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Cancer Research

Utilizando 18F-FDG PET/CT la proyección de imagen e histología cuantitativa para medir cambios dinámicos en el metabolismo de la glucosa en modelos de ratón de cáncer de pulmón

Published: July 21, 2018 doi: 10.3791/57167
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 1, 4, 5, 1
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California Los Angeles David Geffen School of Medicine, 2University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California Los Angeles, 4Andor Technology, 5Division of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles David Geffen School of Medicine

Summary

En este protocolo, se describe cómo utilizar [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose tomografía por emisión de positrones y tomografía computada (18F-FDG PET/CT) la proyección de imagen para medir la respuesta metabólica del tumor a la terapia dirigida MLN0128 en un KRAS/Lkb1 ratón mutante modelo de cáncer de pulmón y se juntaron con autorradiografía ex vivo de alta resolución y la histología cuantitativa la proyección de imagen.

Abstract

Una característica de tumores avanzados es un interruptor para la glucólisis aeróbica que se miden fácilmente por [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose tomografía por emisión de positrones (18F-FDG PET) proyección de imagen. Co las mutaciones en el KRAS proto-oncogene y el gene de supresor del tumor LKB1 son eventos frecuentes en cáncer de pulmón que hipermetabólico, crecimiento del tumor glucolisis. Un camino crítico regulando el crecimiento y el metabolismo de estos tumores es el blanco mecanicista de la vía de la rapamicina (mTOR), que puede ser eficazmente con inhibidores de la cinasa mTOR catalítica selectiva. El inhibidor de mTOR MLN0128 suprime la glicolisis en tumores con Kras y Lkb1 Co las mutaciones, contempladas como KL ratones ratones. La respuesta a la terapia en ratones KL se mide primero por 18F-FDG PET y la tomografía computada (CT imágenes antes y después de la entrega de MLN0128). Mediante la utilización de 18F-FDG PET/CT, los investigadores son capaces de medir cambios dinámicos en el metabolismo de la glucosa en modelos de ratón modificados genéticamente (GEMMs) de cáncer de pulmón después de una intervención terapéutica con terapias dirigidas. Esto es seguido por autorradiografía ex vivo y un análisis de inmunohistoquímica cuantitativa (qIHC) utilizando el software morfométricos. El uso de qIHC permite la detección y cuantificación de los distintos cambios en los perfiles de biomarcadores después de tratamiento, así como la caracterización de patologías tumorales distintas. El acoplamiento de las imágenes de PET a la histología cuantitativa es una estrategia efectiva para identificar respuesta metabólica y terapéutica en vivo en modelos murinos de la enfermedad.

Introduction

Nuestra investigación se ha centrado en investigar y dirigidos a los cánceres con mutaciones en la quinasa de hígado B1 (LKB1, también conocido como STK11) cáncer mutante1. LKB1 es un supresor de tumor principal que reprime mTOR complejo 1 (mTORC1) mediante la activación de la cinasa de AMP (AMPK) conduce a la regulación del crecimiento y el metabolismo. Por lo tanto, la pérdida de LKB1 conduce a una activación de mTORC1 desenfrenado, la activación de la resultante de HIF1-alfa en un fenotipo metabólico glicolítico comúnmente como el efecto de Warburg2,3,4. Mutaciones que hacen inactivo LKB1 conducen directamente al desarrollo de un síndrome de predisposición de cáncer familiar raro conocido como síndrome de Peutz-Jeghers (PJS) que se caracteriza por el desarrollo de pólipos gastrointestinales benignos conocidos como amartomas5 , 6 , 7. por otra parte, LKB1 frecuentemente Co muta con KRAS oncogénico en hipermetabólico y tumores de pulmón humano agresivo8,9.

Enfermedades relacionadas con el Lkb1 se modelan fácilmente en ratones. La inactivación heterozigótica de Lkb1 en ratones conduce al desarrollo de las amartomas exactamente modelado PJS10,11,12,13. Además, las mutaciones Lkb1 que fácilmente se modelan en ratones con precisión recapitulan fenotipos de cáncer de pulmón, piel, páncreas y mama14. La co mutación de Kras/Lkb1 en el tejido pulmonar de los ratones transgénicos, mediante una activación de mediada recombinase de Cre de oncogénico KrasG12D alelo y biallelic eliminación de Lkb1, resulta en la formación de tumores de pulmón agresivo y metastásico15 ,16. La caracterización de KrasG12D; Lkb1- / - (KL) tumores de pulmón aislados de ratones muestra estos tumores tienen una activación de mTORC1 alta y son altamente glucolisis, usando mediciones de metabolitos directa de glucosa y lactato o medir el consumo de [18F] -2- fluoro-2-desoxi-D-glucosa (18F-FDG) por emisión de positrones (PET) con la tomografía computada (CT) 17. La mTORC1 hiper activación en tumores mutantes LKB1 proporciona un fundamento claro para probar ambos inhibidores de la cinasa catalíticos y alostéricos de mTOR para tratar estos cánceres.

En un estudio previo, hemos demostrado que el inhibidor alostérico de la mTORC1 la rapamicina (RAPA) con éxito inhibió el crecimiento de y glicolisis en tumores gastrointestinales (GI) usando un Lkb1+- Ratón transgénico modelo de pijamas3. RAPA es actualmente había aprobado como una terapia de agente único para el tratamiento de carcinoma de células renales pero demostró eficacia limitada en NSCLC18,19,20. RAPA es un inhibidor alostérico de la mTORC1 y puede mejorarse por el desarrollo de inhibidores de la cinasa catalítica de mTOR de última generación que ofrecen una mayor inhibición casi completa de los complejos de mTOR 1 y 2 (mTORC1 y mTORC2, respectivamente)21. Medicamentos como MLN0128 ahora están siendo evaluados en estudios preclínicos y ensayos clínicos de fase temprana22,23. Un estudio reciente de nuestro laboratorio demostró que el MLN0128 es un inhibidor de mTOR potente en líneas celulares tumorales de pulmón humano y en vivo en KL GEMMs de pulmón cáncer15,16. MLN0128 suprimió el pulmón tumor crecimiento y glucosa metabolismo en estos ratones24.

En este estudio, tomamos ventaja de los modelos bien caracterizado ratón adenoviral Cre-inducida del cáncer de pulmón por un condicional activado oncogene Lox-parada-Lox-KRASG12D 15,25. Estos ratones de KrasG12D fueron cruzados con ratones que floxed alelos de Lkb1 (Lkb1L/L) para generar KrasG12D; Lkb1L/L (KL) ratones16. Después de la entrega intranasal de adeno - o lentivirus expresando recombinase de Cre, los ratones KL desarrollan lesiones tempranas por la inducción del tumor después de 4 semanas. Por 6 semanas, los tumores en el cambio de ratones KL de tumores adenomatosos a un fenotipo más maligno y agresivo tumor típico de los carcinomas de pulmón y por 8-10 semanas, los ratones desarrollan carcinomas francos con un 100% penetrancia16,26.

Tanto PET/CT inmunohistoquímica cuantitativa e imágenes puede ser utilizado para determinar las respuestas moleculares y metabólicas, así como la respuesta terapéutica en los tumores después de la entrega de objetivo terapias como MLN012817, 26,27. Se describe aquí es un protocolo experimental que utiliza 18F-FDG PET imaging para medir la respuesta metabólica a una terapia orientada a MLN0128. Imágenes de PET con histología cuantitativa de acoplamiento permite la medición de la respuesta molecular a la inhibición de mTOR, así como la cuantificación de la carga del tumor y la histología del tumor.

Protocol

Todos los procedimientos descritos en el protocolo han sido aprobados por el cuidado institucional de los animales y utilizan Comité (IACUC) de la Universidad de California, Los Ángeles.

1. 18F-FDG PET y CT Imaging en ratones

PRECAUCIÓN: Use equipo de protección al manipular la radioactividad. Siga todos los procedimientos reglamentarios aplicables al manejo de radiactividad.

  1. Coloque la jaula con los ratones al ser reflejada en una cama caliente a 37 ° C 1 h antes de los 18inyección F-FDG para reducir el consumo de grasa marrón de 18F-FDG.
    Nota: Los ratones para 4-16 h el ayuno puede ayudar a reducir el consumo miocárdico de 18F-FDG.
  2. Peso del ratón y registrar su peso.
  3. Anestesiar el ratón utilizando 2-3% de isoflurano en oxígeno en 0.5 - 2 L/min durante 2-3 min utilizando una cámara de anestesia mantenida a 37 ° C. Asegúrese de que ratón ha sido anestesiada pellizcando el dedo del pie; ninguna reacción será observar si el ratón ha sido anestesiado. Aplicar pomada oftálmica en los ojos para evitar cualquier sequedad durante la anestesia.
  4. Diluir 18F-FDG (109 min radiactivo) en solución salina estéril a una concentración ajustada inyección corregido por decaimiento de 70-75 μCi/100 μl.
    Nota: Siga el tomógrafo PET recomendada 18F dosis por el fabricante para la proyección de imagen de escáner óptima.
  5. Dibujar μCi de 70-75 con una jeringa de insulina con aguja 28 G, medir la dosis de radiactividad usando un calibrador de dosis y registrar la medición y el tiempo. Coloque la jeringa en un portaminas de jeringa.
    Nota: La cantidad de radiactividad de 18F-FDG en cada dosis se mide con un calibrador de dosis, que está calibrado contra un material de referencia estándar, como el Cesio-137, según protocolos del fabricante. También se registra el tiempo de la lectura para determinar la corrección de la caries.
  6. Pinchar el extremo distal de la cola de ratón y medir la glucosa en la sangre del ratón con un glucómetro.
  7. Caliente la cola durante 1-2 minutos con una gasa empapada en agua tibia. Limpie la cola con isopropanol al 70% para dilatar la vena de la cola justo antes de la inyección. Administrar 100 μl de 18F-FDG (todo el volumen en la jeringa) con un bolo inyección via la cola lateral de la vena y registrar el tiempo de inyección. La dosis restante en la jeringa utilizando el calibrador de dosis de Mida y registre la medida y tiempo.
    Nota: Habrá algunos cantidad de sonda en la jeringa. El uso de jeringas de insulina se prefiere sobre jeringas conectadas a agujas vía Luer bloqueos debido a la disminución de la dosis de atrapado en la jeringa/aguja después de la inyección ha sido administrada.
  8. Colocar el ratón inyectado en la cámara de anestesia bajo isoflurane 1.5-2% a 37 ° C para permitir que la sonda a ser distribuidos a través de circulación sistémica del ratón durante 1 h antes de la exploración del animal doméstico.
    Nota: Podría ser beneficioso anular la vejiga antes de la exploración para permitir un más fácil 18visualización F-FDG PET de los tumores implantados en los flancos inferiores del ratón.
  9. Después de 1 h, coloque el ratón en una cámara de proyección de imagen bajo anestesia isoflurano de cono de la nariz y a 37 ° C y asegurar a sus miembros en su lugar con cinta médica en una posición supina.
  10. Coloque la cámara de proyección de imagen en el escáner PET/CT.
  11. Adquirir las exploraciones PET y CT como se describe en el manual del escáner PET/TC28.
    Nota: Las imágenes de PET se adquirieron para 600 s con una ventana de energía de 650 150 keV, reconstruido usando la maximización de la expectativa de la probabilidad máxima con correcciones para atenuación de fotones, normalización de detector y decaimiento del radioisótopo (era una corrección de la dispersión no aplica). Las imágenes del CT son adquiridas en modo continuo para 50 s usar un 50 kVp, fuente de rayos x de 200 μA y un detector de panel plano y se reconstruyen mediante el algoritmo de Feldkamp.
  12. Después de completar el PET/CT, quitar el ratón de la cámara de proyección de imagen y le permiten recuperar en su jaula. Controlar el ratón hasta que se ha recuperado completamente la conciencia y puede mantener recumbency esternal.
  13. Importar las imágenes PET-TAC reconstruidas en software amida haciendo clic en archivo, luego abriry seleccionar el archivo correspondiente.
  14. Convertir los datos de la mascota a la unidad de la dosis inyectada por ciento por gramo (%ID/g) especificando la dosis en el momento de la inyección después de contabilidad para cualquier dosis residual en la jeringa, o a la unidad de valor estandarizado de captación (SUV) introduciendo además del sujeto peso. Para ello, haga clic derecho sobre el conjunto de datos de PET y ubicar el campo de %ID/g en la ficha de Información básica la %ID/g grabado antes de entrar.
  15. Dibujar las regiones de interés (ROIs) en los tumores y tejidos normales (hígado, músculo, pulmón, corazón, cerebro y grasa subcutánea). Para ello, haga clic en Editar, seleccione Añadir ROI, seleccione forma de retorno de la inversión y el retorno de la inversión un nombre. Dibujar ROIs sobre tumores y tejidos y ajustar sus dimensiones para cubrir el tejido de interés en los 3 ejes.
    Nota: Para tener en cuenta las diferencias en la biodistribución de sonda PET entre animales, valores de retorno de la inversión del tumor pueden más normalizar valores de retorno de la inversión del hígado, un órgano bien perfundido con mínima actividad glicolítica que representan 18F-FDG en la circulación. Análisis ROI de tumor y los tejidos normales se realizan en el mismo ratón. Las lesiones tumorales del pulmón son generalmente identificadas por 18F-FDG PET puesto que la retención de 18F-FDG en un pulmón normal es relativamente baja. TAC también se utiliza para identificar lesiones, especialmente lesiones que son 18F-FDG no ávido. Análisis ex vivo de pulmones aislados también ayuda a localizar lesiones del tumor.

2. 18F-FDG autorradiografía

  1. Preparar el mouse para la proyección de imagen con 18F-FDG siguiendo los pasos 1.1-1.12, excepto ahora, diluir 18F-FDG en solución salina estéril a una concentración ajustada inyección corregido por decaimiento de 1.000 μCi/200 μl.
    Nota: Dosis mayores de 18F-FDG son utilizados para autorradiografía para tener en cuenta adicional muestra una óptima detección y tiempo de procesamiento por las placas de fósforo.
  2. Eutanasia el ratón a través de una inhalación letal de isoflurano en 5% o CO2 (un procedimiento aprobado por el IACUC).
    Nota: La dislocación Cervical debe no utilizarse ya que esto puede dañar el tejido pulmonar.
  3. Precisar el ratón con la superficie ventral expuesta y rociar con etanol al 70% para mat abajo de su pelo antes de la incisión.
  4. Abra la cavidad torácica aplicar una incisión de línea media, cortando el diafragma y las paredes del pecho. Exponer la tráquea retirando cuidadosamente la glándula salival. Coloque la pinza de bulldog en la tráquea como cerca de la mandíbula como sea posible, asegurando un ajuste apretado en la tráquea. Una aguja de 23 G conectada a una jeringa de 3 mL dentro de la tráquea por debajo de la pinza de bulldog e inyectar 2 mL de una solución (óptimo corte temperatura: fosfato tampón salino) OCT:PBS (1:1).
    Nota: OCT es muy viscoso y se mezcla con PBS para permitir una inyección más fácil en los pulmones.
  5. Retire la aguja de la tráquea y utilizar pinzas para apretar en el punto de inyección para evitar cualquier filtración de la solución de OCT:PBS.
  6. Con cuidado retire los pulmones de la cavidad torácica y separar el lóbulo izquierdo del resto de los pulmones. Coloque el lóbulo izquierdo en cryomold marcada con unas gotas de OCT. Una vez que el lóbulo del pulmón se encuentra dentro del molde, llene la cryomold a la parte superior con OCT.
  7. Repita el mismo procedimiento con la mitad derecha de los pulmones.
    Nota: Si la señal de 18F-FDG en pleno se espera que sea alta o si los tumores de pulmón están situados cerca del corazón, podría ser beneficioso quitar el corazón para prevenir cualquier pérdida trazalíneas. Por otra parte, todos pulmones pueden ser embebidos en una sola cryomold. Es importante evitar las burbujas de aire cuando se trabaja con OCT.
  8. Con unas pinzas largas, colocar el cryomold preparado en un envase de espuma de poliestireno extruido de célula cerrada que contiene una mezcla de hielo seco y el isopentano.
    Nota: Esta mezcla debe ser en aproximado de-70 ° C antes de colocar el cryomold en para la congelación. Después de endurecer, el compuesto de OCT se convertirá en blanco. Si varias muestras son procesadas al mismo tiempo, las muestras congeladas en OCT cryomolds pueden almacenarse temporalmente en hielo seco.
  9. Quitar el bloque congelado de la cryomold y móntelo en un criostato para seccionamiento. Sección del bloque a 4 μm de espesor con cuchillas para Microtomo (34°/80 mm, perfil alto). Transferencia de las secciones de tejido en un portaobjetos de vidrio que ha sido almacenado a temperatura ambiente.
  10. Colocar los portaobjetos de la muestra en un placa de la proyección de imagen de fósforo. Colocar la placa en el cassette y cerrar suavemente para evitar que se mueva diapositivas. Guarde el cartucho en un congelador de-20 ° C para la exposición de la placa, generalmente durante la noche.
    Nota: Las placas y cintas necesitan deben enfriarse previamente a-20 ° C antes de usar. Colocar las muestras a-80 ° C es aceptable.
  11. Después de la exposición, retirar el portaobjetos de la placa y leer la placa en el lector de imagen.
  12. Las diapositivas pueden ser envuelta en plástico y almacenadas a-80 ° C, o pueden prepararse por hematoxilina y eosina o inmunohistoquímica.

3. recolección de tejido pulmonar para histología

  1. Siga los pasos 2.2-2.4, excepto ahora, en lugar de utilizar la solución OCT:PBS, inyectar 2-3 mL de 10% formalina tamponada normal para fijar los pulmones.
  2. Retire la aguja de la tráquea y utilizar pinzas para apretar en el punto de inyección para evitar cualquier filtración de la formalina. Con cuidado retire los pulmones de la cavidad torácica y coloque en un tubo cónico de 50 mL que contenga 20 mL de formalina tamponada normal del 10% por 16-24 h para garantizar una fijación completa.
    Nota: Los pulmones de fijación permite la preservación de las características anatómicas óptimas.
  3. Al día siguiente, transferir los pulmones fijados de la formalina a etanol al 70% y preparar los pulmones para ser colocados en una cinta de tejido.
  4. Preparar los pulmones para histología por disección cuidadosamente con unas tijeras para cortar en puntos de ramificación entre 5 lóbulos, numerados 1-5 como se muestra en la figura 1D, lóbulos y colocarlos en una orientación no superpuestos en la cinta de tejido. Coloque una almohadilla de espuma suavemente sobre el tejido del pulmón para mantener la orientación intacta.
  5. Guarde los lóbulos del pulmón disecado en etanol al 70% hasta la inclusión en parafina.
  6. Parafina-incrustar el tejido en cintas y cortar secciones de 4 μm espesor para tinción, empleando los procedimientos estándar.

4. tejido segmentación y cuantificación utilizando Software comercial

  1. Imagen de hematoxilina y eosina (H & E) habían teñido secciones del pulmón con un 1.25 aumentos con un sistema comercial de imágenes multiespectral.
  2. Convertir las imágenes a los cubos de la imagen digital y cargar las bibliotecas espectrales prefabricadas (haga clic en archivoy luego en Cargar biblioteca espectral) H & E.
    Nota: Las bibliotecas espectrales fueron desarrolladas con antelación mediante la adquisición de imágenes espectrales de secciones del pulmón solo manchado, un corte teñido con eosina y la única teñidas con hematoxilina, que eran almacenados en una biblioteca espectral propietaria de código abierto archivo (.csl). El sistema de proyección de imagen tiene software que adquiere una imagen en cada longitud de onda que se necesita (según lo definido por el protocolo de adquisición) de funcionamiento. Las imágenes ("el cubo de la imagen") se almacenan en un formato de archivo multiespectrales patentada de código abierto (.im3). Espectros son extraídos del cubo de la imagen utilizando el software morfométricas y almacenados en archivos de la biblioteca espectral separada.
  3. Separar espectralmente el pseudo-color H & E imágenes de los pulmones enteros haciendo clic en el botón de Unmix .
    Nota: Idear toma menos de 1 s. El número de píxeles en cada tipo de tejido se cuantificaron utilizando el software de análisis de imagen morfométrica.
  4. Visualizar cada cubo de imagen mediante la conversión de los datos multiespectrales en el equivalente de 3 colores (roja, verde, azul) imagen usando la respuesta de color dependiente de la longitud de onda del ojo convolved con la intensidad de cada imagen.
    Nota: Las 3 imágenes se muestran como una imagen de color de 24 bits estándar.
  5. Pseudo-color cada imagen sin mezclar al escalar la imagen en un usuario elegido color (p. ej., rojo, verde, púrpura, etc.) y añadir que junto con las imágenes sin mezclar Otros pseudo-colores en la imagen un color estándar de 24 bits.
  6. Utilice la configuración predeterminada para todos los análisis.
    Nota: en general, ya que este tipo de segmentación se basa en una evaluación visual de los resultados (es decir, una evaluación de cuán bien la segmentación de las imágenes fuera de la formación establece obras), es importante dividir las imágenes correctamente en formación, prueba y validación de sistemas.
  7. Comience con 2-3 imágenes como un conjunto de entrenamiento (10-15 para las muestras de biopsia humana), tren en eso hasta que los resultados se ven bien y luego aplicarán ese algoritmo a otro 2-3 imágenes. Luego, aplicar el algoritmo resultante para el sistema de validación completo.
    Nota: Probablemente, algunos readaptación será necesario.
  8. Analizar el área del tumor en las secciones del pulmón entero mediante el cálculo de la cantidad total de píxeles para los tumores pseudo colores rojo en 1-5 lóbulos de cada ratón.
    Nota: El tejido normal se pseudo-color verde y sangre, sangre de los vasos se pseudo-colores rosa como se muestra en la figura 3. La carga tumoral promedio para cada grupo de tratamiento se calculó midiendo la cantidad total de píxeles para cada ratón, mouse en el grupo de tratamiento.

Representative Results

18 Imágenes de F-FDG PET se realizó en ratones KL y demostró que los tumores en estos ratones eran altamente glicolíticas como se muestra por un consumo elevado de 18F-FDG (figura 1A), de acuerdo con los estudios previamente publicados26, 29. Una resección de todo pulmones reveló la presencia de varios tumores (figura 1B). Los pulmones de ratón pueden ser divididos en 5 lóbulos separados en figuras 1C y 1D. Lóbulos 1-5 fueron etiquetados en pulmones seccionados que fueron teñidos con H & E o glucosa transportador 1 (Glut1) (figura 1D). GLUT1 es un principal transportador de glucosa y 18F-FDG y su expresión y localización a la membrana plasmática de las células tumorales se correlacionan directamente con 18F-FDG SUV29. Un mayor análisis de resolución de Glut1 (40 X) la coloración en 18F-FDG ávidos tumores pulmonares muestra una expresión elevada y localización del transportador en la membrana plasmática (figura 1D).

Debido a la limitada resolución de las imágenes de PET, PET/CT y tejido autorradiografía fueron realizados. La resolución más alta de autorradiografía puede identificar pequeños tumores o heterogeneidad del tumor 18distribución F-FDG. Después de la inducción del tumor, proyección de imagen de 18F-FDG PET-TAC fue realizada en ratones KL (figura 2A) seguidos por autorradiografía en pulmones aislados de estos ratones (figuras 2B y 2C). Como se ve en las figuras 2B y 2C, la autorradiografía identificado dos tumores más pequeños adicionales que eran positivos para los 18F-FDG, sin embargo no eran fácilmente visibles por PET. Después de autorradiografía, los portaobjetos con el tejido podrían utilizarse también para la tinción inmunohistoquímica (IHC) de biomarker(s). H & E tinción de los tumores confirman la presencia de tumores en el lóbulo izquierdo (figura 2D).

A continuación, proyección de imagen de 18F-FDG PET se realizó en tratados con MLN0128 KrasG12D; Lkb1- / - ratones para utilizar 18F-FDG como un biomarcador funcional del metabolismo de la glucosa en los tumores de pulmón (figura 3). Identificamos que un tratamiento con MLN0128 robusta inhibe la señalización de mTORC1 y glicolisis como se muestra por un consumo reducido de 18F-FDG (figuras 3A y 3B). Estos resultados coinciden con estudios preclínicos evaluar MLN0128 en KL ratones como previamente publicado por nuestro laboratorio17,27. Por último, se efectuó tinción de IHC en los tumores (figura 3C). Los tumores fueron manchados para H & E o con anticuerpos contra fosfo-S6, que es un sustrato conservado de mTORC1 y se utiliza para indicar una activación de mTORC1 (P-S6) vs inactivación (S6). Figura 3 C muestra una fuerte inhibición de P-S6 por MLN0128 en KL tumores en comparación con aquellos tratados con un vehículo, que está de acuerdo con el trabajo previamente publicado17. Además de KRAS, controladores oncogénicos como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) apoyan el metabolismo glicolítico en tumores de pulmón, así. Por lo tanto, probamos si la inhibición de la mutante constitutivamente activa EGFR con erlotinib suprime el metabolismo de 18F-FDG en xenoinjertos de ratón. Figuras 3D y 3E muestran que la línea de tumor de pulmón humano HCC827, que alberga una mutación de EGFR del19, mostraron un consumo significativamente reducido 18F-FDG tras cinco días de tratamiento de erlotinib.

Por último, análisis morfométrico del tejido fue realizado en pulmones seccionados y tumores de pulmón para cuantificar la carga total del tumor, así como para diferenciar patologías tumorales que subtipo de tejido, necrosis, vasos sanguíneos del tejido pulmonar normal y espacio aéreo. El KL GEMMs desarrollaron una enfermedad compleja y heterogénea patológico que se presentó con tumores pulmonares de diferentes histopathologies. Se trata de adenocarcinomas (ADC) y carcinomas de células escamosas (SCC)-esta heterogeneidad hace que el tratamiento de este cáncer un desafío formidable. Figura 4 A muestra un solo lóbulo de pulmón manchado H & E con dos tumores grandes presentes. Las imágenes de aumento más alto se muestra en la figura 4B identifican un normal pulmón, vasos y espacio aéreo y tumor necrosis así como adenocarcinoma, caracterizado por una bien definida estructura papilar y un carcinoma de célula squamous. Figura 4 C representa el pseudo-colorante del lóbulo de pulmón y tumor usando software morfométrico de Inform. Figura 4 D muestra los porcentajes de pulmón normal, los vasos y patologías individuales tales como necrosis del tumor y subtipos de tumor que había segmentado adenocarcinoma bien-distinguida del carcinoma de célula squamous.

Figure 1
Figura 1 : Metabólicamente activo KrasG12D; Lkb1- / - tumores de pulmón mutante (KL) son 18F-FDG positivo y expresa altos niveles del transportador de glucosa 1 (Glut1). Paneles A y B muestran una proyección de intensidad máxima [también conocida como imagen de 3 dimensiones (3D)] de los 18F-FDG-PET y CT análisis en algunos ratones de FDG ávidos KL que tumores de pulmón squamous. Se muestran (A) una reconstrucción 3D y vistas transversales, sagitales y coronales (B) tumores de pulmón como (T). (C) este panel muestra una histología del pulmón entero del ratón KL reflejada en los paneles A y B, ya sea teñido de H & E (panel superior) o con un anticuerpo específico de Glut1 (panel inferior). Los lóbulos pulmonares están contados. La barra de escala = 2 mm. (D) este diagrama representa la orientación y el número de lóbulos en los ratones (panel superior) y mayor resolución 40 X imágenes de los tumores de H & E o Glut1 manchado de las diapositivas se muestra en el panel C de H & E (panel central) o teñidas con un anticuerpo específico para Glut1 (panel inferior). La barra de escala = 25 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: 18 Autorradiografía F-FDG puede identificar pequeños tumores que son metabólicamente activos. (A) esta imagen de 18F-FDG PET/CT muestra 18F-FDG ávidos tumores en un ratón KL se muestra como una imagen de proyección de máxima intensidad. T1 y T2 = tumores, H = corazón, B = la vejiga, K = los riñones. (B) este panel muestra la autorradiografía ex vivo en secciones seriadas de los lóbulos del pulmón derecho e izquierdo del ratón. Los pulmones en los paneles izquierdos y derecho son idénticos. Los pulmones en los paneles de la izquierda son pseudo coloreada naranja. Los pulmones en los paneles de la derecha se colorean en blanco y negro. Los tumores (T1, T2 y T3) se indican con flechas. (C) esta es una vista magnificada de la pseudocolored de autorradiografía naranja (panel superior) y blanco y negro (panel inferior). (D) este panel muestra la tinción H & E del segmento superior del lóbulo izquierdo que se muestra en el panel B. La barra de escala = 200 μm haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 3
Figura 3 : El inhibidor de mTOR MLN0128 suprime el consumo de glucosa en los tumores de pulmón de ratones KL detecta 18F-FDG PET. (A) este panel muestra representativa 18imágenes de F-FDG PET/CT de KL ratones tratados con un vehículo (18F-FDG ávido, izquierda) o MLN0128 (18F-FDG no avid, derecha). La transversal (panel superior), coronal (panel central) y sagital (panel inferior) se muestran puntos de vista. Los tumores están contorneados con líneas rojas; H = el corazón, L = el hígado. (B) este panel muestra una cuantificación de SUVmax (%ID/g) entre los tumores tratados con vehículo y MLN0128. (C) este panel muestra la tinción H & E y P-S6 de secciones del pulmón entero de KL ratones tratados con vehículo o MLN0128. La barra de escala = 25 μm. (D) este panel muestra representativa 18F-FDG-PET y CT imágenes de xenoinjertos de EGFR HCC827 (del19) pre- y post-erlotinib tratamiento. El tumor (T) se indica con una flecha, K = riñón, B = el cerebro. (E) este panel muestra una cuantificación del SUVmax (%ID/g) de xenoinjertos de HCC827 antes y después del tratamiento de erlotinib. n = 10 tumores o grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Carga del tumor y la histología del tumor se cuantifican utilizando software morfométrico.
(A) este panel muestra la tinción H & E de un lóbulo de pulmón de ratón con un tumor recopilada de un ratón KL. (B) estas imágenes de resolución más altas muestran el carcinoma de célula squamous (parte superior izquierda), el pulmón normal, los vasos y el espacio de aire (arriba a la derecha) y el adenocarcinoma papilar bien-distinguida (abajo izquierda) y necrosis (abajo a la derecha). (C) este panel muestra el pseudocoloring de la H & E manchado del pulmón lóbulo utilizando software morfométricos. (D) este panel muestra los porcentajes de cada pulmón patologías del lóbulo y del tumor medidos por informar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este artículo describe un enfoque experimental basado en la proyección de imagen que utiliza la proyección de imagen de 18F-FDG PET/CT con qIHC para medir las respuestas metabólicas y moleculares en tumores de pulmón después de la entrega del inhibidor de mTOR MLN0128. MLN0128 había reducido 18consumo F-FDG, indicando una respuesta metabólica significativa en los tumores. Al relacionar la proyección de imagen PET/CT con inmunohistoquímica, pudimos espacial registro tumores seccionados a las imágenes de PET-TAC 3D y realizar un examen detallado de todo tumores a nivel celular y molecular. Ello permitió confirmar que la MLN0128 inhibe la señalización de mTOR, lo que confirma una respuesta molecular en blanco a la droga en los tumores. Por último, aprovechándose de la histología cuantitativa, hemos sido capaces de asignar y patologías tumorales distintas separadas, como general masa tumoral de la necrosis del tumor, definen adenocarcinoma de células escamosas y complementan la proyección de imagen microPET.

MicroPET está actualmente limitada por una resolución espacial de aproximadamente 1 mm. Además, 18retención F-FDG en ciertos tejidos puede verse afectado por varios factores, incluyendo niveles de glucosa en plasma, el tipo y duración de exposición anestésica, la temperatura ambiental y la salud general del animal, que puede afectar 18 F-FDG farmacocinética30. Estos parámetros han sido optimizados para este protocolo pero deben optimizarse para cada modelo animal. Estudios de reproducibilidad de la proyección de imagen de 18F-FDG de tumores subcutáneos en ratones demuestran un coeficiente de variación %ID/g media de aproximadamente el 15%, lo que sugiere que la respuesta terapéutica del tumor de un ratón individual evaluados por 18 F-FDG PET debe ser superior a este umbral para ser considerado confiable y significativa31.

La distribución celular y subcelular incluso de trazadores PET puede evaluarse por autorradiografía de tejidos con las secciones posteriormente teñidos y registrado conjuntamente con qIHC. Co registro PET con la TC permite una imagen de PET en un contexto anatómico; Esto es extremadamente valioso, incluso con contraste de tejidos blandos bajo. La falta de contraste de tejidos blandos por el CT puede ser superada con la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI). Además, biomarcadores para la proyección de imagen de fluorescencia pueden utilizarse para evaluar la glicolisis en vivo, pero la absorción del fotón y dispersión en la cavidad pulmonar puede afectar la exacta cuantificación o detección sensibilidad32. En Resumen, utilizando todo animal imágenes de PET/CT con histología cuantitativa proporciona un mapa exacto y en tiempo real de la biología del tumor después de la intervención terapéutica.

Las imágenes multiespectrales (MSI) son aplicable en cualquier situación donde puede utilizarse una imagen en color. Por lo menos, MSI ofrece la misma información que una imagen en color, y para algunas aplicaciones, MSI puede proporcionar que información más detallada sobre las propiedades espectrales de una muestra de una imagen simple banda ancha tres colores (RGB). En general, las limitaciones de MSI son las de color de imagen, excepto que MSI es más lento y tarda más en adquirir imágenes. El software morfométrico se utilizó para obtener resultados reproducibles y precisos de la segmentación de las imágenes y se describe en la Tabla de materiales. Hay productos disponibles comercialmente que pueden usarse para la segmentación del tejido y la cuantificación de la histología.

La complejidad del metabolismo del cáncer se extiende más allá del efecto de Warburg y glucosa metabolismo33,34. Es muy probable que tumores se adaptarán fácilmente a tratamientos de agente único que inhiben la glucólisis. La dependencia del metabolismo de aminoácidos ha sido documentada en cáncer, y se espera que los tumores dependen de una gran cantidad de producto como glutamina, glicina, serina, así como otros metabolitos como los ácidos grasos libres35,36, 37. Además de 18F-FDG, sondas como 18F y 11C-labeled glutamina, colina, acetato de 1-(2'-deoxi-2'-fluoroarabinofuranosyl) citosina (FAC) y fluorothymidine (FLT) han utilizado con éxito para imagen de aminoácidos, nucleótidos y metabolismo de los lípidos en modelos animales de cáncer38,39,40,41. Automatización y microescala tracer radiochemistry tecnologías juntadas con una mayor resolución, mayor escáneres PET de sensibilidad serán mejorar la accesibilidad de PET para medir diversos procedimientos biológicos42,43. Como la comprensión del metabolismo aumenta, es lógico que el repertorio de radiotrazadores PET aumentará, permitiendo a los investigadores y médicos no invasor del metabolismo tumoral perfil.

La utilización de la histología cuantitativa e imágenes PET/CT aborda una necesidad clínica, que es rápidamente traducir descubrimientos de banco en uso clínico. Para lograr esto, los investigadores deben ser capaces de medir con precisión la respuesta terapéutica, así como la resistencia adquirida a las drogas, que la proyección de imagen PET/CT permite. Por otra parte, el PET/CT y el análisis immunohistochemical de tumores pulmonares se utilizan como estándar del cuidado para los pacientes y por lo tanto, son directamente traducibles a la práctica clínica. Lo importante es la proyección de imagen PET/CT fácilmente identifica tumores resistentes a la terapia, que los investigadores pueden aislar e interrogar a nivel molecular con el fin de comprender mejor los mecanismos de la enfermedad. Este es un proceso iterativo que ha hecho posible para mejor comprender los mecanismos de resistencia y diseñar estrategias terapéuticas más eficaces para la traducción clínica.

Disclosures

Kevin P. Francis es un empleado de Perkin Elmer. James Mansfield es un accionista público de acciones de PerkinElmer, Inc. (PKI) en NASDAQ. Los autores tienen nada más que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a la Universidad de California Los Angeles Crump preclínico la proyección de imagen del centro de tecnología para su ayuda con la proyección de imagen PET/CT de los ratones, el laboratorio de central de patología translacional y base estadística en la Universidad de California Los Angeles Escuela de medicina David Geffen para su ayuda con la preparación de las muestras tumorales y el análisis. Para la financiación, David B. Shackelford fue apoyado por el CTSI y Premio de ciencia traslacional de KL2 otorgar números KL2TR000122 y UL1TR000124 en la escuela de medicina David Geffen en UCLA y por el Departamento de defensa del pulmón cáncer investigación programa traslacional Asociación de investigación W81XWH-13-1-0459 y ACS RSG-16-234-01-TBG. Sean T. Bailey fue apoyado por una beca de formación de NIH T32 HL072752 a través de la escuela de medicina David Geffen en UCLA. Anthony Jones es apoyado por el programa de UCLA Tumor celular biología formación (USHHS Ruth L. Kirschstein institucional investigación servicio Premio Nacional # T32 CA009056). Gihad Abdelhady es apoyado por una diversidad NIH/NCI suplemento R01CA208642.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
G8 PET/CT Perkin Elmer CLS139564 Used for 18F-FDG PET and CT imaging of mice
Axio Imager.M2 Zeiss 490020-0003-000 Acquiring images of FFPE lung tumor sections
Inform software Perkin Elmer CLS135781 Morphometric used for image analysis of tumor pathologies
Glut1 antibody Alpha Diagnostics GT12-A IHC staining of FFPE lung tumor sections
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP™ Rabbit mAb Cell Signaling Technologies 4858 IHC staining of FFPE lung tumor sections
MX35 Premier microtome blades  Thermo Fisher Scientific 3051835 Microtome blades for sectioning tissue for autoradiography

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References

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Investigación de cáncer número 137 18F-FDG PET proyección de imagen cáncer de pulmón glucólisis LKB1 KRAS mTOR
Utilizando <sup>18</sup>F-FDG PET/CT la proyección de imagen e histología cuantitativa para medir cambios dinámicos en el metabolismo de la glucosa en modelos de ratón de cáncer de pulmón
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Momcilovic, M., Bailey, S. T., Lee, J. T., Zamilpa, C., Jones, A., Abdelhady, G., Mansfield, J., Francis, K. P., Shackelford, D. B. Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer. J. Vis. Exp. (137), e57167, doi:10.3791/57167 (2018).

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