеточной культуры (DMEM) при 37 градусов по Цельсию до визуализации.
- Наблюдайте митохондриальную зеленую флуоресценцию с помощью флуоресцентной микроскопа (10x). Максимальная длина волны возбуждения при обнаружении составляет 490 нм, а максимальная длина волны выбросов - 516 нм.
3. Анализ клеточного уровня АТФ
- Семена HepG2 клетки в 6-хорошо пластин. Добавить З-ГХГ на 24 ч.
- Добавьте 200 мкл буферов лиза из комплекта анализа лусиферазы-люциферина АТФ к каждому колодец из 6-хорошо пластин. Центрифуга при 12 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия, соберите супернатант с пипетками в новые трубки.
- Разбавить реагент обнаружения АТФ с разбавления АТФ в соотношении 1: 5, как буфер обнаружения АТФ.
- Подготовка стандартного определения кривой: разбавить 0,5 мМ стандартного раствора АТФ до 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 МКМ буферами лиза АТФ.
- Добавьте 100 МКЛ буфера обнаружения АТФ в 96-хорошо пластины в течение 5 мин на RT, и добавить 100 МКЛ супернатанта клетки, обнаруженные люминометром (детектор хемилюминесценции). Рассчитайте концентрацию АТФ (nmol/L), хотя стандартная кривая.
- Обнаружить концентрацию белка с помощью набора анализа белка BCA с мультимодом читателя.
- Подготовка стандартного определения кривой: разбавить 5 мг/мл белкового стандартного раствора до 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 мг/мл двойной дистиллированной водой.
- Добавьте 1 мкл супернатанта клетки в пластину 96-колодец и добавьте 19 МКЛ двойной дистиллированной воды.
- Добавьте 200 мкл решений для обнаружения BCA для каждой колодец. Инкубационный при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Обнаружить значение OD (оптическая плотность) с помощью мультимодного считыватель с 562 нм. Рассчитайте концентрацию белка (мг/мл), хотя стандартная кривая.
- Исправь содержание АТФ в концентрации белка мг (единица: концентрация АТФ/концентрация белка, нмоль/мг).
4. Оценка потенциала митохондриальной мембраны (MMP) по JC-1
- Соберите клетки HepG2, посеянные в 6-хорошо пластин. Переваривайте клетки с 0,25% ЭДТА в трубке EP 1,5 мл, центрифугу при 1000 х г в течение 3 мин, отбрасывайте супернатант и собирайте клетки.
- Добавьте 50 мл JC-1 (200X) в 8 мл дистиллированной воды, чтобы вихрь и перемешать. Добавьте 2 мл буфера окрашивания JC-1 (5X) в качестве решения для обнаружения JC-1.
- Инкубировать клетки смесью 0,5 мл среды клеточной культуры и 0,5 мл раствора обнаружения JC-1 в течение 20 мин при 37 градусах Цельсия.
- Центрифуга при 600 x g в течение 3 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта.
- Промыть в 2 изменения 1 мл JC-1 (1X) окраски буфера, центрифуги при 600 х г в течение 3 мин при 4 градусов по Цельсию. И отбросьте супернатант.
- Приостановить клетки в 0,5 мл JC-1 (1X) окраски буфера, анализировать с помощью цитометрии потока для обнаружения зеленого и красного флуоресценции. При обнаружении полимера JC-1 установите свет возбуждения до 490 нм, а свет излучения до 530 нм. При обнаружении полимера JC-1 установите свет возбуждения до 525 нм, а свет излучения до 590 нм.
5. Измерения уровня потребления кислорода (OCR)
- Семенные клетки HepG2 в микроплацах клеточной культуры 96-ну при плотности 4500 клеток/100 йл на колодец. Убедитесь, что клетки покрыты каждый хорошо после 24 ч.
- Добавьте соответствующий объем подготовленных реагентов в соответствующий порт впрыска, согласно предыдущей литературе13. Порт A: 25 МКЛ 1 МКМ олигомицина (ATP Coupler); Порт B: 25 0,75 МКМ FCCP (Электронный контроль дроссельной заслонки, ускоритель ETC); Порт C: 25 МКЛ 0,5 МКМ антимицин А/ротенон (митохондриальный ингибитор А и митохондриальный ингибитор В).
- Храните картридж в инкубаторе с 37 градусами Цельсия без CO2 до готовности к использованию.
- Сделайте среднее изменение клеточной пластины путем удаления бегущей среды из каждой хорошо и добавления к новому DMEM. Окончательный объем для каждой из них составляет 180 мл.
- Храните клеточную пластину в инкубаторе 37 градусов поЦельсию без CO 2 в течение 1 ч до анализа.
- Запись OCR автоматически с помощью программного обеспечения.
- Откройте программное обеспечение OCR.
- Выберите набор для стресс-тестов Cell Mito в меню для высадки приложений.
- Нажмите кнопку «Начало приложения».
- Нажмите кнопку Стресс-тест Run. Отображается экран настройки теста на стресс-клетки.
- Сделай следующие шаги:
- Введите количество клеток, посеянных на колодец в поле для посева клеток.
- Введите средний OCR в средней базальной коробке OCR.
- Введите окончательную рабочую концентрацию для каждого реагента и введите реагенты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее базальное значение OCR для клетки должно было быть обнаружено перед запуском анализа оптимизации при оптимизации концентрации посева клеток. - Нажмите следующую кнопку. Отображается групповой информационный экран.
- Назначьте группу неподписанным колодцам, выбрав цвет и дав название, а затем нажав на соответствующие скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные группы определяются как различные методы лечения до запуска cell Mito стресс-тест. Все колодцы микропластиц получат те же инъекции реагентов при запуске стресс-теста. - Нажмите следующую кнопку. Появляется экран stress Test Injection Layout.
- Нажмите "Начать". Стресс-тест теперь работает на анализаторе. Когда бег закончен, следуйте точке s в программном обеспечении, удалите и отбросьте картридж и клеточную пластину.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Митохондрии cristae клеток HepG2 подвергаются К-ГХГ были заметно повреждены. Рассеянные митохондрии были слегка заметно расширены, неправильной формы, и митохондриальный хребет исчез с относительно ненормальной митохондриальной архитектурой(рисунок 1).
Средняя митохондриальная зеленая интенсивность флуоресценции, которая представляет собой митохондрии, снизилась в клетках HepG2, подвергшихся воздействиюЗ-ГХГ (рисунок 2),а также в уровняхАТФ (рисунок 3). Интенсивность флуоресценции и уровень АТФ постепенно снижались с увеличением концентраций воздействия. Потенциально, сокращение числа митохондрий, или поврежденных митохондрий, вызвало наблюдаемую митохондриальную флуоресценцию интенсивности, и, следовательно, снижение производства АТФ.
Результаты цитометрии потока показали, что соотношения красно-зеленого флуоресценции JC-1 в группе З-ГХГ были значительно ниже, чем в контрольной(рисунок 4). OCR клеток HepG2 был уменьшен в дозе-зависимой манере после воздействия ГХГ. По сравнению с контрольной группой, частота базального дыхания, утечка протонов, максимальная дыхательная способность и текучесть АТФ были значительно снижены в клетках HepG2, подвергшихся воздействиюЗ-ГХГ (рисунок 5). Эти результаты показали, что митохондриальная функция была нарушена после воздействия ГХГ.
Все инструменты, используемые в этих экспериментах, были покажем на дополнительном рисунке 1.
Рисунок 1: Репрезентативные микрографы TEM клеток HepG2, подвергшихся воздействию ГХГ (A: 6000, B: 25000). Типичные повреждения показали слегка увеличенные митохондрии (М), электрон-люцентные матрицы, поврежденные кристы и свободные зазоры органеллы. М: митохондрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Обнаружение митохондриальной флуоресценции в клетках HepG2, обработанных З-ГХГ13. Количество, расположение и флуоресценция интенсивности митохондрий (А) были показаны в флуоресценции микроскопических изображений и количественные уровни митохондриальной интенсивности флуоресценции были основаны на митохондриальной зеленой флуоресцентной на клетку (B). Вопрос: P Lt; 0.05, q: P lt; 0.001 по сравнению с управлением. Каждая точка данных была средним и SEM из трех отдельных экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Уровни АТФ в клеткахHepG213. : P Lt; 0.001 по сравнению с контролем, З: P Lt; 0,01 по сравнению с 10 нг/мл З-HCH.Data были представлены в качестве среднего SEM трех отдельных экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Влияние на MMP JC-1 окрашивания и потока цитометрии13. (A) Поток цитометрии участков. Y-ось показала соотношение красной и зеленой флуоресценции. PE: Красная флуоресценция, FITC: Зеленая флуоресценция. (B). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Каждая точка данных была средним и SEM из трех отдельных экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Обнаружение скорости потребления клеточного кислорода (OCR). (A) Влияние З-ГХГ на клеточный OCR было измерено анализатором внеклеточного потока. Эти четыре периода представляют собой скорость клеточного базального дыхания, скорость ингибирования АТФ-синтазы, максимальную развязанные скорости и ротенон-или антимицин-А-ингибированную скорость. (B) Количественные гистограммы результатов OCR для базовой линии, утечки протонов, максимальной дыхательной способности, мощности оборота АТФ. Вопрос: P Lt; 0,05, й: P Lt; 0,01, й: P Lt; 0,001 по сравнению с контролем. Каждая точка данных была средним и SEM из трех отдельных экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 1: Все инструменты, используемые в протоколах. (A) Передача электронной микроскопии. (B) Лазерное сканирование конфокального микроскопа. (C) Люминометр. (D) Мультимодный читатель. (E) Цитометрия потока. (F) Экстраклеточный анализатор потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Решающее значение для успеха протокола обнаружения имеет использование различных экспериментальных методов, которые были охвачены исследования от фенотипа к механизму. В этом исследовании клетки HepG2 были откоучались в DMEM с пенициллином и стрептомицином и 10% сыворотки крупного рогатого скота плода. Когда клетки достигли 40-50% слияния, З-ГХГ (0, 10, 100 нг/мл) были добавлены и инкубированы в течение 24 ч. Во-первых, мы использовали TEM, который показал ультраструктурные изменения в гепатоцитах, вызванные репрезентативными OCPs, З-ГХГ, показывая ухудшение структуры митохондрий(рисунок 1). ( Кроме того, флуоресцентные окрашиванияанализ (Рисунок 2), люцифераза-люциферин АТФ анализ (Рисунок 3),JC-1 анализ (Рисунок 4)и анализ стресс-теста клеток мито (Рисунок 5), которые обычно оценивают дисфункцию митохондрий, были выполнены. Эти результаты служат основой для исследования основных молекулярных механизмов.
В вышеуказанных методах, следователи должны обратить внимание на меры предосторожности в некоторых шагах. Например, при подготовке электронной микроскопии следует обратить внимание на количество клеток, чтобы избежать плохой фиксации, вызванной слишком большими тканями или клеточным блоком. 5% глутаралдехайд выступает в качестве фиксатора, лучше не хранить более полугода, чтобы избежать сбоя обнаружения. Фиксированные образцы помещаются при 4 градусов по Цельсию в течение 24 ч или до 1 месяца до следующего шага. Митохондриальный зеленый флуоресцентный краситель легко утолить, и свет следует избегать, чтобы замедлить закалку флуоресценции. В клеточном анализе уровней АТФ, при использовании многофункционального люминометра, который может обнаружить хемилюминесценцию, непрозрачную доску или доску 96-хорошо пластины должны быть использованы, чтобы избежать взаимного вмешательства между соседними отверстиями. АТФ, в частности расщепление АТФ в образце, не является стабильным при комнатной температуре, и их необходимо эксплуатировать при температуре 4 градусов по Цельсию или на льду. АТФ может быть стабильным на льду до 6 ч. При подготовке решения обнаружения JC-1, JC-1 окрашивания буфера (5X) могут быть добавлены после JC-1 (200X) тщательно растворяется и смешивается с ультрапурной водой, так что JC-1 решение обнаружения будет легко растворить полностью. Зонд JC-1 должен быть загружен и вымыт в течение 30 минут и сохранен при 4 градусах Цельсия или льда для завершения последующего теста. При измерениях OCR среднее базальное значение OCR для клетки должно быть обнаружено до анализа оптимизации при оптимизации концентрации посева клеток.
Существуют некоторые ограничения этих методов. Измерение OCR с помощью внеклеточного анализатора потока ограничивается клеточными экспериментами. Обнаружение митохондриальной функции недостаточно глубоко, так как метаболические продукты митохондриями не измеряются, такие как измерение жирных кислот и метаболитов в циклах TCA в гепатоцитах. Кроме того, экспрессия генов и белков в отношении синтеза и деградации печеночные жирные кислоты может быть обнаружена в режиме реального времени полимеразной цепной реакции и западной помарки, что может еще больше подтвердить молекулярные нарушения метаболизма жирных кислот и митохондриальнойдисфункции 13. Цифровые изображения митохондрий могут быть захвачены в живых клетках под конфокальной микроскопией и проанализированы на изменения митохондриальной морфологии на основе значения форм-фактора (FF) и соотношения сторон (AR). Метаболическая функция митохондрий была также оценена путем измерения уровня внеклеточного подкисления (ECAR) с помощью биоэнергетическогоанализатора 14. Некоторые митохондриальные маркерные антитела (цитохром c, HSP60, PHB1, SOD1, VDCA и STAT3)можно измерить по западной помарке 4,,15,,16,,17. Активность ферментов, уважающих митохондриальную функцию и цикл трикарбоксициловой кислоты (TCA), таких как языца дегидрогеназа, сукцинат дегидрогеназа, цитрат синтетазы, ATPase, изоцитрат дегидрогеназы и дегидрогеназыкетоглутарата, свидетельствуют 18. Функция электронной транспортной цепи в клетках и в изолированных митохондриях печени обнаруживается с помощью респирометрии высокого разрешения19.
Наши протоколы сосредоточены на выявлении митохондриальной морфологии, структуры, местоположения, количества, емкости, мембранного потенциала и функции дыхательной цепи. Они в основном способны оценить митохондриальную функцию из разных аспектов. Более того, эти методы просты и просты в эксплуатации. Митохондриальные исследования функции были широко проведены в различных областях, таких какпечень 20,микрофлота кишечника 21, плюрипотентныестволовые клетки 22, а в некоторых распространенных заболеваний, такихкак диабет типа 2 23,болезнь Паркинсона 24 и воспалительные заболеваниякишечника 25. Там может быть больше заболеваний, связанных с митохондриями, и наши протоколы могут быть полезны в расследовании соответствующих механизмов. Кроме того, необходима также дальнейшая эмпирическая работа по всеобъемлющему и углубленному масштабу этих эффектов с помощью более экспериментальных методов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (Grant No 81573174, 81570574); Выдающийся молодежный фонд провинции Цзянсу (SBK2014010296); исследовательский проект Министерства образования Китая (213015A); приоритетная академическая программа развития высших учебных заведений Цзянсу (PAPD), флагманское крупное развитие высших учебных заведений Цзянсу; и Программа открытого проекта Государственной ключевой лаборатории экологической химии и экотоксикологии (KF2015-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
References
- Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
- Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
- Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
- Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
- Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E.
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
- Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
- Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
- Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
- Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
- Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
- Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
- Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
- Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
- Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
- Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
- Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
- Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
- Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
- Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
- Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
- Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).
