Summary
Человеческая кожа выступает в качестве первой линии обороны против внешней среды. Мы представляем метод для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи. Эти изолированные кератиноцитов полезны в многочисленных экспериментальных установок и являются весьма подходящую модель для изучения молекулярных механизмов в биологии кожного в витро.
Abstract
Основная функция кератиноцитов является предоставить структурной целостности эпидермиса, тем самым сохраняя механический барьер с внешним миром. Кроме того кератиноциты играют важную роль в инициации, техническое обслуживание и регулирование эпидермальный иммунных реакций, будучи частью иммунной системы реагировать антигенной стимулы быстрый, неспецифические способом. Здесь мы описываем протокол для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи и продемонстрировать, что эти клетки реагируют на кальций индуцированной терминала дифференциации, определяемой выражением рост дифференциации маркер involucrin. Кроме того мы показываем, что изолированные кератиноцитов реагировать ИЛ 1β-индуцированной активации внутриклеточных сигнальных путей, как измеряется активации p38 MAPK путь. Взятые вместе, мы описываем метод для изоляции и культивирование первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи. Потому что кератиноцитов тип преобладает ячейки в эпидермисе, этот метод является полезным для изучения молекулярных механизмов в биологии кожного в витро.
Introduction
Кожа является большой орган человеческого тела и служит защитным барьером против внешней среды. Кожа состоит из двух основных слоев: дермы и эпидермиса, где эпидермис представляет внешний слой кожи. Наиболее распространённый тип ячейки в эпидермис является кератиноцитов, состоящий из более чем 95% массы1,клетки2. Кератиноциты ведутся на различных стадиях дифференцировки в эпидермисе и организованы в базальной, остистых, гранулированных и ороговевшем слои, которые соответствуют конкретные этапы дифференцировки3. Основная функция кератиноцитов является предоставить структурной целостности эпидермиса, тем самым производить нетронутыми барьер с внешним миром.
Кератиноциты, также представляют собой первую линию обороны против патогенов в коже и поэтому играют важную роль в врожденный иммунный ответ4,5. Воздействие кератиноцитов на внешние раздражители приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей и впоследствии, производство целого ряда различных воспалительных медиаторов, включая цитокины, chemokines и противомикробные пептиды. Эти белки кератиноцитов производные участвуют в воспалительной реакции путем набора и активация иммунных клеток, таких как дендритные клетки, нейтрофилов и конкретных T клетки6,7. Таким образом потому что кератиноцитов играют решающую роль в многочисленных биологических процессах, обоснование техника, представленная здесь заключается в том, сформировать в vitro модель для изучения биологии кожи. Первичный кератиноцитов культур, полученных от крайней плоти новорожденных часто используются для изучения кожи биологии8,9. Однако с техникой, описанных здесь, кератиноциты от обоих полов получаются, что приводит к более высокой биологического разнообразия клеток.
Здесь мы представляем подробный протокол для изоляции и генерация первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи, включая техническое обслуживание и замораживания кератиноцитов. Общая цель этого метода заключается в генерации первичных человеческие кератиноциты, который может использоваться в качестве модели для изучения кожный биологии в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Коллекция образцов кожи от здоровых взрослых добровольцев, переживает пластической хирургии требует одобрения от этического Комитета в принимающих учреждениях. Этот протокол был одобрен региональной этического Комитета региона Midtjylland, Дания (M-20110027). Метод, описанный здесь является производным от аналогичных исследований, Maciaq и др. 10 и11Лю и Карасака.
1. изоляция кератиноцитов из человеческой кожи
- Начните путем делать следующие решения: 50 мл раствора 0,25% трипсина и 0,1% глюкозы в DPBS. Mix и фильтрации стерилизации (0,2 мкм) решение. Подготовка 10 мл RPMI 1640 + 2% раствор FBS, 50 мл DPBS и кератиноцитов сыворотки свободной среды (KSFM). Добавьте KSFM добавки и 250 мкл гентамицина в 500 мл KSFM. Предварительно теплой решения до 37 ° C перед использованием.
- Соберите кожи от здоровых взрослых добровольцев, переживает пластической хирургии. Кожных проб используется приблизительно 10 см x 15 см, но может изменяться в размерах. Охлаждения кожи под перевозки путем транспортировки образцов кожи в коробке из пенопласта, содержащего элемент охлаждения. При необходимости, образец кожи может храниться при температуре 4 ° C на ночь.
- Удалите жир из под кожи разделе Использование стерилизованные ножницы, скальпели и пинцет.
- Пряжка из секции кожи (приблизительно 10 см x 15 см) на стерильные Обложка верхней пластины с помощью иглы. Во-первых Очистите кожу сухой стерильный марлевый тампон. Затем очистите кожу с помощью стерильный марлевый тампон с 70% этиловом спирте.
- С помощью ног рубанок, вырезать из верхнего слоя секции кожи (эпидермис) и положил его в 9 см Петри. Затем сразу же добавьте 25 мл раствора DPBS/трипсина/глюкозы (подготовленный на этапе 1.1) Петри. Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C.
- С помощью пипетки удалить решение DPBS/трипсина/глюкозы из Петри и добавляют 10 мл RPMI 1640 + 2% FBS для инактивации трипсина.
- Теперь с помощью двух щипцы, выпуск эпидермальных клеток в среду, мягко очищая и агитировать эпидермиса и дермы отсек участков кожи.
- Фильтр суспензию эпидермальных клеток через металлический фильтр (размер отверстия 1 мм) и собирать в 50 мл трубки. Добавьте остальные разделы кожи Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл RPMI 1640 без FBS и вихревые для 10 s. фильтра, подвеска через металл фильтр в Тюбик 50 мл, содержащего суспензию клеток эпидермиса. Добавьте DPBS в суммарный объем 50 мл.
- Центрифуга суспензию клеток для 10 мин на 450 x g при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле эпидермальных клеток в приблизительно 10 мл 37 ° C KSFM в зависимости от размера ячейки Пелле. Подсчет количества ячеек, используя Трипановый синий окрашивания метода под микроскопом. Количество клеток, полученных из раздела 10 x 15 см кожи — примерно 50-100 х 106 клеток. Каждый настой культуры2 75 см передачи 8 х 106 клеток вместе с 12 мл 37 ° C KSFM. Осторожно встряхните культуры колбы для обеспечения равномерного распределения клеток.
- Инкубируйте кератиноцитов в инкубаторе 37 ° C с 100% влажность и 5% CO2. Изменения среды после 2 дней и три раза в неделю. Проход клетки при 70-80% притока, который занимает около 2 недель в зависимости от скорость распространения keratinocytes культуры.
2. пассированый кератиноцитов
- Тепла соответствующее количество 0,05% раствор трипсина-ЭДТА до 37 ° C в инкубаторе. Использование 4,5 мл 0,05% раствора трипсина-ЭДТА для колбу культуры2 75 см.
- Удаление среднего из клетки и добавить 4,5 мл/75 см2 культуры колбу предварительно разогретую 0,05% раствор трипсина-ЭДТА в клетки. Место культуры колбу в инкубатор (37 ° C) и после примерно 5 минут, проверьте под микроскопом клетки начали рыхление.
- Когда примерно 50% клеток ослаблены, мягко ударил культуры колбу против руку, чтобы ослабить оставшиеся ячейки. Затем чтобы инактивировать трипсина, добавить 6 мл RPMI 1640 + 2% FBS (37 ° C) до 75 см2 культуры колбу и передачи суспензии клеток с 50 мл трубки.
- Промойте культуры колбы с 3 мл RPMI 1640 + 2% FBS и добавить 50 мл трубки. Центрифуга клетки для 10 мин на 450 x g при комнатной температуре.
- Ресуспензируйте гранулированных клетки в 10 мл KSFM (37 ° C). Подсчитать количество ячеек и передачи 3 х 106 клеток колбу культуры2 150 см вместе с 20 мл KSFM (37 ° C). Осторожно встряхните флакон культуры для обеспечения равномерного распределения клеток. Заморозить клетки, когда культура является 80-90% вырожденная, которая занимает около 4-6 дней в зависимости от скорость распространения keratinocytes (см. раздел 3, замораживание протокол ниже). Разверните кератиноцитов сформировать соответствующие замороженные запасы.
3. Замораживание кератиноцитов
- Тепла соответствующее количество 0,05% раствор трипсина-ЭДТА до 37 ° C в инкубаторе. Используйте 9 мл 0,05% раствора трипсина-ЭДТА для колбу культуры2 150 см.
- Удаление среднего из клетки и добавить 9 мл/150 см2 культуры колбу предварительно разогретую 0,05% раствор трипсина-ЭДТА в клетки. Место культуры колбу в инкубатор (37 ° C) и после примерно 5 минут, проверьте под микроскопом клетки начали рыхление.
- Когда примерно 50% клеток ослаблены, мягко ударил культуры колбу против руки для того, чтобы ослабить оставшиеся ячейки. Затем чтобы инактивировать трипсина, добавить 12 мл RPMI 1640 + 2% FBS (37 ° C) до 150 см2 культуры колбу и аспирационная суспензии клеток с 50 мл трубки.
- Промойте культуры колбы с 6 мл RPMI 1640 + 2% FBS и добавить 50 мл трубки. Центрифуга для трубы для 10 мин на 450 x g при 4 ° C. Подготовьте ледяной клеток замораживание среднего (KSFM + 10% ДМСО).
- Ресуспензируйте Пелле клеток в KSFM + 10% ДМСО, подсчитать количество ячеек и заморозить клетки на плотности 6 х 106 клеток/мл с помощью методов криоконсервирования стандартных медленного замораживания12.
- Храните кератиноцитов в жидком азоте (паровой фазы) до готовой к использованию.
4. оттаивания и культивирования замороженных кератиноцитов
- Быстро разморозить соответствующие замороженных флаконов в ванну воды 37 ° C. Для очистки наружной cryovial используйте 70% этиловом спирте. Передать соответствующее количество клеток (примерно 15 000 клеток/см2) культуры колбу и сразу же добавить подогретым роста среднего (KSFM) культуры колбу.
Любой размер колбы культуры могут использоваться в зависимости от настройки эксперимента. - Используйте 5 мл питательной среды для культуры колбу 25 см2 .
Примечание: Наши данные показали, что в среднем 95% клеток, изолированных в протоколе описаны здесь являются позитивными для кератиноцитов маркер cytokeratine-1413.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Кальций индуцированной терминала дифференциация
Человеческие кератиноциты проходят терминала дифференциация по обращению с кальция14,,1516. Основная человеческие кератиноциты были изолированы и культивировали как описано в протоколе выше. Когда примерно 50-60% притока, клетки были стимулируется с кальцием (1,2 мм) или автомобиль и фотографии клетки были приняты на день 0, 1 и 2. Рисунок 1 показывает морфологические изменения кератиноциты, наблюдается при стимуляции кальция.
Выражение Involucrin является увеличилось после стимуляции кальция
Культивированный человеческие кератиноциты выросли до примерно 50-60% притока, после чего были стимулировал клетки с кальция (1,2 мм) или транспортное средство для 24 и 48 ч. Мы продемонстрировали, что параллельно с повышенной дифференцировки клеток, как отметил морфологические изменения кератиноциты, выражение mRNA дифференциации маркер involucrin значительно возросло после стимуляции кальция. После 24 и 48 h стимуляции involucrin выражение mRNA был увеличен примерно 5.5-fold и поддирочно, соответственно, по сравнению с транспортного средства (рис. 2).
IL-1β-индуцированной фосфорилирование p38 MAPK
Чтобы определить, если отдельные человеческие кератиноциты реагировать cytokine индуцированной активации внутриклеточных сигнальных путей, культивированный кератиноцитов были стимулируется с ИЛ 1β (10 нг/мл) для различных моментов времени. В течение 5 мин ИЛ 1β стимуляции привело к быстрой активации/фосфорилирование p38 MAPK, как определяется Западный blotting. После 1 h ИЛ 1β-индуцированной p38 MAPK фосфорилирование возвратились базального уровня (рис. 3). Только фосфорилированных форма p38 MAPK было увеличено, как ИЛ 1β стимуляции не влияет на уровень общего белка p38 MAPK (рис. 3).
Рисунок 1 : Представитель изображений кальция индуцированной дифференциации кератиноцитов. Культивированный первичной человеческие кератиноциты были стимулируется с транспортное средство (dH2O) или кальция (1,2 мм) для указанного времени точек. (A - E) Фаза контраст изображения кератиноцитов на день 0 (A), 1 день (B и C) и день 2 (D и E) после стимуляции кальция. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Увеличение выражение mRNA involucrin после стимуляции кальция. Кальций (1,2 мм) или транспортного средства (dH2O) был добавлен в культивированный первичного человека кератиноцитов для указанного времени точек (n = 3). РНК была изолирована и выражение дифференциации маркер involucrin анализ ПЦР. RPLP0 выражение mRNA (рибосомных протеина большой P0) был использован для нормализации. Результаты представляют собой среднее ± с.д. из трех различных экспериментов. p < 0,05 по сравнению с транспортного средства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : IL-1β-индуцированной фосфорилирование p38 MAPK. Культивированный первичной человеческие кератиноциты были стимулируется с транспортное средство (PBS + 0,15% BSA) или ИЛ 1β (10 нг/мл) для указанного времени точек. Экстракты белка были изолированы и западной blotting анализ, используемый для измерения фосфорилированных уровня p38 MAPK и всего p38 MAPK. Равных загрузки была подтверждена инкубации с антитела анти β-актина. Отображаются данные из одного представителя эксперимента из трех. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем, как легко изолировать первичной человеческие кератиноциты от взрослых кожи и как их культуры в пробирке. Эта модель может иметь широкое применение для исследования биологии эпидермальных клеток и может быть полезным для исследователей, заинтересованных в изучении кожных заболеваний.
Некоторые из преимуществ протокола, описанные здесь является то, что в отличие от кератиноцитов, изолированных от новорожденных крайней плоти, полученные из претерпевает обрезания у новорожденных мальчиков, первичный человеческие кератиноциты от взрослых пациентов изолированы от мужчин и женщин и может включать любой возраст ≥18 лет. Таким образом биологическое разнообразие намного больше в эти клетки, по сравнению с кератиноцитов от новорожденных крайней плоти. Кроме того относительно большие куски образцов кожи могут быть получены пациентов, перенесших пластической хирургии, такие, как операции по уменьшению груди или потеря веса хирургии.
Как уже упоминалось выше эпидермиса проводится в разных слоях, соответствующие стадии конкретных дифференциации кератиноцитов. С целью изучения биологии кожи, модели, описанные здесь ограничивается отсутствием трехмерной микроокружения. Различные слои эпидермиса, а также различных типов клеток в коже не подражал в этой модели. Чтобы преодолеть это, могут использоваться эквивалентные модели человеческой кожи, которые состоят из многослойного эпителия, где кератиноцитов дифференцировать под воздействием воздуха жидкость интерфейс и, следовательно, более тесно имитирует родной эпидермис17, 18,19. Другая модель, которая может быть получена с целью изучения биологии кожи является ex vivo кожи модели, в котором хранятся биопсия кожи в культурах в интерфазе воздуха жидкость как описано выше20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. Автор не имеет никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Автор хотела бы поблагодарить за их техническую поддержку Annette Blak Расмуссен и Кристин Мюллер
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J.
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A.
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G.
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
