Summary
La peau agit comme une première ligne de défense contre l’environnement externe. Nous présentons une méthode pour isoler des kératinocytes humains primaires de peau adulte. Ces kératinocytes isolés sont utiles dans nombreuses configurations expérimentales et sont un modèle très approprié pour l’étude des mécanismes moléculaires de la biologie cutanée in vitro.
Abstract
La fonction principale des kératinocytes est d’assurer l’intégrité structurale de l’épiderme, tout en conservant une barrière mécanique au monde extérieur. En outre, les kératinocytes jouent un rôle essentiel dans l’initiation, d’entretien et règlement de la réponse immunitaire épidermique en faisant partie du système immunitaire inné répondant aux stimulations antigéniques d’une manière rapide, non spécifique. Nous décrivons ici un protocole pour l’isolement des kératinocytes humains primaires de peau adulte et de démontrer que ces cellules répondent à la différenciation terminale induits par le calcium, telle que mesurée par une augmentation de l’expression de l’involucrin de marqueur de différenciation. En outre, nous montrons que les kératinocytes isolés sont sensibles aux induite par l’IL-1β activation des voies de signalisation intracellulaires, telle que mesurée par l’activation de la voie de p38 MAPK. Ensemble, nous décrivons une méthode d’isolement et de mise en culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte. Parce que les kératinocytes sont le type cellulaire prédominant dans l’épiderme, cette méthode est utile pour étudier les mécanismes moléculaires de la biologie cutanée in vitro.
Introduction
La peau est le plus grand organe du corps humain et agit comme une barrière protectrice contre l’environnement externe. La peau est composée de deux couches principales : le derme et l’épiderme, où l’épiderme constitue la couche la plus superficielle de la peau. Le type de cellule plus abondant dans l’épiderme est les kératinocytes comprenant plus de 95 % de la masse1,de cellule2. Les kératinocytes sont maintenues à différents stades de différenciation dans l’épiderme et sont organisés en couches basales, épineux, granulaires et cornéocytaire qui correspondent à des étapes spécifiques de différenciation3. La fonction principale des kératinocytes est d’assurer l’intégrité structurale de l’épiderme, produisant ainsi une barrière intacte au monde extérieur.
Les kératinocytes représentent également la première ligne de défense contre les agents pathogènes de la peau et jouent donc un rôle important dans la réponse immunitaire innée4,5. Exposition des kératinocytes aux stimuli externes conduit à l’activation des voies de signalisation intracellulaires et par la suite, la production d’un certain nombre de différents médiateurs inflammatoires, y compris les cytokines, chimiokines et peptides antimicrobiens. Ces protéines dérivées des kératinocytes participent dans la réponse inflammatoire en recrutant et en activant des cellules immunitaires comme les cellules dendritiques, les neutrophiles et spécifiques T cellules6,7. Ainsi, parce que les kératinocytes jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques, la justification de la technique présentée ici était de générer un modèle in vitro pour étudier la biologie de la peau. Cultures de kératinocytes primaire provenant du prépuce néonatal sont souvent utilisés pour étudier la biologie de la peau8,9. Cependant, avec la technique décrite ici, les kératinocytes des deux sexes sont obtenus résultant en une plus grande diversité biologique des cellules.
Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et la génération des kératinocytes humains primaires de peau adulte, y compris l’entretien et la congélation des kératinocytes. L’objectif général de cette méthode est de générer des kératinocytes humains primaires pouvant servir comme modèle pour étudier la biologie cutanée in vitro.
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Protocol
Le prélèvement d’échantillons de peau sur des volontaires adultes sains qui subissent une chirurgie plastique doit être approuvée par le Comité éthique dans les établissements d’accueil. Ce protocole a été approuvé par la régionale Comité éthique de région Midtjylland, à Danemark (M-20110027). La méthode décrite ici provient d’études similaires par Maciaq et al. 10 et Liu et Karasek11.
1. isolement des kératinocytes de la peau humaine
- Commencez par faire les solutions suivantes : 50 mL de solution de glucose de la trypsine et 0,1 % 0,25 % au SPD. Filtre Mix et stérilisent (0,2 µm) la solution. Préparer 10 mL de milieu RPMI 1640 + 2 %, solution FBS, 50 mL de SPD et kératinocytes de milieu sans sérum (KSFM). Ajouter des suppléments de KSFM et 250 µL de gentamycine à 500 mL de KSFM. Réchauffez les solutions à 37 ° C avant utilisation.
- Recueillir la peau des volontaires adultes sains qui subissent une chirurgie plastique. Les échantillons de peau utilisés sont environ 10 cm x 15 cm, mais peuvent varier en taille. Garder la fraîcheur de la peau au titre des transports en transportant des échantillons de peau dans une boîte de Styrofoam contenant un élément de refroidissement. Si nécessaire, l’échantillon de peau peut être stocké à 4 ° C durant la nuit.
- Enlever le gras du dessous de la section de la peau à l’aide de pinces, scalpels et ciseaux stérilisés.
- Boucle de la section de la peau (environ 10 cm x 15 cm) sur une couverture stérile sur le dessus une plaque à l’aide d’aiguilles. Tout d’abord, nettoyer la peau avec une compresse stérile sèche. Puis nettoyer la peau en utilisant un tampon de gaze stérilisé avec l’éthanol à 70 %.
- À l’aide d’un rabot de pied, couper du calque du dessus (épiderme) de la section de la peau et le mettre dans une boîte de Pétri de 9 cm. Puis, immédiatement ajouter 25 mL de la solution de trypsine/SPD/glucose (préparée à l’étape 1.1) de la boîte de Pétri. Incuber 30 min à 37 ° C.
- À l’aide d’une pipette enlever la solution de trypsine/SPD/glucose de la boîte de Pétri et ajouter 10 mL de milieu RPMI 1640 + 2 % FBS pour inactiver la trypsine.
- À l’aide de deux pinces, maintenant libérer les cellules épidermiques dans le milieu par doucement raclage et agitation de l’épiderme et le compartiment par voie cutanée des sections peau.
- La suspension de cellules épidermiques filtrer sur un filtre métallique (taille de trou de 1 mm) et de recueillir dans un tube de 50 mL. Ajouter les sections restantes de la peau dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de milieu RPMI-1640 sans FBS et vortex pour filtre s. 10 la suspension à travers le métal du filtre dans un tube de 50 mL contenant la suspension de cellules épidermiques. Ajouter SPD à un volume total de 50 mL.
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 450 g à la température ambiante.
- Retirez le surnageant et Resuspendre le culot de cellules épidermiques dans environ 10 mL de 37 ° C KSFM selon la taille du culot cellulaire. Compter les cellules en utilisant le bleu de Trypan méthode sous microscope. Le nombre de cellules obtenues à partir d’une section de peau de 10 cm x 15 cm est d’environ 50-100 x 106 cellules. À chaque flacon de culture de2 75 cm, 8 x 106 cellules avec 12 mL de 37 ° C KSFM de transfert. Secouer doucement les flacons de culture pour assurer une distribution uniforme des cellules.
- Incuber les kératinocytes dans un incubateur à 37 ° C avec 100 % d’humidité et 5 % de CO2. Changer le support après 2 jours et trois fois par semaine. Cellules de passage lorsque la culture est anastomosé 70 à 80 %, ce qui prend environ 2 semaines, selon le taux de prolifération des kératinocytes.
2. passage des kératinocytes
- Faire chauffer la quantité appropriée de la solution de trypsine-EDTA 0,05 % à 37 ° C dans un incubateur. Utilisez 4,5 mL de solution de trypsine-EDTA 0,05 % pour un flacon de culture de2 75 cm.
- Éliminer le milieu des cellules et ajouter le flacon de culture 4,5 mL/75 cm2 préchauffée solution de trypsine-EDTA 0,05 % pour les cellules. Placer le flacon de culture dans un incubateur à (37 ° C) et après environ 5 min, vérifier au microscope si les cellules ont commencé à desserrer.
- Quand environ 50 % des cellules sont desserrées, doucement frapper le ballon de la culture contre la main pour desserrer les cellules restantes. Ensuite, pour inactiver la trypsine, ajouter 6 mL de RPMI 1640 + 2 % SVF (37 ° C) dans le flacon de culture de2 75 cm et transférer la suspension cellulaire aux tubes de 50 mL.
- Rincer les flacons de culture avec 3 mL de milieu RPMI 1640 + 2 % FBS et ajouter aux tubes de 50 mL. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 450 g à la température ambiante.
- Remettre en suspension les cellules granulés dans 10 mL de KSFM (37 ° C). Compter les cellules non vides et 3 x 106 cellules de transfert à un flacon de culture de2 150 cm avec 20 mL de KSFM (37 ° C). Agiter doucement le flacon de culture pour assurer une distribution uniforme des cellules. Geler les cellules alors que la culture est anastomosé 80 à 90 %, ce qui prend environ 4 à 6 jours selon le taux de prolifération des kératinocytes (voir la Section 3, gel protocole ci-dessous). Développez les kératinocytes pour générer des stocks congelés appropriés.
3. gel des kératinocytes
- Faire chauffer la quantité appropriée de la solution de trypsine-EDTA 0,05 % à 37 ° C dans un incubateur. Utilisation 9 mL de solution de trypsine-EDTA 0,05 % pour un flacon de culture de2 150 cm.
- Éliminer le milieu des cellules et ajouter le flacon de culture 9 mL/150 cm2 préchauffée solution de trypsine-EDTA 0,05 % pour les cellules. Placer le flacon de culture dans un incubateur à (37 ° C) et après environ 5 min, vérifier au microscope si les cellules ont commencé à desserrer.
- Quand environ 50 % des cellules sont desserrées, frapper doucement le flacon de culture contre la main afin de détacher les cellules restantes. Ensuite, pour inactiver la trypsine, ajouter 12 mL du milieu RPMI 1640 + 2 % SVF (37 ° C) dans le flacon de culture de2 150 cm et aspirer la suspension cellulaire aux tubes de 50 mL.
- Rincer les flacons de culture avec 6 mL de milieu RPMI 1640 + 2 % FBS et ajouter aux tubes de 50 mL. Centrifuger les tubes pendant 10 min à 450 x g à 4 ° C. Préparer la cellule glacée congélation moyen (KSFM + 10 % DMSO).
- Resuspendre le culot dans KSFM + 10 % DMSO, compter les cellules non vides et geler les cellules à une densité de 6 x 106 cellules/mL à l’aide de standard-congélation lente cryoconservation méthodes12.
- Stocker les kératinocytes dans l’azote liquide (phase vapeur) jusqu'à utilisation.
4. le dégel et la culture de kératinocytes congelés
- Rapidement décongeler les flacons congelés appropriés dans un bain-marie à 37 ° C. Utiliser l’éthanol à 70 % pour nettoyer l’extérieur de la cryovial. Transférer le nombre adéquat de cellules (environ 15 000 cellules/cm2) dans une fiole de culture et ajouter immédiatement milieu de croissance pré chauffé (KSFM) dans le flacon de culture.
N’importe quelle taille de flacons de culture peut être utilisé selon le paramétrage de l’expérience. - Utiliser 5 mL de milieu de culture pour un flacon de culture de 25 cm2 .
Remarque : Nos données ont démontré que, en moyenne, 95 % des cellules isolées par le protocole décrit ici sont positifs pour les kératinocytes-marqueur cytokeratine-1413.
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Representative Results
Différenciation terminale induits par le calcium
Kératinocytes humains subissent une différenciation terminale par traitement avec du calcium14,15,16. Des kératinocytes humains primaires ont été isolées et cultivées comme décrit dans le protocole ci-dessus. Quand environ 50-60 % anastomosé, les cellules sont stimulées avec calcium (1,2 mM) ou véhicule et photos des cellules ont été prises le jour 0, 1 et 2. La figure 1 illustre les changements morphologiques des kératinocytes observés lors de la stimulation de calcium.
L’Expression de Involucrin est augmenté après Stimulation de Calcium
Des kératinocytes humains cultivés ont été cultivées jusqu'à environ 50-60 % anastomosé, après quoi les cellules sont stimulées avec calcium (1,2 mM) ou un véhicule pour 24 et 48 h. Nous avons démontré qu’en parallèle avec la différenciation accrue des cellules comme le fait remarquer les changements morphologiques des kératinocytes, l’expression de l’ARNm de l’involucrin de marqueur de différenciation ont augmenté significativement lors de la stimulation de calcium. Après 24 et 48 h de stimulation, l’expression de l’ARNm involucrin a augmenté d’environ 5.5-fold et 3,5 fois, respectivement, comparativement à véhicule (Figure 2).
Induite par l’IL-1β Phosphorylation de p38 MAPK
Pour déterminer si les kératinocytes humains isolés répondaient à l’activation de voies de signalisation intracellulaire induite sur les cytokines, les kératinocytes sont stimulées à l’IL-1β (10 ng/mL) pour divers points dans le temps. Moins de 5 min, IL-1β stimulation conduit à une activation rapide/phosphorylation de p38 MAPK, tel que déterminé par Western Blot. Après 1 h, la phosphorylation de l’induite par l’IL-1β p38 MAPK était rentrés au niveau basal (Figure 3). Seule la forme phosphorylée de p38 MAPK augmentait, comme IL-1β stimulation n’avait aucun effet sur le niveau de protéine totale de p38 MAPK (Figure 3).
Figure 1 : Des images représentatives d’induit par la différenciation des kératinocytes. Des kératinocytes humains primaires ont été stimulées avec véhicule (dH2O) ou de calcium (1,2 mM) pour les points de l’heure indiquée. (A - E) Images de contraste phase des kératinocytes les jours 0 (A), le 1er jour (B et C) et 2 (D et E) après stimulation de calcium. Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Augmente l’expression de l’ARNm d’involucrin lors de la stimulation calcium. Calcium (1,2 mM) ou un véhicule (dH2O) a été ajouté à des kératinocytes humains primaires pour les points de l’heure indiquée (n = 3). L’ARN a été isolé et l’expression de l’involucrin de marqueur de différenciation analysés par qPCR. RPLP0 expression de l’ARNm (Ribosomal Protein grand P0) a été utilisée pour la normalisation. Les résultats représentent la moyenne ± S.D. de trois expériences différentes. p < 0,05 par rapport aux véhicules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Induite par l’IL-1β phosphorylation de p38 MAPK. Des kératinocytes humains primaires ont été stimulées par véhicule (PBS + 0,15 % BSA) ou IL-1β (10 ng/mL) pour les points de l’heure indiquée. Extraits de protéine ont été isolé et de l’Ouest analyse buvard utilisée pour mesurer le niveau phosphorylé de p38 MAPK et total p38 MAPK. Charge égale a été vérifiée par incubation avec un anticorps anti-β-actine. Données d’une expérience représentative sur trois sont indiquées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ici, nous décrivons comment isoler facilement des kératinocytes humains primaires de peau adulte et à leur culture in vitro. Ce modèle peut avoir une large demande d’enquête de la biologie cellulaire épidermique et peut être utile pour les chercheurs intéressés à étudier les maladies cutanees.
Certains des avantages du protocole décrit ici est que, contrairement aux kératinocytes isolées du prépuce néonatal obtenu à partir des mâles nouveau-nés subissant la circoncision, les kératinocytes humains primaires de patients adultes sont isolés des hommes et des femmes et peut inclure n’importe quel âge ≥18 ans. Ainsi, la diversité biologique est beaucoup plus grande dans ces cellules par rapport aux kératinocytes de prépuce néonatal. En outre, relativement gros morceaux d’échantillons de peau peut être obtenues de patients subissant une chirurgie plastique, tels que la chirurgie de réduction mammaire ou chirurgie de perte de poids.
Comme mentionné plus haut l’épiderme est organisé en différentes couches correspondant au stade spécifique de la différenciation des kératinocytes. Afin d’étudier la biologie de la peau, le modèle décrit ici est limité par le manque d’un micro-environnement en trois dimensions. Les différentes couches de l’épiderme ainsi que les différents types de cellules présents dans la peau ne sont pas imités dans ce modèle. Pour y remédier, modèles équivalents de peau humaine peuvent être utilisés, qui consistent en un épithélium multicouche lorsque les kératinocytes se différencient par exposition à une interface air-liquide et donc, plus étroitement imitant l’épiderme native17, 18,,19. Un autre modèle qui peut être obtenu afin d’étudier la biologie de la peau est le modèle de peau ex vivo , dans laquelle les biopsies cutanées sont détenus dans les cultures une interphase air liquide comme décrit précédemment20.
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Disclosures
. L’auteur n’a aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
L’auteur tient à remercier Annette Blak Rasmussen et Kristine Moeller pour leur support technique
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
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