Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Udnytte 18F-FDG PET/CT billeddannelse og kvantitative histologi at måle dynamiske ændringer i glukose stofskifte i musemodeller af lungekræft

Published: July 21, 2018 doi: 10.3791/57167
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 1, 4, 5, 1
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California Los Angeles David Geffen School of Medicine, 2University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California Los Angeles, 4Andor Technology, 5Division of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles David Geffen School of Medicine

Summary

I denne protokol beskriver vi, hvordan du udnytter [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emissions tomografi og computertomografi (18F-FDG PET/CT) scanning for at måle den tumor metaboliske respons til de målrettede terapi MLN0128 i en Kras/Lkb1 mutant musen model af lungekræft og koblede imaging med høj opløsning ex vivo Autoradiografi og kvantitative histologi.

Abstract

Kendetegnende for avancerede tumorer er et skifte til aerob glykolyse, der måles let af [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positronemissionstomografi (18F-FDG PET) billeddannelse. Co mutationer i proto-oncogene KRAS og LKB1 tumor suppressor genet er hyppige begivenheder i lungekræft, der drev hypermetabolic, glycolytic tumorvækst. En kritisk vej regulering af vækst og metabolisme af disse tumorer er mekanistiske målet på rapamycin (mTOR) vej, som kan målrettes effektivt ved hjælp af Selektiv katalytisk mTOR kinase hæmmere. MTOR hæmmer MLN0128 undertrykker glykolyse i mus forsynet med tumorer med Kras og Lkb1 Co mutationer, omtales som KL mus. Terapi svar i KL mus er først målt af 18F-FDG PET og computertomografi (CT) imaging før og efter levering af MLN0128. Ved at udnytte 18F-FDG PET/CT, er forskere i stand til at måle dynamiske ændringer i glukose stofskifte i genetisk modificerede musemodeller (GEMMs) af lungekræft efter en terapeutisk intervention med målrettede behandlinger. Dette er efterfulgt af ex vivo Autoradiografi og en kvantitativ immunhistokemiske (qIHC) analyse ved hjælp af morfometrisk software. Brugen af qIHC giver mulighed for påvisning og kvantificering af forskellige ændringer i biomarkør profiler efter behandling samt karakterisering af særskilte tumor patologier. Kobling af PET imaging til kvantitative histologi er en effektiv strategi til at identificere metaboliske og terapeutiske reaktioner i vivo i musemodeller af sygdom.

Introduction

Vores forskning har fokuseret på at undersøge og målretning af kræft med mutationer i leveren kinase B1 (LKB1, også benævnt STK11) mutant kræftformer1. LKB1 er en master tumor suppressor, der undertrykker mTOR komplekse 1 (mTORC1) gennem aktivering af AMP kinase (AMPK) fører til regulering af vækst og stofskifte. Derfor, tabet af LKB1 fører til en uhæmmet mTORC1 aktivering, aktivering af HIF1-alpha resulterende i en glycolytic metabolisk fænotype almindeligvis benævnt Warburg virkning2,3,4. LKB1 uvirksomme mutationer fører direkte til udviklingen af en sjælden familiær kræft før disposition syndrom kendt som Peutz-Jeghers syndrom (PJS) som er karakteriseret ved udvikling af godartet mave polypper kaldes hamartomas5 , 6 , 7. Derudover LKB1 ofte Co muterer med mutationer KRAS resulterer i hypermetabolic og aggressive menneskelige lunge tumorer8,9.

Lkb1-relaterede sygdomme er let modelleret i mus. Heterozygous inaktivering af Lkb1 i mus fører til udviklingen af hamartomas præcist modellering PJS10,11,12,13. Derudover sammenfatte Lkb1 mutationer, der er let modelleret i mus nøjagtig kræft fænotyper i lungerne, huden, bugspytkirtlen og bryst14. Fælles mutation af Kras/Lkb1 i lungevæv af Transgene mus, ved hjælp af en Cre recombinase-medieret aktivering af det muterede KrasG12D allel og biallelic sletning af Lkb1, resulterer i dannelsen af aggressive og metastatisk lunge tumorer15 ,16. Karakterisering af KrasG12D; Lkb1- / - (KL) lunge tumorer isoleret fra mus viser disse tumorer har en høj mTORC1 aktivering og er yderst glycolytic, ved hjælp af begge direkte metabolit målinger af glucose og laktat eller måle forbruget af [18F] -2- fluoro-2-deoxy-D-glucose (18F-FDG) af positron emissions tomografi (PET) med computertomografi (CT) 17. MTORC1 hyper-aktivering i LKB1 mutant tumorer giver en klar begrundelse for at teste både allosteriske og katalytisk kinase hæmmere af mTOR til at behandle disse kræftformer.

I en tidligere undersøgelse viste vi, at allosteriske mTORC1 hæmmer rapamycin (RAPA) med held hæmmede væksten af og glykolyse i gastrointestinal (GI) tumorer ved hjælp af en Lkb1+/- transgene musemodel af PJS3. RAPA er i øjeblikket godkendt som en enkelt agent terapi til behandling af renalcellecarcinom men viste begrænset virkning i NSCLC18,19,20. RAPA er en allosteriske mTORC1 hæmmer og kan forbedres gennem udvikling af næste generations mTOR katalytisk kinase hæmmere, der leverer en mere næsten fuldstændig hæmning af mTOR komplekser 1 og 2 (mTORC1 og mTORC2, henholdsvis)21. Stoffer som MLN0128 vurderes nu i prækliniske studier og tidlige fase kliniske forsøg22,23. En nylig undersøgelse fra vores laboratorium viste, at MLN0128 er en potent mTOR hæmmer i menneskelige lunge tumor cellelinjer og vivo i KL GEMMs lung cancer15,16. MLN0128 undertrykt lunge tumor vækst og glukose metabolismen i disse mus24.

I denne undersøgelse drage vi fordel af godt karakteriseret adenoviral Cre-induceret musemodeller af lungekræft initieret af en betinget aktiveret Lox-Stop-Lox-KRASG12D onkogen15,25. Disse KrasG12D mus blev krydset med mus med floxed alleler af Lkb1 (Lkb1L/L) til at generere KrasG12D; Lkb1L/L (KL) mus16. Efter intranasal levering af adeno- eller lentivirus udtrykker Cre recombinase, udvikle KL mus tidligt læsioner af 4 uger efter tumor induktion. Ved 6 uger, tumorer i KL mus ændringen fra adenomatøs tumorer til en mere ondartet, aggressiv svulst fænotype typisk for lunge carcinomer, og ved 8-10 uger udvikle Musene ærligt karcinomer med en 100% penetrans16,26.

Begge PET/CT billeddannelse og kvantitativ Immunhistokemi kan udnyttes til at bestemme de molekylære og metaboliske reaktioner samt de terapeutiske svar i tumorer efter leveringen af målrettede behandlinger såsom MLN012817, 26,27. Beskrevet her er en forsøgsplan, der udnytter 18F-FDG PET imaging til at måle den metaboliske respons til en MLN0128-målrettet terapi. Kobling PET imaging med kvantitative histologi muliggør måling af den molekylære svar på mTOR hæmning og kvantificering af tumor byrde og tumor histologi.

Protocol

Alle procedurerne i protokollen er godkendt af den institutionelle dyrs pleje og bruge udvalg (IACUC) på University of California, Los Angeles.

1. 18F-FDG PET og CT billeddannelse i mus

Forsigtig: Brug beskyttelsesudstyr ved håndtering af radioaktivitet. Følg alle gældende lovgivningsmæssige procedurer, når du håndterer radioaktivitet.

  1. Placer bur med mus at blive afbildet på en varm seng ved 37 ° C 1 h før 18F-FDG injektion til at reducere det brun fedt forbrug af 18F-FDG.
    Bemærk: Fastende mus for 4-16 h kan medvirke til at reducere Myokardie forbruget af 18F-FDG.
  2. Vejer musen og registrere sin vægt.
  3. Bedøver musen ved hjælp af 2-3% isofluran i ilt på 0,5 - 2 L/min i 2-3 min. ved hjælp af en anæstesi salen holdt ved 37 ° C. Sikre, at musen har været bedøvede ved at klemme tå; Ingen reaktion vil være overholdt, hvis musen har været bedøvede. Anvende oftalmologiske salve til øjne til at forhindre enhver tørhed under anæstesi.
  4. Fortynd 18F-FDG (109 min radioaktive halveringstid) i sterilt saltvand i et justeret henfald-korrigeret injektion koncentration på 70-75 µCi/100 µL.
    Bemærk: Følg PET scanner producentens anbefalede 18F dosis for optimal scanner billeddannelse.
  5. Tegne 70-75 µCi med en insulin sprøjte med en 28 G kanyle, måle radioaktivitet dosis ved hjælp af en dosis kalibrator og måling og klokkeslættet. Læg sprøjten i en bly sprøjte indehaveren.
    Bemærk: Mængden af 18F-FDG radioaktivitet i hver dosis er målt med en dosis kalibrator, der er kalibreret mod en standard referencemateriale, som cæsium-137, ifølge producentens protokoller. Tidspunktet for læsning er også indspillet Bestem henfald korrektion.
  6. Punktere den distale ende af musen hale og måle musens blodsukker med en glucometer.
  7. Varm hale i 1-2 min. med en gaze dyppet i varmt vand. Tør halen med 70% isopropanol til at spile hale vene lige før injektionen. Administrere 100 µL af 18F-FDG (hele mængden i sprøjten) med en bolus injektion via de laterale hale vene og registrere tidspunktet for indsprøjtning. Måle den resterende dosis i sprøjten ved hjælp af dosis kalibrator og måling og klokkeslættet.
    Bemærk: Der vil være nogle mængden af sonden venstre i sprøjten. Brugen af insulin sprøjter foretrækkes frem for sprøjter tilsluttet nåle via Luer låse på grund af nedsat mængden af dosis fanget i sprøjte/kanyle efter injektionen er blevet administreret.
  8. Opstille den injicerede mus i anæstesi salen holdt 1,5-2% isofluran ved 37 ° C at give sonde til at blive distribueret via den mus systemisk cirkulation i 1 time før PET-scanningen.
    Bemærk: Det kan være gavnligt at ugyldiggøre blæren inden scanningen skal give mulighed for en lettere 18F-FDG PET visualisering af tumorer implanteret i lavere flankerne af musen.
  9. Efter 1 time, placere musen i en billeddannelse kammer under næse-kegle isofluran anæstesi og ved 37 ° C og sikre dens lemmer på plads med medicinsk bånd i en liggende stilling.
  10. Sted den billeddiagnostiske afdeling i PET/CT-scanneren.
  11. Erhverve PET og CT-scanninger, som beskrevet i PET/CT-scanner manuel28.
    Bemærk: PET billeder er erhvervet for 600 s med en energi vindue af 150-650 keV, rekonstrueret med maksimum-sandsynligheden forventning maksimering med rettelser til foton dæmpning, detektor normalisering og radioisotop henfald (en scatter korrektion var ikke anvendt). CT-billeder er erhvervet i en løbende tilstand for 50 s ved hjælp af en 50 kVp, 200 µA X-ray kilde og en beboelse-bedømmelseskomite detektor, og de er rekonstrueret ved hjælp af Feldkamp algoritme.
  12. Efter PET/CT er afsluttet, fjerne musen fra den billeddiagnostiske afdeling og gør det muligt at inddrive i sit bur. Overvåge musen, indtil den fuldt ud har genvundet bevidstheden og kan opretholde brystbenet recumbency.
  13. Importere de rekonstruerede PET/CT billeder til AKRYLAMID software ved at klikke på filenog derefter åbneog vælge den relevante fil.
  14. Konvertere PET data til enheden for procent-indsprøjtning dosis pr. gram (%ID/g) ved at indtaste dosis på tidspunktet for indsprøjtning efter regnskab for enhver resterende dosis forlod i sprøjten eller til enheden af standardiserede optagelse værdi (SUV) ved desuden at indtaste fagets vægt. For at gøre dette, skal du højreklikke på PET datasæt og finde Angiv feltet %ID/g på fanen Grundlæggende Info . %ID/g tidligere er registreret.
  15. Tegn regioner af interest (ROIs) på tumorer og normale væv (leveren, muskel, lunge, hjerte, hjerne og spæk). For at gøre dette, skal du klikke på Rediger, Vælg Tilføj ROI, Vælg ROI form og navngive ROI. Tegne ROIs over tumorer og væv og justere deres dimensioner til at dække væv af interesse i alle 3 akser.
    Bemærk: For at tage hensyn til forskelle i PET sonde biodistribution mellem dyr, tumor ROI værdier kan yderligere normaliseres ROI værdier i leveren, et godt perfused orgel med minimal glycolytic aktivitet repræsenterer 18F-FDG i omløb. ROI analyser af tumor og normale væv er udført på den samme mus. Lunge tumor læsioner er generelt identificeret ved 18F-FDG PET da 18F-FDG fastholdelse i en normal lunge er relativt lav. CT bruges også til at identificere læsioner, særligt læsioner, der er 18F-FDG ikke begærlighed. En ex vivo -analyse af isolerede lungerne hjælper også til at lokalisere tumoren læsioner.

2. 18F-FDG Autoradiografi

  1. Forberede imaging med 18F-FDG ved at følge trin 1.1-1.12, undtagen nu, fortyndet 18F-FDG i sterilt saltvand på et justeret henfald-korrigeret injektion koncentration af 1.000 µCi/200 µL musen.
    Bemærk: Højere doser af 18F-FDG er brugt i Autoradiografi at tage højde for ekstra prøve behandling tid og en optimal detektering af fosfor plader.
  2. Aflive mus via en dødbringende indånding af isofluran på 5% eller af CO2 (en IACUC-godkendt procedure).
    Bemærk: Cervikal dislokation bør ikke anvendes, da dette kan beskadige lungevæv.
  3. PIN ned mus med den ventrale overflade udsat og spray det med 70% ethanol til mat ned dens hår før indsnittet.
  4. Åbn brysthulen ved at anvende en midterlinjen indsnit, skære væk mellemgulvet og fjernelse af brystet vægge. Udsætte luftrøret ved omhyggeligt at fjerne spytkirtel. Placer bulldog klemme på luftrør som tæt på kæben som muligt, at sikre en stram pasform på luftrøret. Plads 23 G nål knyttet til en 3 mL sprøjte inde i luftrøret nedenfor bulldog klemme og injicere ~ 2 mL af en OCT:PBS (1:1) (Optimal opskæring temperatur: phosphat bufferet saltvand) løsning.
    Bemærk: OLT er meget tyktflydende og er blandet med PBS at give mulighed for en lettere injektion i lungerne.
  5. Fjern nålen fra luftrøret og bruge tang til at klemme på injektion punkt at forhindre enhver utætte OCT:PBS løsning.
  6. Forsigtigt fjerne lungerne fra brysthulen og venstre lap er adskilt fra resten af lungerne. Placer venstre lap i mærket cryomold fyldt med et par dråber i OLT. Når den lunge lap er inde i formen, skal du udfylde cryomold til toppen med OCT.
  7. Gentag den samme procedure med den højre halvdel af lungerne.
    Bemærk: Hvis 18F-FDG signal i hjertet forventes at blive høj, eller hvis lunge tumorer er placeret tæt på hjertet, det kan være gavnligt at fjerne hjertet for at forhindre enhver tracer lækage. Alternativt, hele lungerne kan integreres i et enkelt cryomold. Det er vigtigt at undgå luftbobler, når du arbejder med OCT.
  8. Ved hjælp af lange pincet, placere den forberedte cryomold i en lukket celle ekstruderet polystyrenskum beholder indeholdende en blanding af tøris og isopentane.
    Bemærk: Denne blanding bør være på ca 70 ° C før du placerer cryomold i det til nedfrysning. Efter hærdning bliver OCT sammensatte hvide. Hvis flere prøver behandles på samme tid, kan de frosne prøver i OCT cryomolds lagres midlertidigt på tøris.
  9. Fjerne den frosne blok fra cryomold og montere det på en kryostaten for skæring. Afsnit blok på 4 µm tykkelse ved hjælp af mikrotomen vinger (34°/80 mm, høj profil). Overføre afsnittene væv til et glas dias, der er blevet opbevaret ved stuetemperatur.
  10. Placer modellen dias på en fosfor imaging plade. Pladen anbringes i kassetten og forsigtigt lukke det for at forhindre dias fra skiftende. Gemme kassetten i-20 ° C fryser for plade eksponering, generelt natten over.
    Bemærk: Plader og kassetter skal nedkøles præ-20 ° c før brug. Placere prøverne på-80 ° C er acceptabelt så godt.
  11. Efter eksponering, fjerne dias fra pladen og læse plade på billedet læseren.
  12. Dias kan indpakket i plastfolie og opbevares ved-80 ° C, eller de kan være forberedt på hæmatoxylin og eosin pletter eller Immunhistokemi.

3. høst lungevæv til histologi

  1. Følg trin 2.2-2.4, undtagen nu, i stedet for bruge løsningen i OCT:PBS, injicere 2-3 mL 10% normal bufferet formalin til at ordne lungerne.
  2. Fjern nålen fra luftrøret og bruge tang til at klemme på injektion punkt at forhindre enhver utæt i formalin. Forsigtigt fjerne lungerne fra brysthulen og placere dem i en 50 mL konisk rør indeholdende ~ 20 mL 10% normal bufferet formalin i 16-24 timer til at sikre en fuldstændig fiksering.
    Bemærk: Fastsættelse af lungerne giver mulighed for at bevare de optimale anatomiske funktioner.
  3. Den næste dag, overføre de faste lungerne fra formalin til 70% ethanol og forberede lungerne skal placeres i et væv kassette.
  4. Forberede histologi lungerne ved omhyggeligt dissekere lapper ved hjælp af saks til at skære på gren point mellem 5 fliger, nummereret 1-5 som vist i figur 1D, og placere dem i en ikke-overlappende orientering i væv kassette. Placere et skum pad forsigtigt på lungevæv at holde retningen intakt.
  5. Gemme dissekeret lunge lapper i 70% ethanol indtil paraffin indlejring.
  6. Paraffin-integrere væv i kassetter og skær 4 µm tykt sektioner til farvning, ved hjælp af standard procedurer.

4. væv segmentering og kvantificering ved hjælp af kommerciel Software

  1. Billede hæmatoxylin og eosin (H & E) farves lunge sektioner på en 1,25 X forstørrelse ved hjælp af en kommerciel multispektrale imaging system.
  2. Konvertere billeder til digitale billede kuber og indlæse (Klik på File, derefter på Indlæse spektrale bibliotek) pre-made spektrale biblioteker til H & E.
    Bemærk: De spektrale biblioteker var udviklet på forhånd ved at erhverve spektrale billeder fra enkeltvis farves lunge sektioner, én sektion farves kun med eosin og den anden kun farves med hæmatoxylin, som blev gemt i en open source leverandørejet spektrale bibliotek fil (.csl). Den imaging system har opererer software, der erhverver et billede på hver bølgelængde, der er nødvendig (som defineret af erhvervelse protokol). Disse billeder ("billede terning") er gemt i et open source leverandørejet multispektrale-filformat (.im3). Spectra er udvundet fra billede kuben ved hjælp af morfometrisk software og gemt i separate spektrale biblioteksfiler.
  3. Spektralt unmix pseudo-farvede H & E billeder af hele lungerne ved at klikke på knappen Unmix .
    Bemærk: Urtåge tager mindre end 1 s. Antallet af pixel i hver vævstype var kvantificeres ved hjælp af morfometrisk billede analyse software.
  4. Visualisere hvert billede terning af multispektrale data konverteres til den tilsvarende 3-farve (rød, grøn, blå) billede ved hjælp af øjets bølgelængde-afhængige farve svar convolved med intensiteten af hvert billede.
    Bemærk: De resulterende 3 billeder vises som en standard 24-bit farvebillede.
  5. Pseudo-farve hver ublandet billede ved at skalere billedet i en bruger-valgte farve (f.eks.rød, grøn, lilla, osv.) og tilføje det sammen med de andre pseudo farvede ublandet billeder ind i en standard 24-bit farvebillede.
  6. Du kan bruge standardindstillingerne for alle analyser.
    Bemærk: I almindelighed, da denne slags segmentering er baseret på en visuel vurdering af resultater (dvs., en vurdering af hvor godt segmentering på billeder uden for uddannelse sæt værker), det er vigtigt at ordentligt opdele billederne i uddannelse, test og validering sæt.
  7. Start med 2-3 billeder som en uddannelse sæt (10-15 for menneskelige biopsi prøver), tog om dem, indtil resultaterne ser godt ud, og derefter anvende algoritmen til en anden 2-3 billeder. Derefter, anvende den resulterende algoritme til fuld validering sæt.
    Bemærk: Sandsynligvis nogle omskoling vil være behov for.
  8. Analysere området tumor i hele lungen sektioner ved at beregne den samlede pixelantal for de røde pseudo farvede tumorer i kamre 1-5 af hver mus.
    Bemærk: Den normale væv var pseudo farvet grøn og blood/blod fartøjer var pseudo farvet pink som vist i figur 3. Den gennemsnitlige tumor byrde for hver behandling blev beregnet ved at måle den samlede pixelantal for hver mus i gruppen behandling.

Representative Results

18 F-FDG PET imaging blev udført på KL mus og viste, at tumorer i disse mus var meget glycolytic, som det fremgår af en forhøjet 18F-FDG forbrug (fig. 1A), enig med tidligere offentliggjorte undersøgelser26, 29. En resektion af hele lungerne afslørede tilstedeværelsen af flere tumorer (figur 1B). Musen lungerne kan blive delt op i 5 separate kamre repræsenteret i tallene 1 c og 1 D. Fligene er 1-5 blev mærket på sektioneret lungerne, der var plettet med H & E eller glucose transporter 1 (Glut1) (fig. 1D). Glut1 er en primær transporter af både glukose og 18F-FDG og sit udtryk og lokalisering til plasma membranen af tumorceller korrelerer direkte med 18F-FDG SUV29. En højere opløsning analyse af Glut1 farvning (40 X) i 18F-FDG-ivrig lunge tumorer viser en forhøjet udtryk og lokalisering af transportøren på plasma membran (fig. 1D).

På grund af den begrænsede opløsning PET Imaging, både PET/CT og væv Autoradiografi blev udført. Den højere opløsning af Autoradiografi kan identificere mindre tumorer og/eller heterogenitet af tumor 18F-FDG distribution. Efter induktion tumor blev 18F-FDG PET/CT billeddannelse udført på KL mus (fig. 2A) efterfulgt af Autoradiografi på lungerne isoleret fra disse mus (tal 2B og 2 C). Som det ses i tallene 2B og 2 C, identificeret Autoradiografi to yderligere mindre tumorer, der var positive for 18F-FDG endnu ikke var umiddelbart synlige af PET. Efter Autoradiografi, dias med væv kan også bruges til immunhistokemiske (IHC) farvning af biomarker(s). H & E farvning for tumorer bekræftet tilstedeværelsen af tumorer i den venstre lap (figur 2D).

Næste, 18F-FDG PET imaging blev udført på MLN0128-behandlede KrasG12D; Lkb1- / - mus for at udnytte 18F-FDG som en funktionel biomarkør for glukosemetabolismen i lunge tumorer (figur 3). Vi identificeret som en behandling med MLN0128 håndfast hæmmede mTORC1 signalering og glykolyse som det fremgår af en reduceret 18F-FDG forbrug (tal 3A og 3B). Disse resultater er enig med prækliniske undersøgelser at vurdere MLN0128 i KL mus som tidligere udgivne af vores laboratorium17,27. Endelig, IHC farvning blev udført på tumorer (figur 3C). Tumorer var plettet enten for H & E eller med antistoffer mod phospho-S6, som er en bevaret substratet af mTORC1 og bruges til at angive en mTORC1 aktivering (P-S6) vs inaktivering (S6). Figur 3 C viser en robust hæmning af P-S6 af MLN0128 i KL tumorer i forhold til dem, der er behandlet med et køretøj, som er enig med tidligere offentliggjorte arbejde17. Ud over KRAS understøtter muterede drivere som epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) glycolytic stofskiftet i lunge tumorer så godt. Derfor, vi har testet om hæmning af constitutively aktive mutant EGFR med erlotinib undertrykt 18F-FDG stofskiftet i mus xenografts. Tal 3D og 3E viser, at den menneskelige lunge tumor linje HCC827, som havne et EGFR del19 mutation, viste en betydeligt reduceret 18F-FDG forbrug efter fem dage af erlotinib behandling.

Endelig blev morfometrisk væv analyse udført på sektioneret lungerne og lunge tumorer at kvantificere den samlede tumor byrde samt for at differentiere tumor patologier, der inkluderede væv subtype, nekrose, blodkar fra normal lungevæv og luftrum. KL GEMMs udviklet en kompleks og patologisk heterogene sygdom, der præsenterede sig selv med lunge tumorer af varierende histopathologies. Disse omfatter adenocarcinomer (ADC) og planocellulært karcinom (SCC)-Denne forskelligartethed gør behandlingen af denne kræft en formidabel udfordring. Figur 4 A viser en enkelt H & E farves lunge lap med to store tumorer stede. De højere forstørrelse billeder vist i figur 4B identificere en normal lunge, fartøjer, og luftrummet og tumor nekrose samt adenocarcinom, kendetegnet ved en veldefineret papillære struktur og en planocellulært karcinom. Figur 4 C repræsenterer pseudo-farve af lunge lap og tumor ved hjælp af Inform morfometrisk software. Figur 4 D viser procentdele af normale lunge, fartøjer og individuelle patologier såsom tumor nekrose og tumor undertyper, der segmenteres godt differentieret adenokarcinom fra planocellulært karcinom.

Figure 1
Figur 1 : Metabolisk aktive KrasG12D; Lkb1- / - (KL) mutant lunge tumorer er 18F-FDG positive og udtrykker høje niveauer af glucose transporter 1 (Glut1). Paneler A og B viser en maksimal intensitet projektion [også omtales som en 3-dimensionel (3D) billede] 18F-FDG-PET og CT analyse på nogle FDG-ivrig KL mus husly planocellulære lunge tumorer. Vist er (A) en 3D rekonstruktion og (B) tværgående, sagittal og koronale udsigt over lunge tumor(s) som (T). (C) dette panel viser en hel lunge histologi KL musen afbildet i paneler A og B, enten farvet for H & E (toppanelet) eller med et antistof specifikke for Glut1 (nederste panel). Lunge fliger er nummererede. Skalalinjen = 2 mm. (D) dette diagram repræsenterer orientering og antal lapper i mus (toppanelet) og højere opløsning 40 X billeder af H & E - eller Glut1-farvede tumorer fra dias vises i panelet C for H & E (midterste panel) eller farves med et antistof specifikke for Glut1 (nederste panel). Skalalinjen = 25 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: 18 F-FDG Autoradiografi kan identificere små tumorer, som er metabolisk aktive. (A) denne 18F-FDG PET/CT billede viser 18F-FDG-ivrig tumorer i en KL mus vist som en maksimal intensitet projektion billede. T1 og T2 = tumorer, H = hjertet, B = blæren, K = nyrerne. (B) dette panel viser ex vivo Autoradiografi på serielle sektioner af højre og venstre lunge kamre af musen. Lungerne i venstre og højre paneler er identiske. Lungerne i venstre paneler er pseudo farvet orange. Lungerne i de rigtige paneler er farvet i sort og hvid. Tumorer (T1, T2 og T3) er angivet med pile. (C) Dette er en forstørret visning af Autoradiografi pseudocolored orange (toppanelet) og sort og hvid (nederste panel). (D) dette panel viser H & E farvning af den øverste skive af den venstre lap vises i panelet B. Skalalinjen = 200 µm venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 3
Figur 3 : MTOR hæmmer MLN0128 undertrykker glukose forbrug i lunge tumorer af KL mus som opdaget af 18F-FDG Pet (A) dette panel viser repræsentative 18F-FDG PET/CT billeder af KL mus behandlet med et køretøj (18F-FDG ivrig, venstre) eller MLN0128 (18F-FDG ikke begærlighed, højre). Tværgående (toppanelet), koronale (midterste panel) og sagittal (nederste panel), visninger er vist. Tumorer beskrives med røde linjer; H = hjerte, L = leveren. (B) dette panel viser en kvantificering af SUVmax (%ID/g) mellem køretøj - og MLN0128-behandlede tumorer. (C) dette panel viser H & E og P-S6 farvning af hele lunge sektioner fra KL mus behandlet med køretøjet eller MLN0128. Skalalinjen = 25 µm. (D) dette panel viser repræsentative 18F-FDG-PET og CT billeder af HCC827 EGFR (del19) xenografts pre og post-erlotinib behandling. Tumor (T) er angivet med en pil, K = nyren, B = hjernen. (E) dette panel viser en kvantificering af SUVmax (%ID/g) for HCC827 xenografts før og efter erlotinib behandling. n = 10 tumorer/gruppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Tumor byrde og tumor histologi er kvantificeret bruger morfometrisk software.
(A) dette panel viser H & E farvning af et enkelt museklik lunge lap med en tumor indsamlet fra en KL mus. (B) disse højere opløsning billeder viser planocellulært karcinom (øverst til venstre), den normale lunge, fartøjer, og luftrum (øverst til højre), og godt differentieret papillære adenocarcinom (nederst til venstre) og nekrose (nederst til højre). (C) dette panel viser pseudocoloring af H & E-farvede lunge lap bruger morfometrisk software. (D) dette panel viser procentsatserne for den enkelte lunge lap og tumor patologier målt ved at informere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I denne artikel beskrives en imaging-baserede eksperimenterende tilgang, der udnyttede 18F-FDG PET/CT billeddannelse med qIHC for at måle både de metaboliske og molekylære reaktioner i lunge tumorer efter levering af mTOR hæmmer MLN0128. MLN0128 reduceret effektivt 18F-FDG forbrug, der angiver en betydelig metaboliske respons i tumorer. Ved at sammenkæde PET/CT billeddannelse til immunhistokemi, var vi købedygtig rumligt registrere sektioneret tumorer til 3D PET/CT-billeder og foretage en detaljeret undersøgelse af hele tumorer på cellulære og molekylære plan. Dette gjorde det muligt at bekræfte, at MLN0128 hæmmes mTOR signalering, hvilket bekræfter en på target molekylære reaktion på medicinen i tumorer. Endelig, ved at udnytte kvantitative histologi, vi var i stand til at kortlægge og separat særskilte tumor patologier, såsom samlede tumor masse fra tumor nekrose, definere adenocarcinom fra planocellulært karcinom, og supplere microPET imaging.

MicroPET er i øjeblikket begrænsede af en rumlig opløsning på ca. 1 mm. Derudover kan 18F-FDG fastholdelse i visse væv påvirkes af forskellige faktorer, herunder plasma glucose niveauer, type og varighed af bedøvelsesmiddel eksponering, den miljømæssige temperatur og den generelle sundhedstilstand af dyr, som kan påvirke 18 F-FDG farmakokinetik30. Disse parametre er blevet optimeret til denne protokol, men skal optimeres for hvert dyr model. Reproducerbarhed undersøgelser af 18F-FDG billeddannelse af subkutane tumorer i mus viser en variationskoefficienten for det gennemsnitlige %ID/g ca 15%, hvilket tyder på, at tumor terapeutisk respons af en individuel mus vurderet af 18 F-FDG PET bør være større end denne tærskel betragtes som pålidelig og betydelig31.

Den cellulære og endda subcellulært fordeling af PET røbestoffer kan vurderes af væv Autoradiografi med afsnittene med efterfølgende farves og co registreret med qIHC. Co registrerende PET med CT giver mulighed for en PET billede skal sættes i en anatomiske sammenhæng; Dette er yderst værdifulde, selv med lavt blødt væv kontrast. Manglen på blødt væv kontrast ved CT kan overvindes med magnetisk resonans imaging (MR). Derudover biomarkører for fluorescens billedbehandling kan bruges til at vurdere glykolyse i vivo, men photon absorption og scatter i lunge hulrum kan påvirke den nøjagtige kvantitering eller afsløring følsomhed32. I Resumé giver udnytter hele dyr PET/CT billeddannelse med kvantitative histologi en præcis og real-time kort for tumor biology efter terapeutisk intervention.

Multispektrale imaging (MSI) kan anvendes i enhver situation, hvor et farvebillede kan anvendes. I det mindste MSI giver de samme oplysninger som et farvebillede, og for nogle programmer, MSI kan give mere detaljerede oplysninger om en prøve spektrale egenskaber end en simpel broad-band trefarvet (RGB) billede. I almindelighed, er begrænsninger af MSI dem af farve imaging, bortset fra at MSI er langsommere og tager længere tid at erhverve billeder. Morfometrisk software blev brugt til at opnå reproducerbar, præcis segmentering resultater for billederne og er beskrevet i Tabel af materialer. Der er yderligere kommercielt tilgængelige produkter, der kan bruges til væv segmentering og kvantificering af histologi.

Kompleksiteten af kræft stofskifte indhalingsmetoden Warburg effekt og glukose metabolismen33,34. Det er meget sandsynligt, at tumorer vil let tilpasses enkelt agent behandlinger, der hæmmer glykolysen. Afhængigheden af aminosyrestofskiftet har været veldokumenteret i kræft, og det forventes, at tumorer er afhængige af en række amino acids såsom glutamin, glycin og serin, samt andre metabolitter f.eks frie fedtsyrer35,36, 37. Ud over 18F-FDG, har sonder 18F - og 11C-mærket glutamin, cholin, acetat, 1-(2'-Deoxy-2'-fluoroarabinofuranosyl) cytosin (FAC) og fluorothymidine (FLT) held været anvendt til billede aminosyre, nukleotid, og lipid metabolisme i dyr modeller af kræft38,39,40,41. Automation og individuel tracer radiokemi teknologier kombineret med højere opløsning, højere følsomhed PET scannere vil forbedre tilgængeligheden af PET til at måle forskellige biologiske procedurer42,43. Forståelse af stofskiftet stiger er det logisk at repertoire af PET radiotracers vil stige så godt, gør det muligt for forskere og læger til noninvasively profil tumor stofskifte.

Udnyttelsen af PET/CT billeddannelse og kvantitative histologi adresser kliniske behov, der skal hurtigt omsættes bænk opdagelser til klinisk brug. For at opnå dette, skal forskerne kunne præcist at måle den terapeutiske reaktion samt den erhvervede modstand mod narkotika, som PET/CT billeddannelse muliggør. Desuden PET/CT og immunhistokemisk analyse af lunge tumorer der bruges som standard for pleje til patienter, og således er direkte kan oversættes til klinisk praksis. Vigtigere, identificerer PET/CT billeddannelse let terapi-resistente tumorer, som forskerne kan isolere og afhøre på molekylært niveau for bedre at forstå mekanismerne af sygdom. Dette er en iterativ proces, der har gjort det muligt at bedre at forstå mekanismerne af modstand og designe mere effektive terapeutiske strategier for den kliniske oversættelse.

Disclosures

Kevin P. Francis er ansat af Perkin Elmer. James Mansfield er en offentlig grossist af PerkinElmer, Inc (PKI) aktier på NASDAQ. Forfatterne har intet andet at videregive.

Acknowledgments

Vi takker University of California Los Angeles' Crump Preclinical Imaging-teknologi Center for deres bistand med PET/CT billeddannelse af mus, translationel patologi Core laboratorium og statistik Core på University of California Los Angeles' David Geffen School of Medicine for deres hjælp med tumor prøveforberedelsen og analyse. For finansiering, David B. Shackelford blev støttet af CTSI og KL2 translationel Science Award tildele numre KL2TR000122 og UL1TR000124 ved David Geffen School of Medicine ved UCLA og af den afdeling af Defense lunge kræft forskning Program translationel Forskning partnerskab W81XWH-13-1-0459 og ACS RSG-16-234-01-TBG. Sean T. Bailey blev støttet af en NIH T32 uddannelse grant HL072752 gennem David Geffen School of Medicine ved UCLA. Anthony Jones understøttes af UCLA Tumor celle biologi uddannelsesprogram (USHHS Ruth L. Kirschstein institutionelle National Research Service Award # T32 CA009056). Gihad Abdelhady understøttes af en NIH/NCI mangfoldighed tillæg R01CA208642.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
G8 PET/CT Perkin Elmer CLS139564 Used for 18F-FDG PET and CT imaging of mice
Axio Imager.M2 Zeiss 490020-0003-000 Acquiring images of FFPE lung tumor sections
Inform software Perkin Elmer CLS135781 Morphometric used for image analysis of tumor pathologies
Glut1 antibody Alpha Diagnostics GT12-A IHC staining of FFPE lung tumor sections
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP™ Rabbit mAb Cell Signaling Technologies 4858 IHC staining of FFPE lung tumor sections
MX35 Premier microtome blades  Thermo Fisher Scientific 3051835 Microtome blades for sectioning tissue for autoradiography

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shackelford, D. B., Shaw, R. J. The LKB1-AMPK pathway: metabolism and growth control in tumour suppression. Nature Reviews Cancer. 9 (8), 563-575 (2009).
  2. Shaw, R. J., et al. The LKB1 tumor suppressor negatively regulates mTOR signaling. Cancer Cell. 6 (1), 91-99 (2004).
  3. Shackelford, D. B., et al. mTOR and HIF-1alpha-mediated tumor metabolism in an LKB1 mouse model of Peutz-Jeghers syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11137-11142 (2009).
  4. Faubert, B., et al. Loss of the tumor suppressor LKB1 promotes metabolic reprogramming of cancer cells via HIF-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2554-2559 (2014).
  5. Hemminki, A. The molecular basis and clinical aspects of Peutz-Jeghers syndrome. Cellular and Molecular Life Sciences. 55, 735-750 (1999).
  6. Hemminki, A., et al. A serine/threonine kinase gene defective in Peutz-Jeghers syndrome. Nature. 391 (6663), 184-187 (1998).
  7. Sanchez-Cespedes, M. A role for LKB1 gene in human cancer beyond the Peutz-Jeghers syndrome. Oncogene. 26 (57), 7825-7832 (2007).
  8. Sanchez-Cespedes, M., et al. Inactivation of LKB1/STK11 is a common event in adenocarcinomas of the lung. Cancer Research. 62 (13), 3659-3662 (2002).
  9. Ding, L., et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature. 455 (7216), 1069-1075 (2008).
  10. Ylikorkala, A., et al. Vascular abnormalities and deregulation of VEGF in Lkb1-deficient mice. Science. 293 (5533), 1323-1326 (2001).
  11. Bardeesy, N., et al. Loss of the Lkb1 tumour suppressor provokes intestinal polyposis but resistance to transformation. Nature. 419 (6903), 162-167 (2002).
  12. Miyoshi, H., et al. Gastrointestinal hamartomatous polyposis in Lkb1 heterozygous knockout mice. Cancer Research. 62 (8), 2261-2266 (2002).
  13. Jishage, K., et al. Role of Lkb1, the causative gene of Peutz-Jegher's syndrome, in embryogenesis and polyposis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8903-8908 (2002).
  14. Shackelford, D. B. Unravelling the connection between metabolism and tumorigenesis through studies of the liver kinase B1 tumour suppressor. Journal of Carcinogenesis. 12, 16 (2013).
  15. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  16. Ji, H., et al. LKB1 modulates lung cancer differentiation and metastasis. Nature. 448 (7155), 807-810 (2007).
  17. Momcilovic, M., et al. Heightening energetic stress selectively targets LKB1-deficient non-small cell lung cancers. Cancer Research. 75 (22), 4910-4922 (2015).
  18. Wislez, M., et al. Inhibition of mammalian target of rapamycin reverses alveolar epithelial neoplasia induced by oncogenic K-ras. Cancer Research. 65 (8), 3226-3235 (2005).
  19. Liang, M. C., et al. TSC1 loss synergizes with KRAS activation in lung cancer development in the mouse and confers rapamycin sensitivity. Oncogene. 29 (11), 1588-1597 (2010).
  20. Hudes, G., et al. Temsirolimus, interferon alfa, or both for advanced renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 356 (22), 2271-2281 (2007).
  21. Wander, S. A., Hennessy, B. T., Slingerland, J. M. Next-generation mTOR inhibitors in clinical oncology: how pathway complexity informs therapeutic strategy. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1231-1241 (2011).
  22. Pourdehnad, M., et al. Myc and mTOR converge on a common node in protein synthesis control that confers synthetic lethality in Myc-driven cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11988-11993 (2013).
  23. Hsieh, A. C., et al. The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis. Nature. 485 (7396), 55-61 (2012).
  24. Momcilovic, M., et al. Heightening energetic stress selectively targets LKB1-deficient non-small cell lung cancers. Cancer Research. 75 (22), 4910-4922 (2015).
  25. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
  26. Shackelford, D. B., et al. LKB1 inactivation dictates therapeutic response of non-small cell lung cancer to the metabolism drug phenformin. Cancer Cell. 23 (2), 143-158 (2013).
  27. Momcilovic, M., et al. Targeted Inhibition of EGFR and Glutaminase Induces Metabolic Crisis in EGFR Mutant Lung Cancer. Cell Reports. 18 (3), 601-610 (2017).
  28. Preclinical PET Imaging Systems | GA PET/X-ray & G8 PET/CT. Perkin Elmer. , Available from: http://www.perkinelmer.com/preclinical-pet-imaging/index.html (2018).
  29. Goodwin, J., et al. The distinct metabolic phenotype of lung squamous cell carcinoma defines selective vulnerability to glycolytic inhibition. Nature Communications. 8, 15503 (2017).
  30. Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
  31. Dandekar, M., Tseng, J. R., Gambhir, S. S. Reproducibility of 18F-FDG microPET studies in mouse tumor xenografts. Journal of Nuclear Medicine. 48 (4), 602-607 (2007).
  32. Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging: current applications and future directions. Journal of Nuclear Medicine. 49 (1), 1-4 (2008).
  33. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324 (5930), 1029-1033 (2009).
  34. Vander Heiden, M. G., DeBerardinis, R. J. Understanding the intersections between metabolism and cancer biology. Cell. 168 (4), 657-669 (2017).
  35. Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
  36. Possemato, R., et al. Functional genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer. Nature. 476, 346-350 (2011).
  37. Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (7360), 552-563 (2015).
  38. Hassanein, M., et al. Preclinical evaluation of 4-[(18)F]fluoroglutamine PET to assess ASCT2 expression in lung cancer. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 18-23 (2016).
  39. Qu, W., et al. Preparation and characterization of L-[5-11C]-glutamine for metabolic imaging of tumors. Journal of Nuclear Medicine. 53 (1), 98-105 (2012).
  40. Venneti, S., et al. Glutamine-based PET imaging facilitates enhanced metabolic evaluation of gliomas in vivo. Science Translational Medicine. 7 (274), 217 (2015).
  41. Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
  42. Keng, P. Y., et al. Micro-chemical synthesis of molecular probes on an electronic microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (3), 690-695 (2012).
  43. Lazari, M., et al. ELIXYS - a fully automated, three-reactor high-pressure radiosynthesizer for development and routine production of diverse PET tracers. EJNMMI Research. 3 (1), 52 (2013).

Tags

Kræftforskning sag 137 18F-FDG PET billedbehandling lungekræft glykolyse LKB1 KRAS mTOR
Udnytte <sup>18</sup>F-FDG PET/CT billeddannelse og kvantitative histologi at måle dynamiske ændringer i glukose stofskifte i musemodeller af lungekræft
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Momcilovic, M., Bailey, S. T., Lee,… More

Momcilovic, M., Bailey, S. T., Lee, J. T., Zamilpa, C., Jones, A., Abdelhady, G., Mansfield, J., Francis, K. P., Shackelford, D. B. Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer. J. Vis. Exp. (137), e57167, doi:10.3791/57167 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter