Summary
Directe inspuiting van kanker afkomstige extracellulaire blaasjes (EVs) leidt tot een herprogrammering van beenmerg, ter ondersteuning van de progressie van de tumor; het is echter onduidelijk welke cellen bemiddelen dit effect. Hierin beschrijven we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken EV-gemedieerde tumor-mesenchymale stamcellen (MSC) interacties in vivo, onthullen een cruciale rol voor EV-opgeleide MSCs in metastase.
Abstract
Communicatie in het tumor bijdragen resident of aangeworven mesenchymale stamcellen (MSCs) tot maligne progressie in meerdere soorten van kanker. Onder invloed van specifieke Milieusignalen, kunnen deze volwassen stamcellen paracrine bemiddelaars leidt tot versnelde tumorgroei en uitzaaiing vrijkomen. Het definiëren van de Overspraak tussen tumor en MSCs is van primair belang voor het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de progressie van kanker en identificeren van nieuwe doelstellingen voor therapeutische interventie.
Kankercellen produceren grote hoeveelheden extracellulaire blaasjes (EVs), die diep van invloed kunnen zijn op het gedrag van de doelcellen in de tumor communicatie of op verre locaties. Tumor EVs omsluiten functionele biomoleculen, met inbegrip van inflammatoire RNAs en (onco) eiwitten, die stromale cellen opleiden kunnen om het metastatische gedrag van kankercellen of deel te nemen aan de vorming van vooraf metastatische niche. In dit artikel beschrijven we de ontwikkeling van een preklinische kanker muismodel waarmee specifieke evaluatie van de EV-gemedieerde Overspraak tussen tumor en de mesenchymale stamcellen. Eerst beschrijven we de zuivering en karakterisering van het EVW tumor-uitgescheiden en de beoordeling van de internalisering van de EV door MSCs. We maken dan gebruik van een multiplex kraal gebaseerde immunoassay te evalueren van de wijziging van het MSC cytokine-expressie profiel geïnduceerd door kanker EVs. Tot slot, we illustreren de generatie van een bioluminescente orthotopic xenograft muismodel van osteosarcoom die de tumor-MSC interactie recapituleert, en Toon van de bijdrage van MSCs EV-opgeleid tot tumor groei en metastase vorming.
Ons model biedt de mogelijkheid om te definiëren hoe kanker EVs vorm een tumor-ondersteunende omgeving, en te beoordelen of de blokkade van de EV-gemedieerde communicatie tussen tumor en MSCs voorkomt kanker progressie.
Introduction
De tumor communicatie neemt actief deel aan de meeste, zo niet alle, aspecten van tumorvorming en kanker progressie, met inbegrip van metastase vorming en de ontwikkeling van resistentie tegen therapeutics1. Dit onderstreept de noodzaak van preklinische orthotopic kanker Muismodellen waarmee dissectie van de complexe tumor-stroma-interacties in de niche van de tumor.
Onder de vele cellulaire componenten van de communicatie van de tumor bijdragen mesenchymale stamcellen (MSCs) sterk tot kanker progressie in meerdere soorten kanker zoals kanker van de borst, prostaatkanker, hersentumoren, multiple myeloom en Osteosarcoom2 ,3,4,5,6,7. MSCs zijn multipotente stamcellen, die zich in verschillende volwassen en foetale weefsels bevinden, met inbegrip van het beenmerg, adipeus weefsel, placenta, navelstrengbloed en anderen8,9. In antwoord op kanker gegenereerde inflammatoire signalen, MSCs migreren naar tumor websites integreren in de communicatie van de tumor en uiteindelijk in kanker-ondersteunende cellen10onderscheiden. Deze kanker-geassocieerde MSCs bieden essentiële factoren (dat wil zeggen, groeifactoren, chemokines cytokines en immunosuppressieve bemiddelaars) voor de tumor progressie handelt zowel op tumorcellen en op de omliggende stroma2, 3 , 11 , 12 , 13. terwijl de tumor-bevordering van gevolgen van kanker-geassocieerde MSCs zijn onderzocht in talrijke modellen van de kanker, de mechanismen waardoor tumorcellen MSCs herprogrammeren om de vorm van een kanker-bevordering van niche slecht worden begrepen. Hier beschrijven we de generatie van een orthotopic xenograft model waarmee specifiek de studie van de pro-tumorigene interactie tussen bot kankercellen en MSCs via extracellulaire blaasjes (EVs).
EVW zijn cruciale bemiddelaars van de intercellulaire communicatie tussen tumor en stromale cellen14. EVW voeren functionele biomoleculen van de cel van oorsprong, met inbegrip van eiwitten, lipiden en regelgevende RNAs. Eenmaal uitgebracht in de extracellulaire ruimte, deze blaasjes kunnen worden overgenomen door de omringende cellen of naar verre locaties via het bloed of de lymfatische circulatie, en diep target cel gedrag kunnen beïnvloeden. 15 , 16 , 17 bijvoorbeeld opname van kanker EVs door stromale fibroblasten kan resulteren in myofibroblast differentiatie ondersteunen angiogenese en tumor groei in vivo18,19, internalisering door endothelial versnellen cellen kunnen tumor angiogenese stimuleren en verhogen de vasculaire permeabiliteit16,20, en interactie met immune cellen zou kunnen leiden tot onderdrukking van de antitumorale immuunrespons21.
We onlangs aangetoond, met behulp van een bioluminescente orthotopic xenograft muismodel van osteosarcoom, dat tumorcellen vrij hoge hoeveelheden van het EVW die MSCs prompt te verwerven van een pro-tumorigene en pro-metastatische fenotype. Dit effect is te wijten aan een dramatische verandering in de MSC cytokine-expressie profiel (hierna aangeduid als "MSC onderwijs"), en kan worden voorkomen door de administratie van een therapeutische Interleukine-6 receptor (IL-6R) antilichaam7. Ons werk aangetoond dat kanker EVs cruciale modulatoren van MSC gedrag, waardoor een reden voor communicatie-gerichte benaderingen Osteosarcoom progressie halt toe te roepen. Hierin beschrijven we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken de EV-gemedieerde tumor-MSC interactie in vivo. Dit model is bedoeld om: 1) specifiek de kanker EV-geïnduceerde veranderingen van MSC gedrag definiëren in de communicatie van de tumor, 2) evalueren hoe deze interactie bijdraagt aan tumor botgroei en metastase vorming en 3) studie of verstoren de EV-gemedieerde Overspraak in vivo voorkomt dat de progressie van kanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijk vetweefsel voor isolatie van de mesenchymale stamcellen verkregen is van de Vakgroep plastische chirurgie van het Tergooi ziekenhuis (Hilversum, Nederland) na goedkeuring door de ethische commissie van institutionele en schriftelijke geïnformeerde toestemming. GFP-positieve obesitas MSCs werden verkregen van de afdeling medische en chirurgische wetenschappen voor kinderen en volwassenen (Universiteit van Modena en Reggio Emilia).
Dierproeven zijn uitgevoerd volgens de Nederlandse wet op de dierproeven, en het protocol is goedgekeurd door de Commissie op dierlijke proefneming van de Vrije Universiteit medisch centrum, Amsterdam, Nederland.
1. isolatie van extracellulaire blaasjes Tumor-uitgescheiden.
- EV-verarmd foetale boviene Serum (FBS) bereiden door centrifugeren FBS bij 70.000 x g's nachts (16 uur), geen rem, bij 4 ° C met behulp van een ultra swingende emmer rotor (verwacht 1 h voor vertraging). Zorgvuldig verzamelen het supernatant (EV-verarmd FBS) zonder de pellet te verstoren. De EV-verarmd FBS filteren met een 0,22 µm filter.
- Bereiden kweekmedium EV-uitgeput door aanvulling van de Iscove bewerkt Dulbecco Medium (IMDM) met 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, 2 mM glutamine (1 x P/S/G) en 5% FBS EV-uitgeput.
- Zaad van 3 x 106 143 cellen in 175 cm2 kolven en hen in een kweekvloeistof EV-uitgeput in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2cultuur. Als de cellen zijn 80-90% heuvels (meestal na 36 h tot 48 h), verzamelen het supernatant 8 x 175 cm2 flacons (28 mL/kolf) voor EV-isolatie.
- Vooraf duidelijk het supernatant van de cel voor het verwijderen van cellen en cel puin door differentiële centrifugeren (centrifugeren het supernatant van de vorige draai telkens) overeenkomstig de onderstaande voorschriften:
- Centrifugeer het supernatant tweemaal bij 500 x g gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer het supernatant tweemaal bij 2000 x g gedurende 15 minuten.
- Centrifugeer het supernatant tweemaal bij 10.000 x g gedurende 30 min.
- Alle centrifugations bij 4 ° C met maximale acceleratie en vertraging snelheidsstanden uitvoeren Na elke stap zorgvuldig verzamelen het EV-bevattende supernatant, ongeveer 1 mL achterlatend. Ga onmiddellijk om te stap 1.5 of winkel de vooraf gewiste geconditioneerd medium bij-80 ° C tot EV isolatie.
- EVs isoleren door centrifugering van het vooraf gewiste geconditioneerde medium eenmaal bij 70.000 x g gedurende 1 h, rem, bij 4 ° C in ultra-centrifuge buizen (eindvolume 38.5/tube mL) met behulp van een ultra swingende emmer rotor traag.
- Verwijder voorzichtig het supernatant, waardoor ongeveer 1 mL achter, resuspendeer de EV-bevattende pellets in het resterende volume, bundelen ze allemaal in één ultracentrifuge buis, en toevoegen-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot complete buis vulling (eindvolume 38.5 mL).
- Centrifugeer nogmaals bij 70.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C, zonder rem (verwacht 1 h voor vertraging). Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de pellet voorzichtig en 100-200 µL achterlaten.
- Resuspendeer de EV-pellet en het uiteindelijke volume aan 200 µL met PBS (gestandaardiseerd voor alle EV-isolatie). De EV-voorbereiding onmiddellijk gebruik of Bewaar bij-80 ° C tot gebruik22.
Opmerking: EVs kunnen worden opgeslagen tot 6 maanden bij-80 ° C.
2. EV karakterisering.
Gezuiverde EVs kunnen worden gevisualiseerd door Transmissie Electronenmicroscopie (TEM)23.
- Mix EV preps met een gelijk volume 4% paraformaldehyde in fosfaatbuffer.
- Jas 200 mesh Formvar-koolstof-coated nikkel TEM rasters met 5 µL van EV schorsing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Fixeren van de EV monsters op TEM grids met 1% Glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7.0), contrast met uranyl oxalaat (pH 7.0) en insluiten in een mengsel van 4% uranyl acetaat en 2% methylcellulose in een verhouding van 1:9 op ijs.
- Verwijder grids met roestvrij stalen lussen en vlek het overtollige vocht met filtreerpapier om een juiste dikte van de methyl cellulose.
- Na het drogen, rasters met een transmissie-elektronenmicroscoop onderzoeken en fotograferen met een digitale camera die is gekoppeld aan de bijbehorende afbeelding software.
3. onderwijs van MSCs door tumor afkomstige EVs.
- Bereiden van MSC kweekmedium beogen alpha-minimum essentiële medium (alpha-MEM) met 4% EV-verarmd menselijke Lysate bloedplaatjes (hPL)24, heparine (10 U/mL) en 1 x P/S/G.
Opmerking: EV-verarmd hPL is verkregen na de in punt 1.1 beschreven procedure. - Zaad 1.4 x 106 adipeus afkomstige MSCs per 75 cm2 kolf en cultuur hen in EV-verarmd MSC-kweekmedium in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Wanneer cellen bereiken de samenvloeiing van de 70% toe te voegen 143 Osteosarcoom - of controle van menselijke fibroblasten (hf)-EVs, 10 µL EV voorbereiding/cm2 van cultuur kolf. Incubeer gedurende 24 uur en voeg evenveel van het EVW voor extra 6 uren. Opmerking: Menselijke fibroblasten worden gekweekt in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) 10% FBS en EVs zijn geïsoleerd zoals beschreven in sectie 1.
- Verzamelen van het supernatans dat MSC, centrifugeer 1 x bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C (met maximale acceleratie en vertraging snelheidsstanden), overbrengen naar een nieuwe buis en opslaan van de gewiste supernatant bij-80 ° C om toekomstige cytokine analyse (sectie 5).
- Voor in vivo experimenten (punt 6), GFP-positieve MSCs25 opvoeden zoals beschreven in de punten 3.1 tot 3.3, verzamelen van de cellen en resuspendeer hen in PBS op een eindconcentratie van 106 cellen per 100 µL. Houd cellen op ijs tot injectie.
4. EV internalisering Assay.
Label om te visualiseren EV ICT door MSCs, EVs met een linker groen-fluorescerende kleurstof (GFLD) (Los verkrijgbaar) volgens protocol van de fabrikant:
- Kort, voeg 180 µL verdunningsmiddel aan de 200 µL EV prep. Verdunnen 1 µL van GFLD kleurstof in 50 µL verdunningsmiddel, en 20 µL van verdunde kleurstof toe te voegen aan de verdunde EV prep.
- Zacht mengen door pipetteren en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Voeg 5 mL 0,1% BSA in PBS, ultra-centrifuge buizen overbrengen en vul de buis met PBS (eindvolume 38.5 mL/buis).
- Centrifugeer 1 x bij 70.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C, zonder rem (verwacht 1 h voor vertraging). Zorgvuldig Verwijder het supernatant en resuspendeer de gelabelde EV-pellet in een eindvolume van 200 µL (het volume met PBS).
- De gelabelde EVs toevoegen aan de MSC cultuur of bewaar ze bij-80 ° C. Na een incubatieperiode van overnachting, beoordelen vesikel internalisering door fluorescentie microscopie en stroom cytometry7.
5. beoordeling van MSC Cytokine-expressie profiel.
- Voor multiplex kwantificering van Interleukine-8 (IL-8), interleukine-1β (IL-1β), Interleukine-6 (IL-6), interleukine-10 (IL-10), tumor necrose factor (TNF) en interleukine - 12p 70 (IL - 12p 70) eiwitniveaus in de MSC geconditioneerd medium (zie stap 3.4), gebruiken een verkrijgbare cytometrische kraal matrix (KBA) voor menselijke inflammatoire cytokines na instructies van de fabrikant.
- Kort, meng de antilichaam-geconjugeerde vangen kralen en toe te voegen aan alle assay buizen. De standaard verdunningen van cytokine of de geconditioneerde middellange monsters toevoegen aan de buizen.
- Voeg het detectie-reagens en incubeer 3 uur op RT.
- Wassen van de kralen met de meegeleverde wassen-oplossing. De monsters met behulp van een cytometer van de stroom meten en analyseren van gegevens volgens de instructies van de fabrikant.
6. generatie van een Orthotopic Xenograft muismodel van osteosarcoom.
- Kunnen muizen in de zes weken oude, vrouwelijke, de Athymic naakt-Foxn1nu om te acclimatiseren gedurende minstens één week vóór het begin van de experimentele procedures.
- Paracetamol een dag vóór de chirurgische ingreep en als peri-operatieve analgesie toevoegen aan het drinkwater. Verdun "paracetamol oplossing voor kinderen" (Zie Tabel van materialen) met water om een eindconcentratie van 2 mg/mL. Op basis van de inname van een gemiddelde water van 150 mL/kg/dag, en een gemiddeld lichaamsgewicht van 20 g, deze dosering is voldoende om te bereiken een dosering van 6 mg/mouse/dag (300 mg/kg/dag).
- Doorgaan pijnstillende behandeling tot 24 uur na de operatie, of langer indien de dieren tekenen van pijn vertonen.
- Op de dag van de chirurgische ingreep, verzamelen van gekweekte luciferase-positieve (Fluc) 143 cellen (voorheen gegenereerd door lentivirale transductie) door centrifugatie bij 300 x g gedurende 10 minuten en resuspendeer de cellen bij een concentratie van 2 x 10,5 cellen/µL in PBS. De celsuspensie op ijs blijf tot 6 uur.
- Autoclaaf chirurgische apparatuur. Bereiden en schoonmaken van het werkgebied en plaats de gesteriliseerde schaar en pincet op steriele lakens. Twintig minuten vóór de chirurgische ingreep (stap 6,8), injecteren de dieren subcutaan met buprenorfine (0,05 mg/kg, verdund in een zoutoplossing 0,9%) als pijnstiller met 0,5 mL insuline spuiten (29-gauge naald).
- Net voor de anesthetizing van elk dier, een 10 µL spuit te vullen met ten minste 1 µL van de geconcentreerde (Fluc) 143 celsuspensie (zie stap 6.4).
- Anesthetize van het dier met Isofluraan inademing verdoving (2-3% in zuurstof). Controleer het niveau van verdoving door teen-knijpen van het dier. Wanneer het dier niet reageert op de knijpen, dat wil zeggen, die het is diep verdoofd, past u de zalf op de ogen om te voorkomen dat droogte tijdens anesthesie.
- Plaats het dier op zijn rug met het hoofd in een verdoving masker en met de benen richting de exploitant. Buig de linkerknie. Veeg de huid met 70% ethanol en toepassen van lidocaïne (2%) met een katoen-tip 3 keer als lokale pijnstiller.
- Gebruik een steriele chirurgische mes om een kleine incisie (ongeveer 5 mm) op de huid net onder de knie het onderbeen bloot te stellen. Boor een gaatje in het scheenbeen, ongeveer 2 mm onder de knie met behulp van een 0.8 mm micro twist drill. Wees voorzichtig niet te boren door beide cortices van de tibia.
- Injecteren 1 µL celsuspensie (ongeveer 2 x 105 cellen) langzaam (in ongeveer 5 seconden) in het gat met behulp van een naald 26-gauge. Sluit het gat met een druppel van weefsel lijm om te voorkomen dat terugvoer van de schorsing.
- Sluit de huid met monofilamenten hechtingen en één druppel van weefsel lijm. Laat het dier herstel in een goed verwarmde omgeving (gebruik een warmte lamp). Laat geen dieren zonder toezicht totdat ze hebben herwonnen voldoende bewustzijn te handhaven sternale ligcomfort. Pas nadat de dieren zijn volledig hersteld van anesthesie, terugsturen naar hun eigen kooien.
- Twee dagen na inoculatie van de tumor, injecteren EV opgeleid of naïef GFP-positieve MSCs (106 cellen in 100 µL PBS, zie stap 3.5) intraveneus met een 0,5 mL insuline spuit in de trant van de staart van de muizen.
- Volg tumorgroei door bioluminescentie imaging26 tweemaal per week. Te dien einde, de muizen i.p. te injecteren met 150 µL D-luciferine (30 mg/mL) met een insuline spuit. Tien minuten na de injectie, plaatst u de dieren in de Bioluminescentie imaging systeem en meet de foton-flux gegenereerd door tumorcellen.
- Daarnaast meet de diameter van de primaire bot-tumor met een remklauw. Het volume van de tumor (in mm3) wordt geschat door breedte x lengte2 x 0,5.
- Opmerking: Humane eindpunten worden gedefinieerd als de diameter van de tumor > 15 mm of gewichtsverlies > 15%.
7. beoordeling van de Long knobbeltje nummer
- Wanneer een van de dieren bereikt het humane eindpunt gedefinieerd in stap 6.14 (in ongeveer 3-4 weken), het experiment beëindigen en verzamelen en analyseren alle relevante weefsels.
- Tien min vóór euthanization, injecteren 150 µL D-luciferine (30 mg/mL) met een 0,5 mL insuline spuit.
- Anesthetize van de dieren met Isofluraan inademing verdoving (zie stap 6.7). Bevestig de diepte van de verdoving door de afwezigheid van reactie van de muis op de teen-knijpen. De muizen door cervicale dislocatie27euthanaseren.
- Verzamelen van de longen, de lever, de milt en de nieren met behulp van gesteriliseerde schaar en pincet. Het wassen van de organen in PBS te verwijderen sporen van bloed en leg ze op een petrischaal.
- Plaats de petrischaal met de organen in de Bioluminescentie imaging systeem. Het signaal van de Bioluminescentie aan beide zijden van de organen meten. Duik onmiddellijk na het meten, de orgels in 4% formaline te fixeren ze (24-72 uur, bij RT) voor toekomstige histologische analyse.
- Verwerken van de verkregen foto's met de juiste imaging software door handmatige drempelmethode. Het aantal lung nodules op elke foto. Tel het totale aantal Long knobbeltjes aan beide zijden van de longen.
8. histologische analyse
- Voor histologisch analyse van de weefsels van de longen:
- De organen van formaline-vaste inbedden in paraffine en 6 µm weefsel dia's voor te bereiden.
- Deparaffinate het longweefsel dia's en het uitvoeren van antigeen ophalen door ze te koken gedurende 15 min. in 0,01 M citraat buffer (pH 6).
- Incubeer de dia's horizontaal bij kamertemperatuur met anti-menselijke vimentin 1:150 van het antilichaam (200 µg/mL) verdund in antilichaam-oplosmiddel (Los verkrijgbaar) en vervolgens met het secundaire, HRP-gelabeld antilichaam (0,5 mg/mL, verdunning 1:500). De weefsels met 3'-diaminobenzidine (DAB) en Haematoxyline teller kleuring vlekken.
- Observeer de gekleurd weefsel dia's met behulp van een optische Microscoop, gekoppeld aan de corresponderende camera en de software van de afbeelding.
- Om te beoordelen van de aanwezigheid van GFP-positieve MSCs in muis zijn verbeend:
- Decalcify de zijn verbeend in ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) 0,24 M, pH 7,2-7.4. Vernieuwen EDTA-buffer om de andere dag tot botten flexibel geworden (ongeveer 1 week).
- Zijn verbeend uitdrogen en infiltreren ze met parafin. Het zijn verbeend (met inbegrip van osteosarcoom weefsel) in de paraffineblokken insluiten.
- Gebruik een microtoom te bereiden 6 µm paraffine secties. Plaats de paraffine secties in glas dia's. Na het drogen, dia's 's nachts bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
- Uitvoeren van warmte-gemedieerde antigeen ophalen met behulp van citraat buffer (zie 8.1.2) en de weefsels met anti-GFP antilichaam (hele antiserum) vlek in een verdunning van de 1:900 in antilichaam-verdunningsmiddel. Counterstain de weefsels met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Observeer de weefsel dia's met een fluorescentie Microscoop gekoppeld aan de corresponderende imagingsoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie verkenden we het vermogen van osteosarcoom-uitgescheiden EVW te voeden MSCs naar een pro-tumorigene en pro-metastatische fenotype. We laten zien dat Osteosarcoom cellen release exosome-achtige EVs die door MSCs zijn geïnternaliseerd. Wij de wijziging van het MSC cytokine-expressie profiel geïnduceerd door kanker EVs gemeten en geëvalueerd van het effect van de EV-opgeleide MSCs op de tumorgroei en metastase vorming. De algemene vertegenwoordiging van het studie-ontwerp is geïllustreerd in Figuur 1.
EVW uitgebracht door 143 Osteosarcoom cellen of controle menselijke fibroblasten werden gezuiverd door differentiële centrifugeren. EV zuiverheid werd bevestigd door elektronenmicroscopie, waaruit bleek dat de voorbereidingen bevatte hoofdzakelijk blaasjes met een diameter variërend tussen de 40-100 nm(Figuur 2). Om te beoordelen of kanker EVs interactie met MSCs, we de blaasjes met een lipofiele linker groen-fluorescerende kleurstof (GFLD) en label ze 's nachts geïncubeerd met de doelcellen. Door fluorescentie microscopie nageleefd wij efficiënte opname van de EV door MSCs (Figuur 2B). Stroom cytometry analyse toonde bovendien aan dat Osteosarcoom en controle EVs zijn geïnternaliseerd met vergelijkbare efficiëntie (Figuur 2C). Om te onderzoeken of Osteosarcoom EVs de immunomodulerende eigenschappen van MSCs wijzigen, gebruikten we een multiplex kraal gebaseerde cytokine-immunoassay, waaruit bleek dat de tumor EVs een 2-fold stijging van de productie van IL-8 en IL-6 bepalen, vergeleken met de menselijke fibroblast controle EVs (Figuur 2D, E).
We gebruikt om te onderzoeken of Osteosarcoom EVs MSCs opvoeden te nemen een pro-tumorigene en pro-metastatische fenotype, een bioluminescente, orthotopic xenograft muismodel van osteosarcoom. Alle dierproeven werden uitgevoerd door één exploitant. Metastatische 143-Fluc cellen werden overgeplant in het scheenbeen van athymic naakt muizen en, na twee dagen, Osteosarcoom-xenografted muizen werden onderworpen aan een eenmalige toediening van GFP-positieve EV opgeleide MSCs. muizen ontvangen naïef (niet-opgeleide) MSCs of geen MSCs werden gebruikt als controlegroep. Geen dieren stierf voordat de beschreven eindpunten. We toonden door meting van de remklauw en bioluminescentie imaging (BLI) dat muizen met EV-opgeleide MSCs behandeld had versnelde tumorgroei vergeleken met controlegroepen (Figuur 3A). Representatieve beelden van tumor grootte van elke behandeling arm worden weergegeven in Figuur 3C. Onze gegevens blijkt dat een enkele i.v. toediening van opgeleide MSCs is van invloed op de progressie van de tumor zo spoedig dag 10 na inoculatie (Figuur 3B). Bovendien, kunnen vier dagen na systemische injectie van opgeleid/naïef GFP-uiten MSCs (Figuur 4,A), wij visualiseren GFP-uiten cellen in het beenmerg (Figuur 4B) zowel in de tumor weefsel (Figuur 4 C), demonstreren MSC homing naar de site van de tumor.
Ex vivo BLI analyse van longen, lever, nieren en milt (gegevens niet afgebeeld) toonde Long knobbeltje vorming uitsluitend in de longen bij muizen van alle armen van de behandeling (Figuur 4D-F). Opvallend, muizen ontvangen EV opgeleide MSCs had hoger aantal Long metastasen in vergelijking met muizen ontvangen niet-opgeleide MSCs of geen MSCs (Figuur 4G), verhoging van de MSCs de metastatische suggereren dat de communicatie van de tumor in opgeleid potentieel van osteosarcoom cellen in vivo7.
Figuur 1 . Schematische voorstelling van de studie ontwerp. Menselijke primaire MSCs zijn opgevoed met EVs geïsoleerd uit gekweekte metastatische Osteosarcoom (143) cellen. Kanker EV zuiverheid is beoordeeld door elektronenmicroscopie, en internalisering door MSCs is gevisualiseerd door fluorescentie microscopie en geanalyseerd door stroom cytometry. Wijzigingen in het profiel van MSC cytokine-expressie worden geëvalueerd door cytometrische kraal matrix (CBA). De rol van EV opgeleid te definiëren MSC op de tumorgroei en metastase vorming, Osteosarcoom dragende muizen zijn ingespoten met EV-opgeleid (of naïef) MSC. Tumorgroei wordt gevolgd door bioluminescentie beeldvorming (BLI) en remklauw meting, terwijl metastase vorming wordt geëvalueerd op de experimentele eindpunt door ex vivo BLI en histologische analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Zuivering van EVs en hun interactie met MSCs. (A) Transmissie Electronenmicroscopie opname van het EVW geïsoleerd uit 143 cellen (schaal bar: 100 nm). (B) opname van GFLD-label 143 EVs door MSCs beoordeeld door fluorescentie microscopie (schaal bar: 10 µm). (C) internalisering van GFLD-label 143 EVs (oranje) of besturingselement (menselijke fibroblast, hf) EVs (groen) door MSCs zoals geanalyseerd door stroom cytometry. (D) Multiplex detectie van inflammatoire cytokines in het supernatant van MSCs blootgesteld aan 143 (143 EV-MSC) of hf-EVs (hf EV-MSC) door cytometrische kraal array. 143-MSC express hogere niveaus van IL-6 en IL-8 t.o.v. controle (onbehandeld en hF EV-behandeld) MSCs. De stippellijnen geven de verschuiving van cytokine productie. (E) IL-8 en IL-6 eiwitconcentratie in de geconditioneerde media MSCs EV-behandeld als geanalyseerd door cytometrische kraal array, uitgedruct in vouwen inductie ten opzichte van de onbehandelde controle. Gegevens worden uitgedrukt als bedoel ± SD, n = 2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Bioluminescente, orthotopic xenograft muismodel van osteosarcoom. (A) schatting van tumor volume met behulp van de remklauw metingen, en (B) tumorgroei gemeten door bioluminescentie imaging (BLI). De grootte van de tumor wordt uitgedrukt als foton-flux (fotonen/sec). p < 0,01, niet-opgeleide MSC (n = 6) vs opgeleid MSC (n = 6), ongepaarde t-test. Gegevens worden uitgedrukt als bedoel ± SEM. (C) vertegenwoordiger BLI beelden van muizen met gevestigde Osteosarcoom tumoren (bovenste paneel). Kleurenschaal bar varieert van 7,7 x 107 (paars) tot en met 2.6 x 108 (rood) fotonen/sec. In het onderste paneel, is de tumor gebied zonder BLI overlay gevisualiseerd. Pijlen geven aan dat de bulk van de tumor. Schaal bars: 0.6 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Imaging van MSCs en ex vivo longweefsel. (A) fluorescentie microscopie beeld van gekweekte GFP-positieve adipeus afkomstige MSCs (groen). (B) immunofluorescentie kleuring van GFP-positieve MSCs in het beenmerg en (C) in de tumor weefsel van MSC-ontvangst muizen (groene: MSCs, blauw: DAPI gekleurd kernen; schaal bar 10 µm). (D-F) Ex vivo bioluminescentie imaging (BLI) weergegeven: hoger aantal metastatische foci in muizen ontvangen EV opgeleide MSCs (F) in vergelijking met muizen ontvangen naïef MSC (E) of geen MSC (D). Kleurenbalk schaal varieert van 1 x 106 (paars) tot 1,5 x 106 (rood) fotonen/sec. (G) kwantificering van longkanker metastase nummer zoals gevisualiseerd door BLI (lijnen vertegenwoordigen de mediaan; * p < 0,05, een eenzijdige t-test). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumor-uitgescheiden extracellulaire blaasjes (EVs) kunnen wijzigen en de Fysiologie van lokale en verre mesenchymale cellen voor het genereren van een tumor-ondersteunende omgeving. Hier beschrijven we de generatie van een preklinische muismodel van osteosarcoom waarmee dissectie van de EV-gemedieerde interacties tussen tumorcellen en mesenchymale stamcellen cellen (MSCs) in vivo. We laten zien dat systemische injectie van menselijke tumor EV opgeleide MSCs in muizen die Osteosarcoom xenografts sterk groei en metastase vorming van kanker bevordert door het activeren van de IL-6/STAT3 signalering traject7.
Recente studies hebben aangetoond dat kanker EVs kunnen steun bij de vorming van de vooraf metastatische niche door een wijziging van het gedrag van lokale of beenmerg-afgeleide stromale cellen16,28,29. Deze studies zijn meestal uitgevoerd door het rechtstreeks injecteren van kanker afkomstige blaasjes in de ontvangende muis, die de identificatie van het verantwoordelijk voor de gevolgen van tumor-bevordering van celtypes bemoeilijkt. In ons protocol, de opvoeding van MSCs met kanker EVs treedt op in vitro voorafgaand aan MSC injectie. Deze benadering kunt aanpakken van de specifieke bijdrage van de tumor-MSC Overspraak op de progressie van kanker, en minimaliseert storende indirecte effecten van kanker EVs op andere onderdelen van de lokale of systemische omgeving.
Om te beoordelen of de opgeleide MSCs home naar de site van de tumor, geïnjecteerd we systemisch GFP-positieve MSCs in de trant van de staart van de tumor-dragende muizen. Staart ader injecties zijn een cruciaal, maar technisch uitdagende stap in vele experimentele protocollen. Minimale variatie tussen injecties, zodat moet de procedure worden uitgevoerd door ervaren onderzoekers. Juiste intraveneuze toediening kan visueel worden bevestigd door het observeren van de beweging van de vloeistof via de ader. Als een witte vlek op de staart verschijnt of weerstand wordt aangetroffen tijdens de injectie, werd vasculaire toegang niet bereikt. In dit geval moet de procedure worden herhaald door het invoegen van de naald boven de eerste injectieplaats. Omdat MSCs gemakkelijk thuis in op de tumor, kan succesvolle beheer van (GFP-positief) MSCs worden bevestigd door immunofluorescentie kleuring van het weefsel van de tumor en het beenmerg vier dagen na injectie (Figuur 4B, C).
We laten zien dat kanker-uitgescheiden EVs een tumor-ondersteunend fenotype in MSCs veroorzaken door een wijziging van de productie van inflammatoire cytokines. Deze bevinding is met name relevant sinds immuun modulatie en tumor immuun belastingontduiking zijn belangrijke mechanismen in kwaadaardige progressie. Onze gegevens blijkt dat kanker EVs misschien direct, zoals gerapporteerd door onafhankelijke studies21,30,31,32,33, of indirect (via MSCs) aangeboren of adaptieve immuunsysteem beïnvloeden onderdelen. Het gebruik van een xenograft (immuungecompromitteerde) model beperkt echter de mogelijkheid te onderzoeken van dit aspect van het EVW. Soortgelijke benaderingen in immunocompetent of gehumaniseerd Muismodellen moeten dus plaatsvinden de rol te definiëren van de EV-gemedieerde tumor-MSC-immuun cel interacties in kanker.
Tot slot, omdat MSCs kunnen worden aangeworven uit het beenmerg of de bronnen van andere weefsel aan tumors, onze methode is niet beperkt tot de studie van bot kanker, maar kan worden toegepast voor het onderzoek naar de rol van tumor EV opgeleide MSCs in meerdere kanker typen2, 3 , 4 , 5 , 6, als recente studies in melanoom en lymfoom modellen bevestigen34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
S.R. Baglio werd gesteund door een fellowship door Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) medegefinancierd door de Europese Unie. Bovendien heeft dit project ontvangen financiering van de Europese Unie Horizon 2020 programma voor onderzoek en innovatie onder de Marie Sklodowska-Curie-Subsidieovereenkomst geen 660200 (S.R. Baglio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor |
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM |
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera |
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope |
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |
| Incubator | Nuaire | 4750E | |
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer |
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill |
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill |
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |
| Autoclave | Astell | n.a. | |
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |
| Culture media | |||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |
| heparin | LEO | 012866-08 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |
| Cells | |||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced |
| Disposables | |||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes |
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |
| Petri dish | Sigma - Aldrich | P7612 | |
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |
| Reagents / kits | |||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife |
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 |
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids |
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 |
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |
| Mice experiments | |||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |
| Sutures | Ethicon | V926H | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
- Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795 (2013).
- Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
- Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
- Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
- Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
- Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31 (2017).
- Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
- Huang, W. -H., Chang, M. -C., Tsai, K. -S., Hung, M. -C., Chen, H. -L., Hung, S. -C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
- Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
- Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
- Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
- Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
- Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
- Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
- Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127 (2015).
- Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
- Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
- Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
- Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
- Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
- Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).
