Summary
Den menneskelige hud fungerer som et første linje i forsvaret mod det ydre miljø. Vi præsenterer en metode til at isolere primære humane keratinocytter fra voksen hud. Disse isolerede keratinocytter er nyttige i mange eksperimentelle opsætninger, og er en særdeles velegnet model for at studere molekylære mekanismer i kutane biologi in vitro-.
Abstract
Den vigtigste funktion af keratinocytter er at give den strukturelle integritet af epidermis, dermed bevare en mekanisk barriere til omverdenen. Derudover spiller keratinocytter en væsentlig rolle i indledningen, vedligeholdelse og regulering af epidermale immunrespons ved at være en del af det medfødte immunforsvar reagerer på antigene stimuli i en hurtig, uspecifik måde. Her, vi beskriver en protokol til isolation af primære humane keratinocytter fra voksen hud, og påvise, at disse celler reagerer på calcium-induceret terminal differentiering, målt ved en øget ekspression af differentiering markør involucrin. Derudover viser vi, at de isolerede keratinocytter lydhøre over for IL-1β-induceret aktivering af intracellulære signaling veje som målt ved aktivering af p38 MAPK pathway. Taget sammen, beskriver vi en metode til isolering og dyrkning af primære humane keratinocytter fra voksen hud. Fordi keratinocytter er den dominerende celletype i epidermis, er denne metode nyttig til at studere molekylære mekanismer i kutane biologi in vitro.
Introduction
Huden er det største organ i den menneskelige krop og fungerer som en beskyttende barriere mod det ydre miljø. Huden består af to lag: dermis og epidermis, hvor epidermis udgør det yderste lag af huden. Den mest udbredte celletype i epidermis er keratinocytter bestående af mere end 95% af celle masse1,2. Keratinocytter vedligeholdes på forskellige stadier af differentiering i overhuden og er organiseret i basale, spinosus, kornede og cornified lag, der svarer til bestemte faser af differentiering3. Den primære funktion af keratinocytter er at give den strukturelle integritet af epidermis, dermed producerer en intakt barriere til omverdenen.
Keratinocytter også repræsentere den første linje i forsvar mod patogener i huden, og derfor spiller en vigtig rolle i medfødte immun svar4,5. Eksponering af keratinocytter på eksterne stimuli fører til aktivering af intracellulær signalering veje og efterfølgende udarbejdelse af en række forskellige inflammatoriske mediatorer herunder cytokiner, kemokiner og antimikrobielle peptider. Disse keratinocytter-afledte proteiner deltage i den inflammatoriske reaktion ved rekruttering og aktivere immunsystemet celler såsom dendritiske celler, neutrofiler og specifikke T celler6,7. Således, fordi keratinocytter spiller en afgørende rolle i mange biologiske processer, rationalet bag teknikken præsenteret her var til at generere en in vitro- model for at studere hud biologi. Primære keratinocytter kulturer fremstillet af neonatal forhuden er ofte bruges til at undersøge huden biologi8,9. Dog med den teknik beskrevet her, er keratinocytter fra begge køn opnået resulterer i en højere biologisk mangfoldighed af celler.
Vi præsenterer her, en detaljeret protokol til isolering og generation af primære humane keratinocytter fra voksen hud, herunder vedligeholdelse og indefrysning af keratinocytter. Det overordnede mål med denne metode er at generere primære humane keratinocytter, der kan bruges som model til at studere kutane biologi in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samling af hud prøver fra raske voksne frivillige gennemgår plastikkirurgi kræver godkendelse fra den etiske komité i værtsinstitutionerne. Denne protokol blev godkendt af den regionale etiske udvalg af Region Midtjylland, Danmark (M-20110027). Metoden beskrevet her er afledt fra lignende undersøgelser af Maciaq et al. 10 og Liu og Karasek11.
1. isolering af keratinocytter fra menneskelige hud
- Start ved at gøre følgende løsninger: 50 mL opløsning af 0,25% trypsin og 0,1% glukose i DPBS. Mix og filter sterilisere (0,2 µm) løsningen. Forberede 10 mL af RPMI-1640 + 2% FBS opløsning, 50 mL af DPBS og keratinocytter serumfrit medium (KSFM). Tilføje KSFM kosttilskud og 250 µL af phosphatbufferet til 500 mL KSFM. Pre varm løsninger til 37 ° C før brug.
- Indsamle hud fra raske voksne frivillige gennemgår plastikkirurgi. Hud prøver anvendes er ca 10 cm x 15 cm, men kan variere i størrelse. Holde huden cool under transport ved at transportere hud prøver i en Styrofoam boks der indeholder en afkøling element. Hvis det er nødvendigt, kan hudprøve opbevares ved 4 ° C natten over.
- Fjerne fedt fra under afsnittet hud ved hjælp af steriliseret saks, skalpel og pincet.
- Spænde ud afsnittet hud (ca 10 cm x 15 cm) på en steril dækning på toppen af en plade ved hjælp af nåle. Først rens huden med en tør steriliseret gauze afrivningsblok. Så rense huden ved hjælp af en steriliseret gaze pad med 70% ethanol.
- Ved hjælp af en mund tykkelseshøvl, skåret af det øverste lag (epidermis) i afsnittet hud og sætte det i en 9 cm petriskål. Derefter straks tilføje 25 mL af DPBS/trypsin/glucose (udarbejdet i trin 1.1) til petriskålen. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
- Ved hjælp af en pipette fjerne DPBS/trypsin/glucose løsning fra petriskålen og der tilsættes 10 mL af RPMI-1640 + 2% FBS til at inaktivere trypsin.
- Bruger to pincet, nu frigive den epidermale celler i medium af forsigtigt skrabe og agiterer både den epidermale og den dermale rum af sektionerne hud.
- Filtrere den epidermale cellesuspension gennem en metal filter (1 mm hul størrelse), og indsamler i en 50 mL tube. Tilføje de resterende hud afsnit til en 50 mL tube indeholder 10 mL af RPMI-1640 uden FBS og vortex for 10 s. Filter suspension gennem metal filter i en 50 mL tube indeholdende den epidermale cellesuspension. Føje DPBS til en samlet maengde paa 50 mL.
- Der centrifugeres cellesuspension til 10 min på 450 x g ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og resuspenderes epidermale celler i ca. 10 mL 37 ° C KSFM afhængigt af celle pellet størrelse. Tælle celler benytter Trypan blå farvning metode under mikroskop. Antallet af celler fra en 10 cm x 15 cm hud sektion er ca 50-100 x 106 celler. Hver 75 cm2 kultur kolbe, overføre 8 x 106 celler sammen med 12 mL af 37 ° C KSFM. Ryst forsigtigt kultur kolberne for at sikre ensartet fordeling af cellerne.
- Inkuber keratinocytter i et 37 ° C kuvøse med 100% luftfugtighed og 5% CO2. Ændre medium efter 2 dage og tre gange ugentlig. Passage celler når kulturen er 70-80% sammenflydende, som tager ca 2 uger afhængigt af spredning sats på keratinocytter.
2. passaging af keratinocytter
- Opvarme den passende mængde 0,05% Trypsin-EDTA-oploesning til 37 ° C i en inkubator. Bruge 4,5 mL 0,05% Trypsin-EDTA-oploesning til en 75 cm2 kultur kolbe.
- Fjerne medium fra cellerne, og Tilføj 4,5 mL/75 cm2 kultur kolbe pre varmede 0,05% Trypsin-EDTA-oploesning til cellerne. Kolben kultur i inkubator (37 ° C) og efter ca. 5 min., tjekke under mikroskop, hvis cellerne er begyndt at løsne.
- Når ca. 50% af cellerne har løsnet, forsigtigt ramte kultur kolben mod hånden til at løsne de resterende celler. Derefter til at inaktivere trypsin, 75 cm2 kultur kolben tilsættes 6 mL af RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) og overføre cellesuspension til 50 mL rør.
- Skyl kultur kolber med 3 mL af RPMI 1640 + 2% FBS og tilføje til 50 mL rør. Der centrifugeres celler i 10 min på 450 x g ved stuetemperatur.
- Resuspend pelleted cellerne i 10 mL af KSFM (37 ° C). Tælle cellerne og overføre 3 x 106 celler til en 150 cm2 kultur kolbe sammen med 20 mL af KSFM (37 ° C). Ryst forsigtigt kultur kolben for at sikre ensartet fordeling af cellerne. Frys cellerne, når kulturen er 80-90% sammenflydende, som tager ca 4-6 dage afhængigt af spredning sats af keratinocytter (Se afsnit 3, frysning protokol nedenfor). Udvid keratinocytter for at generere passende frosne bestande.
3. indefrysningen af keratinocytter
- Opvarme den passende mængde 0,05% Trypsin-EDTA-oploesning til 37 ° C i en inkubator. Bruge 9 mL 0,05% Trypsin-EDTA-oploesning til en 150 cm2 kultur kolbe.
- Fjerne medium fra cellerne, og Tilføj 9 mL/150 cm2 kultur kolbe pre varmede 0,05% Trypsin-EDTA-oploesning til cellerne. Kolben kultur i inkubator (37 ° C) og efter ca. 5 min., tjekke under mikroskop, hvis cellerne er begyndt at løsne.
- Når ca. 50% af cellerne har løsnet, forsigtigt ramte kultur kolben mod hånden for at løsne de resterende celler. Derefter til at inaktivere trypsin, tilføje 12 mL af RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) til 150 cm2 kultur kolbe og Opsug cellesuspension til 50 mL rør.
- Skyl kultur kolber med 6 mL af RPMI 1640 + 2% FBS og tilføje til 50 mL rør. Centrifugeres rør til 10 min på 450 x g ved 4 ° C. Forberede iskold celle frysning medium (KSFM + 10% DMSO).
- Resuspenderes celle i KSFM + 10% DMSO, tælle cellerne, og fryse celler med en tæthed på 6 x 106 celler/mL ved hjælp af standard bremse-frysning kryopræservering metoder12.
- Gemme keratinocytter i flydende kvælstof (vapor fase) indtil klar til brug.
4. optøning og dyrkning frosne keratinocytter
- Hurtigt optø de passende frosne hætteglas i et 37 ° C vandbad. Brug 70% ethanol til Rengør ydersiden af cryovial. Overføre det passende antal celler (ca. 15.000 celler/cm2) til en kultur kolbe og straks tilføje pre varmede vækstmediet (KSFM) til kultur kolbe.
Enhver størrelse af kultur kolber kan anvendes afhængigt af opsætningen af eksperimentet. - Brug 5 mL næringssubstrat for en 25 cm2 kultur kolbe.
Bemærk: Vores data viste, at 95% af de celler, der er isoleret af protokollen beskrevet her i gennemsnit er positive for keratinocytter-markør cytokeratine-1413.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Calcium-induceret Terminal differentiering
Humane keratinocytter gennemgå terminal differentiering efter behandling med calcium14,15,16. Primære humane keratinocytter blev isoleret og kulturperler som beskrevet i ovennævnte protokol. Hvornår ca 50-60% sammenflydende, cellerne blev stimuleret med calcium (1,2 mM) eller køretøj og billeder af celler blev taget på dag 0, 1 og 2. Figur 1 viser de morfologiske ændringer af keratinocytter observeret på calcium stimulation.
Udtrykket Involucrin er øget ved Calcium Stimulation
Dyrkede humane keratinocytter blev dyrket indtil ca 50-60% sammenflydende hvorefter cellerne blev stimuleret med calcium (1,2 mM) eller et køretøj for 24 og 48 timer. Vi viste, at i takt med den øgede differentiering af celler som observeret af de morfologiske ændringer af keratinocytter, mRNA udtryk for differentiering markør involucrin steget betydeligt på calcium stimulation. Efter 24 og 48 timer af stimulation, var involucrin mRNA udtrykket steget ca 5.5-fold og 3.5-fold, henholdsvis, sammenlignet med køretøjet (figur 2).
IL-1β-induceret fosforylering af p38 MAPK
At afgøre, om de isolerede humane keratinocytter var lydhør over for cytokin-induceret aktivering af intracellulære signaling veje, kulturperler keratinocytter blev stimuleret med IL-1β (10 ng/mL) for forskellige tidspunkter. Inden for 5 min, IL-1β stimulation førte til en hurtig aktivering/fosforylering af p38 MAPK, som bestemmes af Western blotting. Efter 1 time, vendte IL-1β-induceret p38 MAPK fosforylering tilbage til basal niveau (figur 3). Kun fosforyleres form af p38 MAPK blev øget, som IL-1β stimulation havde ingen effekt på den samlede protein niveau af p38 MAPK (figur 3).
Figur 1 : Repræsentant billeder af calcium-induceret differentiering af keratinocytter. Kulturperler primære humane keratinocytter blev stimuleret med køretøjet (dH2O) eller calcium (1,2 mM) for de angivne tidspunkter. (A - E) Fase kontrast billeder af keratinocytter på dag 0 (A), dag 1 (B og C) og dag 2 (D og E) efter calcium stimulation. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Øget mRNA udtryk for involucrin på calcium stimulation. Calcium (1,2 mM) eller køretøj (dH2O) blev føjet til kulturperler primære humane keratinocytter for de angivne tid point (n = 3). RNA er isoleret og udtryk for differentiering markør involucrin analyseret af qPCR. RPLP0 (ribosomale Protein store P0) mRNA udtryk blev brugt til normalisering. Resultaterne repræsenterer gennemsnit ± SD fra tre forskellige eksperimenter. p < 0,05 sammenlignet med køretøjet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : IL-1β-induceret fosforylering af p38 MAPK. Kulturperler primære humane keratinocytter blev stimuleret med køretøjet (PBS + 0,15% BSA) eller IL-1β (10 ng/mL) for de angivne tidspunkter. Protein ekstrakter blev isoleret og Western blotting analyse anvendes til at måle den fosforyleres niveau af p38 MAPK og total p38 MAPK. Lig lastning blev efterprøvet ved inkubering med en anti-β-actin antistof. Data fra en repræsentativ eksperiment ud af tre er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, beskriver vi sådan let isolere primære humane keratinocytter fra voksen hud og kultur dem i vitro. Denne model kan have et bredt program for undersøgelse af epidermale cellebiologi, og kan være nyttigt for forskere interesseret i at studere kutane sygdomme.
Nogle af fordelene ved protokollen beskrevet her er, at i modsætning til keratinocytter isoleret fra neonatal forhuden fremstillet af nyfødte hanner gennemgår omskæring, primære humane keratinocytter fra voksne patienter er isoleret fra både mænd og kvinder og kan omfatte enhver alder ≥18 år. Således, den biologiske mangfoldighed er meget større i disse celler sammenlignet med keratinocytter fra neonatal forhuden. Desuden kan relativt store stykker af huden prøver opnås fra patienter i plastikkirurgi, som brystreduktion eller vægttab kirurgi.
Som nævnt ovenfor er epidermis organiseret i forskellige lag svarende til den specifikke differentiering fase af keratinocytter. For at studere hud biologi, er modellen beskrevet her begrænset af manglen på en tre-dimensionel mikromiljø. De forskellige lag af epidermis samt de forskellige celletyper findes i huden er ikke efterlignede i denne model. For at overvinde dette, menneskelige hud tilsvarende modeller kan anvendes, som består af et lag epithel hvor keratinocytter differentiere ved udsættelse for en air-liquid interface, og dermed mere nøje efterligne den indfødte epidermis17, 18,19. En anden model, som kan fås for at studere hud biologi er ex vivo hudmodel, hvor hud biopsier holdes i kulturer på et air-liquid interphase som tidligere beskrevet20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. Forfatteren har nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatteren ønsker at takke Annette Blak Rasmussen og Kristine Moeller for deres tekniske support
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J.
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A.
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G.
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
