Summary
이 프로토콜에서 설명 하는 [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose 양전자 방출 단층 촬영 및 컴퓨터 단층 촬영 (18F FDG PET/CT) 이미징 타겟 치료 MLN0128는 에 종양 변화 응답을 측정 하기 위해 활용 하는 방법 Kra/Lkb1 돌연변이 마우스 폐암의 모델 및 결합 된 높은 해상도 ex vivo autoradiography와 양적 조직학 영상.
Abstract
고급 종양의 특징은 쉽게 [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose 양전자 방출 단층 촬영 (18F FDG 애완 동물) 이미지에 의해 측정 된 호 기성 분해를 스위치입니다. KRA proto-oncogene LKB1 종양 억제기 유전자에 공동 돌연변이 hypermetabolic glycolytic 종양 성장 드라이브 폐암에서 자주 이벤트가 있습니다. 중요 한 통로 성장과 이러한 종양의 대사 조절 타겟팅 할 수 있습니다 효과적으로 선택적 촉매 mTOR kinase 억제제를 사용 하 여 rapamycin (mTOR) 통로의 기계적 대상입니다. MTOR 억제제 MLN0128 Kra와 Lkb1 공동 돌연변이, kl 기 쥐로와 종양 방위 쥐의 분해를 억제 합니다. KL 쥐에서 치료 응답 처음 18F FDG 애완 동물에 의해 측정 되 고 계산 된 단층 촬영 (CT) 이미징 하기 전에 MLN0128의 납품 후에. 18F FDG PET/CT를 활용 하 여, 연구원은 표적으로 한 치료와 치료 개입에 따라 폐암의 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs)에 포도 당 물질 대사에 있는 동적인 변화를 측정 하 수 있습니다. 이 비보 전 autoradiography 및 형태학 소프트웨어를 사용 하 여 양적 immunohistochemical (qIHC) 분석 옵니다. QIHC 사용 하 여 탐지 및 정량화의 치료 뿐만 아니라 뚜렷한 종양 병 리의 특성에 따라 바이오 마커 프로필에 뚜렷한 변화를 수 있습니다. 양적 조직학을 애완 동물 화상 진 찰의 커플링 대사 및 치료 응답에 vivo에서 의 질병 마우스 모델에서 식별 하는 효과적인 전략 이다.
Introduction
우리의 연구 조사 하 고 간 니 B1에에서 돌연변이와 암 (LKB1, STK11로 라고도 함)을 대상으로에 집중 했다 돌연변이 암1. LKB1 성장 및 물질 대사의 규제를 선도 하는 앰프 키 니 아 제 (AMPK)의 활성화를 통해 누르는 mTOR 복잡 한 1 (mTORC1) 마스터 종양 억제기 이다. 따라서, LKB1 손실 억제 mTORC1 활성화, 일반적으로 바르 부르 크 효과2,,34라고 glycolytic 대사 표현 형에 HIF1 알파 결과의 활성화에 지도 한다. LKB1 비활성화 돌연변이 직접적으로 Peutz Jeghers 증후군 (잠 옷) hamartomas5 로 알려진 양성 위장 폴립의 개발에 의해 특징은 알려진 드문 가족성 암 사전 처리 증후군의 발전으로 이어질 , 6 , 7. 또한, LKB1 자주 공동 변이 종양 KRA hypermetabolic 고 적극적인 인간 폐 종양8,9와 함께.
Lkb1 관련 질병 쉽게 쥐에서 모델링 됩니다. 쥐에서 Lkb1의 heterozygous 비활성화 잠 옷10,11,,1213를 정확 하 게 모델링 하는 hamartomas의 개발을 리드. 또한, Lkb1 돌연변이 생쥐에서 정확 하 게 모델링 쉽게 정리 폐, 피부, 췌 장, 유 방14의 암 고기. Cre recombinase 중재의 활성화를 Lkb1, 종양 KraG12D 대립 유전자 및 biallelic 삭제를 사용 하 여 유전자 변형 생쥐의 폐 조직에서 Kra/Lkb1의 공동 돌연변이 결과15 공격적이 고 전이성 폐 종양의 형성 ,16. KraG12D;의 특성 Lkb1-/- (KL) 폐 종양 생쥐에서 절연 보여줍니다 이러한 종양 높은 mTORC1 활성화는 매우 glycolytic, 포도 당 및 젖 산 염의 두 직접 대사 산물 측정을 사용 하 여 또는 [18F]의 소비를 측정-2- 플 루 오로-2-의하여-D-포도 당 (18F FDG) 양전자 방출 단층 촬영 (PET)와 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 17로. MTORC1 하이퍼-활성화 LKB1 돌연변이 종양에서 이러한 암을 치료 하는 mTOR의 allosteric 및 촉매 kinase 억제제 두 테스트에 대 한 명확한 근거를 제공 합니다.
이전 연구에서 우리는 allosteric mTORC1 억제제 rapamycin (RAPA)를 성공적으로 성장과 잠 옷3의 유전자 변형 마우스를 Lkb1+ 모델을 사용 하 여 위장 (GI) 종양에서 분해 저해 시연. RAPA 현재 신장 세포 암 치료에 대 한 단일 에이전트 요법으로 승인 하지만 NSCLC18,,1920에 제한 된 효능을 보였다. RAPA allosteric mTORC1 억제제 이며 mTOR 단지 1과 2의 더 많은 거의 완전 한 억제를 제공 하는 다음 세대 mTOR 촉매 kinase 억제제의 개발에 의해 향상 시킬 수 있습니다 (mTORC1와 mTORC2, 각각)21. MLN0128 같은 약은 지금 전 임상 연구 및 초기 단계 임상 시험22,23평가 되 고. 우리의 실험실에서 최근 연구는 MLN0128 이며 인간의 폐 종양 세포 라인에 강력한 mTOR 억제제에 vivo에서 폐 암15,16의 KL GEMMs에 증명. MLN0128이 쥐24폐 종양 성장 및 포도 당 대사를 억제.
이 연구에서 우리가 활용는 조건부로 활성화 oncogene Lox-정지-Lox-KRAG12D 15,25에서 시작 하는 폐암의 특징이 잘 adenoviral Cre 유도 마우스 모델. 이러한 KraG12D 마우스 마우스 데 floxed 대립 유전자 Lkb1의 교차 했다 (Lkb1L/L) KraG12D; 생성 하 Lkb1L/L (KL) 마우스16. Adeno-또는 lentivirus Cre recombinase 표현 intranasal 배달, 다음 KL 생쥐 초기 병 변 4 주 후 종양 유도 의해 개발. 6 주, 폐 carcinomas의 전형 더 악성, 공격적인 종양 형 용 종양에서 KL 마우스 변경에 종양 하 고 8-10 주 여, 쥐 100% penetrance16,26솔직 carcinomas 개발.
이미징 및 양적 immunohistochemistry 분자 및 대사 반응의 배달 다음 종양에서 치료 응답 확인 활용 될 수 있습니다 두 애완 동물/c T MLN012817, 등 치료 대상 26,27. 여기에 설명 된는 18F FDG 애완 동물을 이용 하는 실험 프로토콜 이미지 MLN0128 타겟 치료에 변화 응답을 측정 하기 위해입니다. 양적 조직학으로 애완 동물 이미징 커플링 mTOR 억제 분자 반응의 측정 뿐만 아니라는 종양 및 종양 조직학의 정량화를 수 있습니다.
Protocol
프로토콜에서 설명 하는 모든 절차 기관 동물 관리 승인 하 고, 로스 앤젤레스가 주 대학에 위원회 (IACUC)를 사용 합니다.
1. 18F FDG 애완 동물 쥐에 이미징 CT
주의: 방사능을 처리할 때 보호 장비를 사용 합니다. 방사능을 처리할 때 모든 적용 가능한 규제 절차를 따릅니다.
- 37 ° C 1 h 18 18F FDG의 갈색 지방 소비를 줄이기 위해 F FDG 주사 이전에 따뜻한 침대에서 이미지를 마우스 케이지를 놓습니다.
참고: 4-16 h에 대 한 마우스를 금식 줄일 수 있습니다 18F FDG의 심근 소비. - 마우스 무게 고 무게를 기록 합니다.
- 0.5-2 L/min 37 ° c.에 계속 마 취 챔버를 사용 하 여 2-3 분에 산소에 2-3 %isoflurane 사용 하 여 마우스 anesthetize 마우스를 발가락; 곤란에 의해 anesthetized 되었습니다 확인 반응이 될 것입니다 마우스 마 취 되어 관찰. 마 취 동안 어떤 건조를 방지 하기 위해 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
- 70-75 µCi/100 µ L의 조정된 치 수정 주입 농도에서 메 마른 염 분에서 18F FDG (방사성 반감기 109 분)를 희석.
주: 최적의 스캐너 이미징에 대 한 애완 동물 스캐너 제조 업체의 권장된 18F 복용량을 따릅니다. - 인슐린 주사기와 70-75 µCi 28 G 바늘으로 그리기, 방사능 복용량 복용량 교정기를 사용 하 여 측정 하 고 측정 및 시간 기록. 리드 주사기 홀더에 주사기를 놓습니다.
참고: 각 복용량에 18F FDG 방사능의 양은 세 슘-137, 같은 표준 참고 자료에 대 한 보정은 복용량 교정기와 제조 업체의 프로토콜에 따라 측정 됩니다. 독서의 시간 또한 부패 정정 결정을 기록 됩니다. - 마우스 꼬리의 선단부를 구역 질 하 고는 glucometer와 마우스의 혈당을 측정 한다.
- 따뜻한 거 즈와 1-2 분에 대 한 꼬리는 따뜻한 물에 배어. 70% 소 프로 파 놀 주입 직전 꼬리 정 맥을 팽창 하는 꼬리를 닦아냅니다. bolus 주사 를 통해 측면 꼬리 정 맥 주입의 시간을 기록으로 100 µ L 18F FDG (주사기 전체 볼륨)를 관리 합니다. 복용량 교정기를 사용 하 여 주사기에 나머지 복용량을 측정 하 고 측정 및 시간을 기록 합니다.
참고: 주사기에 프로브 왼쪽의 일부 금액을 하 고 됩니다. 인슐린 주사기의 사용이 주사기 Luer 잠금에 주사를 투여 후 주사기/바늘에 갇혀 복용량의 감소 금액 통해 바늘에 연결 된 동안 좋습니다. - 주입 된 마우스 보관 취 챔버에 배치 수 있도록 분산 을 통해 수 프로브 애완 동물 검사 전에 1 시간에 대 한 마우스의 조직의 순환 37 ° C에서 1.5-2 %isoflurane.
참고: 그것은 쉽게 18마우스의 낮은 측면에 이식 종양의 F FDG 애완 동물 시각화 수 있도록 검사 전에 방광을 무효로 도움이 될 수 있습니다. - 1 시간 후 코 콘 isoflurane 마 취 고 37 ° C에서 이미징 챔버에 마우스를 놓고 부정사 위치에 의료 테이프와 장소에서 그것의 사지를 확보.
- PET/CT 스캐너에서 이미징 챔버를 놓습니다.
- PET/CT 스캐너 수동28에 설명 된 대로 애완 동물 및 CT 스캔을 획득 합니다.
참고: 애완 동물 이미지 600에 대 한 인수는 광자 감쇠, 검출기 정규화 및 방사성 붕괴 (분산형 수정 했다에 대 한 수정과 함께 최대 가능성 기대 극대화를 사용 하 여 개축 150-650 keV의 에너지 창 s 적용 되지 않습니다). CT 이미지는 50 s 사용 하 여 50 kVp, 200 µ A x-레이 소스 및 평면 패널 검출기, 그리고 그들은 Feldkamp 알고리즘을 사용 하 여 재구성은 연속 모드에서 획득 됩니다. - PET/CT를 완료 한 후 이미징 상공에서 마우스를 제거 하 고 그것의 감 금에서 복구할 수 있습니다. 그것은 완전히의 식을 회복 하 고 sternal recumbency를 유지할 수 있습니다 때까지 마우스를 모니터링 합니다.
- 파일, 다음 열기를 클릭 하 고 적절 한 파일을 선택 하 여 아 미드 소프트웨어로 재구성 된 PET/CT 이미지를 가져옵니다.
- 또한 피사체의 입력 하 여 애완 동물 데이터 그램 (%ID/g) 어떤 잔여 복용량에 대 한 회계는 주사기에 남아 후 주입의 때에는 복용량을 입력 하 여 당 % 주입 량의 단위 또는 통풍 관에 표준화 된 값 (SUV)의 단위 변환 무게입니다. 이 위해 애완 동물 데이터 집합을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 기본 정보 탭 입력은 %ID/g 기록 이전에 %ID/g 필드를 찾습니다.
- 종양과 정상 조직 (간, 근육, 폐, 심장, 뇌, 및 피하 지방 질)에 지역의 관심사 (ROIs)를 그립니다. 이렇게 하려면 편집을 클릭 하 선택 추가 투자 수익 ROI 모양 을 선택 하 고 투자 수익 이름을 합니다. 종양 및 조직 ROIs 그리고 커버 모든 3 축에 대 한 관심의 조직에 그들의 크기를 조정.
참고: 동물 애완 동물 프로브 biodistribution 차이 대 한 계정, 종양 ROI 값 수 수 더 정규화 간, 18F FDG 순환에 대표 하는 최소한의 glycolytic 활동 잘 perfused 오르간의 ROI 값. 종양과 정상 조직에의 투자 수익 분석은 동일한 마우스에서 수행 됩니다. 이후 정상적인 폐에 18F FDG 보존은 상대적으로 낮은 폐 종양 병 변 일반적으로 18F FDG 애완 동물에 의해 식별 됩니다. CT도 병 변, 18F FDG 열렬 한 비 병 변 특히 식별 하는 데 사용 됩니다. 격리 된 폐의 비보 전 분석 또한 종양 병 변 지역화에 도움이 됩니다.
2. 18F FDG Autoradiography
- 18F FDG 다음 단계 1.1-1.12, 지금, 희석 18F FDG를 제외 하 고 1000 µCi/200 µ L의 조정된 치 수정 주입 농도에서 메 마른 염 분에서와 이미징에 대 한 마우스를 준비 합니다.
참고: 18F FDG의 높은 복용량 사용 됩니다 autoradiography 시간과 최적의 검색을 처리 하는 추가 샘플에 대 한 계정에 인광 체 격판덮개에 의해. - 안락사는 마우스를 통해 isoflurane 5% 또는 CO2 (IACUC 승인 절차를)의 치명적인 흡입.
참고:이 폐 조직에 손상을 수 자 궁 탈 하지 사용 한다. - 그리고 복 부 표면 노출 마우스 아래 핀 절 개 전에 머리 아래로 매트에 70% 에탄올 스프레이.
- 중간 절 개를 적용, 횡 경 막 떨어져 절단 및 가슴 벽을 제거 하 여 흉 강을 엽니다. 신중 하 게 침 샘을 제거 하 여 기도 노출 합니다. 보장 기관에 꽉 맞는, 턱 주변으로 기관지에 불독 클램프를 놓습니다. 23 G 바늘 불독 클램프 아래 기관 내부 3 mL 주사기에 부착 된 장소와 OCT:PBS (1:1) (최적의 절단 온도: 인산 염 버퍼) 염의 ~ 2 mL를 주입.
참고: 10 월 아주 점성 이며 폐에 쉽게 주사 수 있도록 PBS와 혼합. - 기관지에서 바늘을 제거 하 고 집게를 사용 하 여 OCT:PBS 솔루션의 어떤 누출을 방지 하기 위해 주입 지점에 클램프.
- 조심 스럽게 흉 강에서 폐를 제거 하 고 왼쪽된 엽 폐의 나머지에서 분리. 장소 표시 cryomold에서 왼쪽된 엽 10 월의 몇 방울으로 가득합니다. 일단 폐 엽 형 내부, 상단에 cryomold 10 월에 채우십시오.
- 폐의 오른쪽 절반와 동일한 절차를 반복 합니다.
참고: 18F FDG 신호에에서 높을 것으로 예상 된다 또는 폐 종양 중심부 가까이 위치 해 있다면 그것 수 있습니다 도움이 될 어떤 추적 누설을 방지 하기 위하여 마음을 제거 하. 또는, 전체 폐 단일 cryomold에 포함 될 수 있습니다. 10 월 작업할 때 공기 방울을 피하기 위해 중요 하다. - 긴 집게를 사용 하 여 준비 cryomold 드라이 아이스와 isopentane의 혼합물을 포함 하는 폐쇄 셀 압출된 폴리스 티 렌 거품 컨테이너에 배치 합니다.
참고:이 혼합물은 동결에 대 한 그것에 cryomold를 배치 하기 전에 약-70 ° C에서 이어야 한다. 경화, 후 OCT 화합물 흰색 될 것입니다. 여러 개의 샘플 동시에 처리 하는 경우 10 월 cryomolds에서 냉동된 샘플 드라이 아이스에 임시로 저장할 수 있습니다. - cryomold에서 냉동된 블록을 제거 하 고 단면에 대 한 cryostat에 탑재. 4 µ m 두께 톰 블레이드 (34 ° / 80 m m, 높은 프로필)를 사용 하 여 블록 섹션. 실내 온도에 저장 된 유리 슬라이드에 조직 단면도 전송 합니다.
- 플레이트 이미징 형광체에 표본 슬라이드를 놓습니다. 카세트에 접시를 놓고 부드럽게 슬라이드 이동 하지 않도록 그것을 닫습니다. 일반적으로 하룻밤 플레이트 노출-20 ° C 냉동 고에 저장 카세트.
참고: 접시와 카세트-20 ° c 사용 하기 전에 미리 냉장 될 필요 합니다. -80 ° C에서 샘플 배치도 허용 됩니다. - 노출, 접시에서 슬라이드를 제거 하 고 이미지 리더에 접시를 읽고.
- 슬라이드를 플라스틱 포장에 싸여 수 고-80 ° C에 저장 하거나 되며 & 오신 얼룩 또는 immunohistochemistry 준비 될 수 있다.
3. 수확 폐 조직 조직학에 대 한
- OCT:PBS 솔루션을 사용 하는 대신 지금 제외 하 고 단계 2.2-2.4, 10% 정상 버퍼링 된 포 르 말린 폐를 해결 하기 위해 2-3 mL를 주입.
- 기관지에서 바늘을 제거 하 고 집게는 포 르 말린의 어떤 누출을 방지 하기 위해 주입 지점에 클램프를 사용 하 여. 조심 스럽게 흉 강에서 폐를 제거 하 고 포함 하는 완전 한 정착을 위해 16-24 h에 대 한 10% 정상 버퍼링된 말린의 ~ 20 mL 50 mL 원뿔 튜브에 넣어.
참고: 최적의 해 부 특징의 보존에 대 한 허용 폐 수정 됩니다. - 다음 날, 70% 에탄올에 고정된 폐는 포 르 말린에서 전송 하 고 폐 조직 카세트에 배치 될 준비.
- 신중 하 게 지점 지점 번호 1-5D, 그림 1보듯이 5 엽 사이 잘라가 위를 사용 하 여 돌출부를 해 부하 여 조직학에 대 한 폐를 준비 하 고 조직 카세트에서 겹치지 않는 방향에 배치. 방향을 그대로 유지 폐 조직에 부드럽게 거품 패드를 두십시오.
- 파라핀 포함까지 해 부 폐 엽 70% 에탄올에 저장 합니다.
- 파라핀 포함 카세트에 티슈를 잘라 4 µ m 두꺼운 부분 얼룩에 대 한 표준 절차를 사용 하 여 합니다.
4. 조직 세분화 및 정량화 상용 소프트웨어를 사용 하 여
- 이미지 hematoxylin 및 오신 (H & E) 상업 multispectral 이미징 시스템을 사용 하 여 1.25 X 배율에서 폐 섹션 스테인드.
- 디지털 이미지 큐브 이미지 변환 및 H & e.에 대 한 (클릭 파일을 다음 로드 스펙트럼 라이브러리에) 미리 만들어진된 스펙트럼 라이브러리를 로드
참고: 스펙트럼 라이브러리 개발 되었다 사전에 단독으로 얼룩진된 폐 섹션, 오신만 물 한 부분에서에서 스펙트럼 이미지를 인수 하 고 다른만 물 되며,이 오픈 소스 독점 스펙트럼 라이브러리에 저장 된 파일 (.csl)입니다. 이미징 시스템 운영 소프트웨어 필요 (수집 프로토콜에 의해 정의 된) 각 파장에 이미지를 획득 했다. 그 이미지 ("이미지 큐브")는 오픈 소스 독점 multispectral 파일 형식 (.im3)에 저장 됩니다. 스펙트럼은 형태학 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 큐브에서 추출 하 고 별도 스펙트럼 라이브러리 파일에 저장 됩니다. - Spectrally unmix 의사 색 H & E 이미지 전체 폐의 Unmix 버튼을 클릭 하 여.
참고: 1 미만 소요 Unmixing s. 조직 유형별 픽셀 수 형태학 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 정량 했다. - 눈의 파장 의존 하는 색깔 응답 각 이미지의 강도 가진 convolved를 사용 하 여 해당 3 색 (빨강, 녹색, 파랑) 이미지에 multispectral 데이터를 변환 하 여 각 이미지 큐브를 시각화 합니다.
참고: 결과 3 이미지 표준 24 비트 컬러 이미지로 표시 됩니다. - 의사 색상에서 사용자가 선택한 이미지를 확장 하 여 각 순수한 이미지 색상 (예를 들어, 빨강, 녹색, 보라색, 등) 하 고 하나의 표준 24 비트 컬러 이미지에 다른 의사 색 순수한 이미지와 함께 그 추가 합니다.
- 모든 분석에 대 한 기본 설정을 사용 합니다.
참고: 일반적으로, 세분화의이 종류는 (즉, 얼마나 잘 훈련의 외부 이미지에 분할 설정 작품의 평가) 결과의 시각적 평가에 의존, 이후 그것은 제대로 훈련, 이미지를 분할 하는 것이 중요 테스트 및 유효성 검사 설정 - 2-3 이미지 (10-15 인간의 생 검 견본을 위해), 훈련 집합으로 기차 그에 때까지 시작 결과 예쁘게, 그리고 다음 다른 2-3 이미지에 그 알고리즘을 적용. 그런 다음 전체 유효성 검사 설정 결과 알고리즘을 적용 합니다.
주: 대부분, 일부 재교육이 필요할 것 이다. - 각 마우스의 1-5 돌출부에 빨간색 의사 색된 종양에 대 한 총 픽셀 수를 계산 하 여 전체 폐 섹션에 종양 영역을 분석 합니다.
참고: 정상 조직의 의사 색은 녹색 및 혈액/혈액 혈관 의사 색은 그림 3에서 보듯이 핑크. 각 치료 그룹에 대 한 평균 종양 부담 처리 그룹에서 각 마우스에 대 한 총 픽셀 수를 측정 하 여 계산 됩니다.
Representative Results
18 F-FDG PET 영상 KL 마우스에 수행 되었고 이러한 마우스에서 종양 했다 이전 출판된 연구26, 동의 높은 18F FDG 소비 (그림 1A)에 의해와 같이 매우 glycolytic 시연 29. 전체 폐의 절제는 여러 종양 (그림 1B)의 존재를 공개 했다. 마우스 폐 그림 1C 및 1d에 대표 하는 5 별도 돌출부에 나눌 수 있습니다. 1-5 돌출부 H & E 또는 포도 당 운송업 자 1 (Glut1)로 얼룩진 했다 sectioned 폐에 표시 했다 (그림 1D). Glut1 포도 당 18F FDG와의 식을 모두의 주요 운송업 자 이며 종양 세포의 원형질 막에 지역화 직접 연관 18F FDG SUV29. 높은 해상도의 분석 Glut1 얼룩 (40 X) 18F FDG에 열렬 한 폐 종양 보여줍니다 높은 표현과 전송의 지역화 원형질 막 (그림 1D)에.
애완 동물 화상 진 찰의 제한 된 해상도 때문에 PET/CT와 조직 autoradiography 수행 했다. Autoradiography의 높은 해상도 작은 종양 및 종양 18F FDG 유통이 지정할 수 있습니다. 종양 유도 후 18F FDG PET/CT 영상 KL 마우스 (그림 2A) autoradiography (그림 2B 와 2c)이이 쥐에서 분리 된 폐에서 다음에 수행 되었다. 그림 2B 와 2c에서 보듯이 autoradiography 식별 18F FDG 긍정 했다 아직 애완 동물에 의해 쉽게 표시 되지 않은 두 개의 추가 더 작은 종양 Autoradiography, 다음 조직으로 슬라이드도 biomarker(s)의 immunohistochemical (IHC) 얼룩을 위해 사용 될 수 있습니다. H & E 종양에 대 한 얼룩 왼쪽된 엽 (그림 2D)에 종양의 존재를 확인 했다.
18F FDG PET 영상 MLN0128 처리 KraG12D;에 수행한 다음, Lkb1-/- 폐 종양 (그림 3)에서 포도 당 대사의 기능 biomarker로 18F FDG를 사용 하려면 마우스. 우리는 MLN0128와 치료를 견고 하 게 mTORC1 신호 및 감소 18F FDG 소비 (그림 3A 와 3B)와 같이 분해 저해을 발견. 이러한 결과 이전 우리의 실험실17,27에 의해 출판으로 kl 기 쥐에 MLN0128를 평가 하는 전 임상 연구와 함께 동의 합니다. 마지막으로, IHC 얼룩 종양 (그림 3C)에서 수행 되었다. 종양 (P-S6) 대 비활성화 (S6) H & E 또는 인-S6, mTORC1의 보존된 기판 이며 mTORC1 활성화를 나타내는 데 사용 됩니다에 대 한 항 체와 얼룩 했다. 그림 3 C 그 이전에 게시 작업17동의 차량 취급에 비해 KL 종양에 MLN0128에 의해 P s 6의 강력한 억제를 보여 줍니다. KRA, 뿐만 아니라 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR) 등 종양 드라이버 뿐만 아니라 폐 종양에 glycolytic 신진 대사를 지원합니다. 따라서, 우리 erlotinib와 constitutively 활성 돌연변이 EGFR 억제 억제 마우스 xenografts에서 18F FDG 대사 여부 테스트. 그림 3D 와 3E 인간의 폐 종양 선 항구는 EGFR del19 돌연변이, HCC827 erlotinib 치료의 5 일을 따라 크게 감소 18F FDG 소비 했다 보여준다.
마지막으로, 형태학 조직 분석 sectioned 폐 및 폐 종양 종양 병 리 조직 하위, 괴 사, 혈관 정상적인 폐 조직, 그리고 항공 우주에서를 포함 하는 분화로 총 종양 부담 또한 계량 하에서 수행 되었다. Kl 기를 GEMMs 다양 한 histopathologies의 폐 종양 자체를 제시 하는 복잡 하 고 병 적 유형이 다른 질병을 개발 했다. Adenocarcinomas (ADC)와 편평 세포 carcinomas (SCC) 포함 됩니다-이 게이 암 치료는 강력한 도전을. 그림 4 A 두 큰 종양 존재는 단일 H & E 얼룩진된 폐 엽을 보여줍니다. 그림 4B 더 높은 확대 이미지는 정상적인 폐, 혈관, 및 영공, 및 종양 괴 사로 선 암, 잘 정의 된 젖꼭지 구조와 편평 세포 암 종에 의해 특징을 식별 합니다. 그림 4 C 는 폐 엽과 정보 형태학 소프트웨어를 사용 하 여 종양의 의사 색을 나타냅니다. 그림 4 D 는 정상적인 폐, 혈관, 및 종양 괴 사 등 세그먼트 편평 세포 암 종에서 잘 분화 된 선 암 종양 하위 개별 pathologies의 비율을 보여줍니다.
그림 1 : Metabolically 활성 KraG12D; Lkb1-/- (KL) 돌연변이 폐 종양은 18F FDG 긍정적이 고 명시적인 높은 수준의 포도 당 운송업 자 1 (Glut1). 패널 A 와 B 편평 폐 종양을 은닉 일부 FDG 열렬 한 KL 마우스에 최대 강도 투영을 [3 차원 (3D) 이미지 라고도 함] 18F FDG PET과 CT 분석을 보여줍니다. (A) 3 차원 재구성 및 폐 tumor(s)의 (B) 통과, 화살 및 코로나 보기 (T)로입니다. (C)이이 패널 패널 A 와 B에 몇 군데 KL 마우스의 전체 폐 조직학, 하나 얼룩이 진 H & E (상단 패널) 또는 항 체와 특정 Glut1에 대 한 (하단 패널). 폐 엽 번호가 지정 됩니다. 눈금 막대 = 2 m m. (D)이이 다이어그램 H & E (중간 패널)에 대 한 패널 C 에 표시 된 슬라이드에서 방향과 마우스 (상단 패널)에 돌출부의 숫자와 H & E 또는 Glut1 스테인드 종양의 높은 해상도 40 X 이미지를 나타냅니다 또는 Glut1에 대 한 특정 항 체로 얼룩진 (하단 패널). 눈금 막대 = 25 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 18 F FDG autoradiography metabolically 활성 작은 종양을 확인할 수 있습니다. (A)이 18F FDG PET/CT 이미지에서는 18F FDG에 열렬 한 종양 KL 마우스 최대 강도 프로젝션 이미지를 표시. T1 및 T2 종양, H = 심장, B = 방광, K = = 신장. (B)이이 패널 마우스의 왼쪽과 오른쪽 폐 엽의 직렬 섹션에 비보 전 autoradiography를 보여줍니다. 왼쪽 및 오른쪽 패널에서 폐는 동일 합니다. 왼쪽된 패널에서 폐는 오렌지를 착 색 하는 의사. 오른쪽 패널에서 폐는 흑인과 백인 색깔. 종양 (T1, T2, 및 T3) 화살표와 함께 표시 됩니다. (C) 이것은 오렌지 autoradiography pseudocolored의 확대 보기 (상단 패널)과 흑인과 백인 (하단 패널). (D)이이 패널 패널 B에서처럼 왼쪽된 엽의 최고 조각의 H & E 염색을 보여줍니다. 눈금 막대 200 µ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 18F FDG 애완 동물에 의해 감지 KL 쥐의 폐 종양의 포도 당 소비를 억제 하는 mTOR 억제제 MLN0128 (A)이이 패널 표시 대표 18차량 (18F FDG 열렬 한, 왼쪽) 또는 MLN0128로 치료 하는 kl 기 생쥐의 F FDG PET/CT 이미지 (18F FDG 열렬 한 비, 오른쪽). 가로 (위 패널), 코로나 (중간 패널), 및 화살 (하단 패널) 조회 표시 됩니다. 종양은 빨간 라인; 설명 H = 심장, L = 간. (B)이이 패널은 차량 및 MLN0128 처리 종양 사이 SUVmax (%ID/g)의 정량화를 보여줍니다. (C)이이 패널 차량 또는 MLN0128 치료 KL 쥐에서 전체 폐 부분의 H & E와 P-S6 얼룩을 보여줍니다. 눈금 막대 25 µ m. (D)이 패널 쇼 대표 18F FDG 애완 동물 및 HCC827 EGFR (del19) xenografts 사전의 CT 이미지 그리고 포스트 erlotinib 치료 =. 종양 (T) 화살표, K와 함께 표시 됩니다 신장, B = = 두뇌. (E)이이 패널을 보여 줍니다 SUVmax (%ID/g)의 부 량 HCC827 xenografts erlotinib 치료 전후. n = 10 종양/그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 종양 및 종양 조직학 형태학 소프트웨어를 사용 하 여 계량 됩니다.
(A)이이 패널 표시 KL 마우스 로부터 수집 된 종양으로 단일 마우스 폐 엽의 H & E 염색 합니다. (B) 이러한 높은 해상도 이미지 표시 편평 세포 암 종 (위 왼쪽), 정상적인 폐, 혈관, 그리고 공기 공간 (오른쪽 위), 젖꼭지 잘 분화 된 선 암 (왼쪽 아래) 및 괴 (오른쪽 아래). (C)이이 패널 표시 H & E-얼룩진 폐의 pseudocoloring 엽 형태학 소프트웨어를 사용 하 여. (D)이이 패널이 보여줍니다 개별 폐에 대 한 비율 정보에 의해 측정 하는 엽와 종양 병 리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 문서 mTOR 억제제 MLN0128의 납품을 따라 폐 종양에 대사 및 분자 응답을 측정 하기 위해 qIHC와 18F FDG PET/CT 영상 활용 영상 기반 실험 방법을 설명 합니다. MLN0128는 종양에서 중요 한 변화 응답을 나타내는 18F FDG 소비를 효과적으로 감소. 연결 함으로써 PET/CT 영상 immunohistochemistry, 우리 공간 sectioned 종양 3D PET/CT 이미지를 등록 하 고 전체 종양 세포 및 분자 수준에서의 상세한 검사를 수행할 수 있었다. 이 MLN0128는 mTOR 신호, 종양에서 약에 대상 분자 응답 확인 저해 확인 가능 했다. 마지막으로, 양적 조직학을 활용 함으로써 매핑할 수 있었습니다 그리고 별도 뚜렷한 종양 병 리, 종양 괴 사에서 전체 종양 질량 같은 편평 세포 carcinomas에서 선 암 정의 microPET 이미징 보완.
MicroPET 현재 약 1 m m의 공간 해상도 의해 제한 됩니다. 또한, 18F FDG 보존 특정 조직에 플라스마 포도 당 수준, 종류 및 마 취 노출, 환경 온도, 그리고 영향을 줄 수 있는 동물의 일반적인 건강의 기간을 포함 하 여 다양 한 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 18 F FDG 약 동학30. 이러한 매개 변수는이 프로토콜에 대 한 최적화 되었습니다 하지만 각 동물 모델에 대 한 최적화 되어야 합니다. 마우스에 피하 종양의 18F FDG 영상의 재현성 연구 보여 개별 마우스의 종양 치료 응답 18 에 의해 평가 하는 것을 건의 약 15%의 평균 %ID/g에 대 한 변동 계수 F FDG 애완 동물 안정적이 고 중요 한31간주이 임계값 보다 클 수 합니다.
애완 동물 추적기의 세포 및 subcellular 심지어 배포 이후에 얼룩이 지 고 qIHC 공동 등록 섹션 조직 autoradiography 하 여 평가 수 있습니다. CT와 공동 등록 애완 동물 허용 해 부 컨텍스트;에 넣어야 하는 애완 동물 이미지 이것은 낮은 부드러운 조직 대비로도 매우 중요 합니다. 자기 공명 영상 (MRI)와 CT에 의해 연부 조직 대조의 부족을 극복할 수 있습니다. 더하여, 형광 이미징에 대 한 생체 분해에서 vivo에서, 하지만 광자 흡수를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다 및 폐 구멍에서 분산형 정확한 정량 또는 탐지 감도32에 영향을 미칠 수 있습니다. 요약 하자면, 양적 조직학으로 전체 동물 PET/CT 영상 활용 종양 생물학 치료 개입에 따라 정확 하 고 실시간으로 지도를을 제공 합니다.
Multispectral 이미징 (MSI) 컬러 이미지를 사용할 수 있습니다 어떤 상황 든 지에 적용 됩니다. 아주 최소한, MSI 컬러 이미지와 동일한 정보를 제공 하 고 일부 응용 프로그램에 대 한 MSI 간단한 광대역 3 색 (RGB) 이미지 보다 샘플의 스펙트럼 속성에 대 한 정보를 자세한 제공할 수 있습니다. 일반적으로, MSI의 한계는 그 컬러 이미징, MSI 느립니다와 이미지에 더 많은 시간이 걸립니다. 형태학 소프트웨어 그리고 이미지에 대 한 재현, 정확한 세분화 결과 얻기 위해 사용 재료의 테이블에서에서 설명. 조직 세분화 및 조직학의 정량화에 사용할 수 있는 추가 상용 제품이 있습니다.
복잡 한 암 대사는 바르 부르 크 효과 및 포도 당 물질 대사33,34넘어 확장 됩니다. 그것은 매우 가능성이 종양 분해를 억제 하는 단일 에이전트 치료에 쉽게 적응할 것 이다입니다. 암, 아미노산 대사에 대 한 잘 문서화 하 고 종양 자유 지방산35,36, 같은 다른 대사 산물 뿐 아니라 글루타민, 글리신, 떠들고, 등 amino acids에 의존으로 예상 된다 37. 18F FDG, 뿐만 아니라 18F-및 11C 레이블이 글루타민, 콜린, 아세테이트, 1-프로브 (2'-의하여-2'-fluoroarabinofuranosyl) 시 토 신 (포워드 액티브) 및 fluorothymidine (FLT) 성공적으로 사용 되었습니다 이미지 아미노산, 뉴클레오티드, 그리고 암38,39,,4041의 동물 모델에서 지질 물질 대사. 자동화 및 미 추적 radiochemistry 기술을 높은 해상도와 결합, 높은 감도 애완 동물 스캐너는 다양 한 생물학 절차42,43를 측정 하기 위한 애완 동물의 접근성을 향상 됩니다. 신진 대사 증가의 이해, 그것은 논리는 애완 동물 radiotracers의 레 퍼 토리 증가 뿐만 아니라, 연구자와 의사 noninvasively 프로필 종양 물질 대사를 활성화.
PET/CT 영상 및 정량 조직학의 활용 빠르게 임상 사용에 벤치 발견을 번역 하는 임상 필요를 해결 합니다. 이 위해 연구자는 PET/CT 영상 수 있습니다 마약에 인수 저항 뿐 아니라 치료 응답을 정확 하 게 측정 수 있어야 합니다. 또한, 폐 종양의 PET/CT 및 immunohistochemical 분석, 환자에서 치료의 표준으로 사용 된다는 직접 임상 연습으로 번역. 중요 한 것은, PET/CT 영상 쉽게 치료 저항 종양, 어떤 연구자 수 시키고 질병의 메커니즘을 이해 하기 위하여 분자 수준에서 심문을 식별 합니다. 이 가능 하 게 그것의 저항 메커니즘을 이해 하 고 임상 번역에 대 한 더 효과적인 치료 전략을 디자인 하는 반복적인 프로세스입니다.
Disclosures
케빈 피 프랜시스 Perkin Elmer의 직원입니다. 제임스 맨 스 필드 나스닥에 엘머, Inc (PKI) 주식의 공개 주주 이다. 저자는 공개 아무것도 있다.
Acknowledgments
우리는 캘리포니아 로스 앤젤레스 ' Crump Preclinical 이미징 기술 센터 그들의 도움에 대 한 쥐, 변환 병리학 핵심 연구소와 캘리포니아 대학 로스 앤젤레스 ' 통계 코어의 PET/CT 영상 대학 감사 데이비드 Geffen 학교의 의학 종양 샘플 준비와 분석 그들의 도움에 대 한. 자금, 데이비드 B. Shackelford는 CTSI에 의해 지원 되었다 및 KL2 변환 과학 상을 부여 번호 KL2TR000122 및 UL1TR000124는 데이비드 게 펜의과 대학에 ucla 그리고 여는 부의 방어 폐 암 연구 프로그램 변환 연구 제휴 W81XWH-13-1-0459 및 ACS RSG-16-234-01-TBG. 숀 T. 베일리는 데이비드 게 펜의과 ucla 통해 NIH T32 훈련 그랜트 HL072752에 의해 지원 되었다. 안토니 존스 UCLA 종양 세포 생물학 교육 프로그램 (USHHS 루스 L. Kirschstein 기관 국가 연구 봉사 상 # T32 CA009056)에 의해 지원 됩니다. Gihad Abdelhady는 NIH/NCI 다양성 보충 R01CA208642에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| G8 PET/CT | Perkin Elmer | CLS139564 | Used for 18F-FDG PET and CT imaging of mice |
| Axio Imager.M2 | Zeiss | 490020-0003-000 | Acquiring images of FFPE lung tumor sections |
| Inform software | Perkin Elmer | CLS135781 | Morphometric used for image analysis of tumor pathologies |
| Glut1 antibody | Alpha Diagnostics | GT12-A | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
| Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP™ Rabbit mAb | Cell Signaling Technologies | 4858 | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
| MX35 Premier microtome blades | Thermo Fisher Scientific | 3051835 | Microtome blades for sectioning tissue for autoradiography |
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