Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En multi godt Format polyacrylamid-baseret analyse for at undersøge effekten af ekstracellulære Matrix stivhed på bakteriel infektion af vedhængende celler

Published: July 5, 2018 doi: 10.3791/57361
Automatic Translation
1, 1, 2, 3
1Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California San Diego, 3Departments of Biochemistry, Microbiology and Immunology and Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine

Summary

Vi har udviklet en multi godt format polyacrylamid-baseret analyse for sondering effekten af ekstracellulære matrix stivhed på bakteriel infektion af vedhængende celler. Denne analyse er kompatibel med flowcytometri, immunfarvning og trækkraft force mikroskopi, giver mulighed for kvantitative målinger af de biomekaniske interaktion mellem celler, deres ekstracellulære matrix og sygdomsfremkaldende bakterier.

Abstract

Ekstracellulær matrix stivhed består en af de flere miljømæssige mekaniske stimuli, der er kendt for at påvirke cellulære adfærd, funktion og skæbne i almindelighed. Selv om stadig flere vedhængende celletyper svar til matrix stivhed er blevet karakteriseret, hvordan tilhænger cellernes følsomhed over for bakteriel infektion afhænger matrix stivhed er stort set ukendt, som er effekten af bakteriel infektion på den biomekanik af værtsceller. Vi hypotesen, at modtagelighed i endothelial værtsceller til en bakteriel infektion afhænger stivhed matrix som disse celler opholde sig, og at infektion af værten celler med bakterier vil ændre deres biomekanik. For at teste disse to hypoteser, blev endotelceller brugt som model værter og Listeria monocytogenes som en model patogen. Ved at udvikle en roman multi godt format assay, viser vi, at effekten af matrix stivhed på infektion i endothelial celler af L. monocytogenes kan vurderes kvantitativt gennem flowcytometri og immunfarvning efterfulgt af mikroskopi. Derudover kan benytter trækkraft force mikroskopi, effekten af L. monocytogenes infektion på vært endotel celle biomekanik blive undersøgt. Den foreslåede metode giver mulighed for analyse af effekten af væv-relevante mekanikere på bakteriel infektion af vedhængende celler, som er et afgørende skridt mod forståelse de biomekaniske interaktion mellem celler, deres ekstracellulære matrix, og sygdomsfremkaldende bakterier. Denne metode er også gældende for en bred vifte af andre typer af undersøgelser på celle biomekanik og svar til substrat stivhed hvor det er vigtigt at være i stand til at udføre mange gentagelser parallelt i hvert forsøg.

Introduction

Celler i de fleste dyrevæv er typisk vedhængende, både tilstødende celler og deres ekstracellulære matrix (ECM). Forankring af celler til deres ECM er kritiske for mange cellulære processer lige fra celle motilitet til celle spredning og overlevelse1,2. Cellulære anchorage til ECM afhænger både af ECM sammensætning og stivhed. Celler reagerer på ændringer i sidstnævnte af dynamisk re-arrangere deres cytoskeleton, celle-ECM og cell-celle sammenvoksninger, som til gengæld kritisk ændre celle biomekanik og funktioner3,4,5,6 . ECM stivhed kan variere i rummet (dvs., anatomiske placering), tid (dvs., aldring) og patofysiologiske processer (f.eks., åreforkalkning, kræft, infektioner, osv.). For eksempel er det almindeligt accepteret at endothelial celler bosat på stivere-i forhold til blødere-matricer udøve øget styrker deres ECM og hinanden og udviser øget motilitet og spredning7,8. Ligeledes fibroblaster bosat på stivere matricer give høj kontraktile styrker til deres ECM og vise øget spredning, motilitet og ECM produktion9,10,11. Selv om celle mekanik og svar på ECM stivhed er blevet undersøgt udførligt for forskellige celletyper, forholdet mellem vedhængende værtsceller, er stivhed af deres ECM, og bakterielle infektioner stadig stort set ukendt.

For at undersøge rollen for ECM stivhed i bakterier-værtssammenspil celle, blev L. monocytogenes (Lm) valgt som model patogenet. LM er en allestedsnærværende fødevarebårne bakterie, der kan forårsage systemisk infektion i en bred vifte af pattedyr værter. Denne fakultativ intracellulære patogenet kan flytte fra den intestinale epitel til fjerntliggende organer ved gennemkører forskellige typer af vaskulære endothelia. Hvis det krænker blod - hjerne barrieren, Lm kan forårsage meningitis, og når den krydser placenta, kan det medføre spontan abort12,13. LM kan inficere forskellige vært celletyper og kan gøre det ved hjælp af forskellige patogene strategier. LM infektion er blevet undersøgt for det meste i forbindelse med epitelceller, mens langt mindre vides om hvordan Lm kan inficere og bypass endothelial celler foring lumen af blodkar14,15,16. Desuden, det er stadig stort set ukendt, hvordan stivhed af ECM hvor endotelceller bor modulerer LMS evne til at invadere disse værtsceller og derefter sprede. LM og flere ekstra bakteriel arter (dvs., Rickettsia parkeri) drage fordel af actin cytoskelettet af værten celler de inficerer både invadere i deres cytoplasma og lette celle til celle formidling17 , 18 , 19. de opnå dette gennem udtryk af proteiner, der kunne forstyrre vært actin polymerisering veje og producere actin komet haler, at lette deres fremad fremdrift16,20. Som følge af infektion skal cellen vært actin cytoskeleton dynamisk flytte rundt på en måde, der er stadig ikke fuldt karakteriseret, potentielt påvirker biomekanik af værtsceller, herunder de fysiske kræfter de lægge på deres ECM og på hver andre. For at undersøge disse processer, menneskelige mikrovaskulære endotelceller (HMEC-1) blev valgt som model værtsceller af tre grunde: 1. endotelceller er kendt for at være meget mechanosensitive som de konstant er udsat for forskellige fysiske stikord21; 2. strategier Lm beskæftiger for at inficere endotelceller er stadig stort set ukendt22; og 3. HMEC-1 kan er en udødeliggjort cellelinie og, derfor nemt dyrkes og udsat for genmanipulation.

Bakteriel infektion i værtsceller har for det meste været undersøgt in vitro- ved såning celler på glas eller polystyren substrater, der er betydeligt hårdere end de fleste celler12,14,23fysiologiske ECM. At undersøge infektion af celler seedede på en matrix, hvis stivhed er fysiologisk relevante og at belyse rollen af ECM stivhed på infektion af celler af bakterielle patogener, fulgte vi en innovativ tilgang baseret på opdigte tynd microbead-embedded polyacrylamid hydrogels afstemmelige stivhed på multi godt plader. Nyhed af den foreslåede tilgang ligger i, at det giver mulighed for overvågning flere betingelser samtidig på grund af dens multi godt format og i, at det er kompatibelt med flere teknikker på grund af den særlige måde, substraterne er bygget. HMEC-1 celler var seedet på disse protein-coated hydrogels og derefter inficeret med forskellige Lm stammer, der enten bliver fluorescerende på internalisering eller er constitutively fluorescerende. Rollen af ECM stivhed på infektion modtagelighed af vært HMEC-1 celler blev evalueret ved flowcytometri. Derudover immunfarvning og Fluorescens mikroskopi blev brugt til at skelne mellem vedhængende og internaliseret bakterier. Endelig, trækkraft kraft mikroskopi (TFM) blev med held udført for at karakterisere effekten af Lm infektion på trækkraft understreger, at værten endotelceller øve på deres matricer under infektion. Præsenteres analysen kan let modificeret til at give yderligere undersøgelser af virkningen af ECM stivhed på infektion modtagelighed for vedhængende celler ved hjælp af forskellige cellelinjer eller patogener.

Protocol

1. fremstilling af tynd to-lags polyacrylamid (PA) Hydrogels på multi godt plader

  1. Opløse ammonium persulfat (APS) i destilleret ultrarent vand til at opnå en endelig koncentration på 10 g/mL. Alikvot og store løsning ved 4 ° C til kortvarig brug (3 uger).
    Bemærk: Ovenstående løsning kan være forberedt inden hydrogel fabrikation.
  2. Glas aktivering af 24-godt retter
    1. Inkuber 24-godt glas bundplade med 13 mm-diameter wells (Se Tabel af materialer) i 1 time med 500 µL af 2 M NaOH pr. brønd ved stuetemperatur.
    2. Skyl wells 1 x med ultrarent vand og derefter tilsættes 500 µL af 2% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (Se Tabel af materialer) i 95% ethanol hver godt i 5 min.
    3. Skyl wells 1 x igen med vand og tilsæt 500 µL af 0,5% glutaraldehyd til hver brønd for 30 min. Skyl wells 1 x med vand og tør dem på 60 ˚C med låget af.

Figure 1
Figur 1 : Bakteriel infektion assay af værtsceller bosat på tynde to-lags fluorescerende perle-embedded polyacrylamid (PA) hydrogels af varierende stivhed. A. glas coverslips er kemisk modificeret for at aktivere hydrogel vedhæftet fil. B. 3,6 µL af PA blandinger er deponeret på glas-bunde. C. blandingen er dækket med en 12-mm cirkulære glas coverslip at aktivere polymerisering. D. coverslip er fjernet med en nål sprøjte. E. 2,4 µL af en PA løsning med microbeads er tilføjet på toppen af det nederste lag og loft med en cirkulær glas coverslip. F. en buffer er tilføjet i brønden og coverslip er fjernet. G. UV-bestråling i 1 h sikrer sterilisation. H. en Sulfo-SANPAH-holdige løsning er tilføjet på geler, som er så placeret under UV til 10 min. jeg. Hydrogels vaskes med en buffer og derefter inkuberes natten med collagen I. Jørgensen. Hydrogel er ekvilibreres med celle medier. K. vært cellerne udsås. L. LM bakterier er tilføjet til løsningen og infektionen synkroniseres via centrifugering. M. 1 h efter infektionen bakterier i løsningen er skyllet væk og medier suppleret med et antibiotikum er tilføjet. N. 4 h efter infektionen, Lm (JAT985) påbegyndes fluorescerende. O. HMEC-1 celler er løsrevet fra deres matrix og løsningerne, der er overført til rør til at udføre flow flowcytometri målinger. Bemærk at dage og omtrentlige tider for hvert trin af analysen også er angivet. Dette tal er blevet ændret fra Bastounis og Theriot59. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Polyacrylamid hydrogel fabrikation
    Bemærk: Se figur 1.
    1. Forberede vandige opløsninger, der indeholder 3-10% af 40% stock acrylamid løsning (Se Tabel af materialer) og 0,06 - 0,6% af 2% stock bis-acrylamid løsning (Se Tabel af materialer) at fremstille hydrogels af afstemmelige stivhed spænder fra 0,6 kPa til 70 kPa. Se tabel 1.
      1. 0,6 kPa hydrogels, mix 3% acrylamid med 0,045% bis-acrylamid. 3 kPa hydrogels, mix 5% acrylamid med 0.074% bis-acrylamid. 10 kPa hydrogels, mix 10% acrylamid med 0.075% bis-acrylamid. For 20 kPa hydrogels, bland 8% acrylamid med 0.195% bis-acrylamid. For 70 kPa hydrogels, Bland 10% acrylamid med 0,45% bis-acrylamid.
        Bemærk: Yderligere oplysninger om at opnå den ønskværdige PA hydrogel stivhed kan findes andetsteds24,25,26,27.
    2. Forberede hver ønskeligt hydrogel stivhed to vandige opløsninger. Forberede løsning 1 at være perle-fri og løsning 2 indeholder 0,03% 0,1 µm diameter fluorescerende micro-beads (Se Tabel af materialer).
    3. Degas løsninger 1 og 2 af vakuum i 15 min. for at fjerne ilt, som er kendt for at hæmme polymerisering af løsningerne.
    4. Tilføje 0,6% af 10 g/mL lager APS løsning og 0,43% tetramethylethylenediamine (TEMED) til løsning 1 for at aktivere en polymerisation indledning. Handle hurtigt.
    5. Tilføje 3,6 µL af løsning 1 til midten af hver brønd af 24-godt parabol (Se trin 1.2 for sin forberedelse).
    6. Straks dække brønde med 12-mm ubehandlet cirkulære coverslips og lad løsning 1 sidde i 20 min., så det fuldt polymeriserer.
    7. Tryk forsigtigt på en sprøjte nål til en overflade til at oprette en lille krog på sin spids at lette fjernelsen af coverslips. Løft coverslips ved hjælp af sprøjte nål.
    8. Tilføje 0,6% af 10 g/mL APS stamopløsningen og 0,43% TEMED til løsning 2. Depositum 2,4 µL af blandingen på toppen af det første lag i hver brønd af 24-godt parabol.
    9. Dække løsning 2 med 12-mm cirkulære glas coverslips, forsigtigt trykke nedad ved hjælp af et par pincet til at sikre, at tykkelsen af det andet lag er minimal. Lad løsning 2 polymerisere i 20 min.
    10. Tilføje 500 µL af 50 mM HEPES pH 7,5 til hver af brøndene og derefter fjerne glas coverslips med sprøjte nål og pincet.
  2. Sterilisation, kollagen-belægning og ækvilibrering af polyacrylamid hydrogels
    1. UV-udsætte hydrogels for 1 h i vævskultur hood at tillade sterilisation.
    2. Forbered en blanding af 0,5% vægt/volumen sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2 '-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, se Tabel af materialer) i 1% DMSO og 50 mM HEPES pH = 7,5.
    3. Tilføje 200 µL af denne løsning til den øvre overflade af hydrogels. Handler hurtigt, udsætter dem for UV (302 nm) for 10 min at aktivere dem.
    4. Vask hydrogels to gange med 1 mL 50 mM HEPES pH = 7,5. Gentag fjernes om nødvendigt at sikre, at eventuelle overskydende crosslinker.
    5. Protein-coat hydrogels med 200 µL af 0,25 mg/mL rotte hale kollagen jeg (Se Tabel af materialer) i 50 mM af HEPES. Ruger hydrogels med kollagen løsning på toppen, natten over ved stuetemperatur.
      Bemærk: For at forhindre dehydrering/fordampning, placere multi godt pladerne i en sekundær indeslutning og tilføje laboratorium rengøring væv dyppet i vand i den indre periferi af indeslutning.
    6. Bruge et epifluorescensmikroskop eller Konfokal mikroskop med en 40 X mål til at måle tykkelsen af hydrogels. Gøre dette ved at placere z-holdninger i bunden (hvor glasoverfladen er) og top fly af hydrogel (hvor de fluorescerende perler intensitet er maksimum). Fratræk derefter z positioner for at bestemme højden.
      Bemærk: Vi brugte en inverteret epifluorescensmikroskop og et 40 X mål med numerisk blænde 0,65 til at måle tykkelsen af hydrogels. Atomic Force mikroskopi målinger (AFM) kan også udføres på dette tidspunkt for at bekræfte den nøjagtige stivhed af hydrogels (Se figur 2).
    7. Før såning celler af interesse på hydrogels, der tilsættes 1 mL af medierne på hydrogels og dem der inkuberes ved 37 ˚C i 30 min. til 1 time at sikre ækvilibrering.
      Bemærk: Vi tilføjet MCDB-131 fuld medier, fordi det er medierne hvor model værtsceller (HMEC-1) var kulturperler i (Se trin 2.1 for detaljer).

Figure 2
Figur 2: AFM målinger af PA hydrogel stivhed og perler distribution. A. Data viser de forventede unge modulus (måling af stivhed) af PA hydrogels, da mængden af akrylamid og bis-acrylamid bruges versus de unge modulus målt ved hjælp af AFM (N = 5-6). De vandrette bjælker skildrer middelværdien. Stivhed af 0,6 kPa hydrogels kunne ikke måles, fordi hydrogels var meget blød og overholdt til AFM spids. B. Dette er en fase billede af sammenflydende HMEC-1 celler og den tilsvarende billede af perlerne indlejret på den øverste overflade af en blød 3 kPa-PA hydrogel. HMEC-1 var seedede i 24 timer ved en koncentration på 4 x 105 celler pr. brønd. C. dette billede er det samme som figur 2B , men for celler, opholder sig på en stiv 70-kPa PA hydrogel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

2. menneskelige mikrovaskulære endotel cellekultur og såning på Hydrogels

  1. Kultur HMEC-1 (menneskelige, mikrovaskulære endotel) celler i MCDB-131 fuld medier indeholdende MCDB-131 media suppleret med 10% føtal bovint serum, 10 ng/mL for epidermal vækstfaktor, 1 µg/mL af hydrocortison og 2 mM L-glutamin (Se tabel af materialer ).
  2. Opdele de sammenflydende kulturer 1:6 hver 3-4 dage og holde cellerne indtil passage 40.
  3. En dag før eksperimentet, frigøre celler fra deres kultur fartøj ved hjælp af 0,25% trypsin/EDTA. Først vaske cellerne og deres kultur fartøj 1 x med steril phosphat bufferet saltvand (PBS), og derefter tilføje den passende mængde 0,25% trypsin/EDTA (2 mL pr. 100-mm parabol eller 75 cm kolbe, 1 mL per 60-mm parabol eller 25-cm kolbe), inkubere kolben ved 37 ° C i 5-10 min at tillade udstationering af celler fra deres substrat.
  4. Neutralisere trypsin ved at tilføje den ønskede mængde af MCDB-131 fuld medier, afpipetteres forsigtigt at bryde op klumper af celler, og derefter placere løsningen i et konisk centrifugeglas.
  5. Forsigtigt swirl løsning af celler til at sikre, at cellerne er jævnt fordelt og derefter tage ud 20 µL af opløsningen og meget forsigtigt udfylde de to kamre under coverslip af et glas hemocytometer.
  6. Pellet ned løsning af celler, der er indeholdt i en konisk centrifugeglas ved hjælp af centrifugering i 10 min på 500 x g.
  7. I ventetiden 10 min tælle celler ved hjælp af en hemocytometer. Bruge et mikroskop, fokusere på gitterlinjer i hemocytometer med en 10 X mål, og derefter bruge en hånd tally tæller til at tælle antallet af celler i en 1 mm x 1 mm kvadrat.
  8. Flytte hemocytometer til en anden 1 mm x 1 mm square, tælle cellerne der og derefter gentage processen to gange mere. Beregne gennemsnittet af de fire målinger og derefter multiplicere gennemsnittet af 104. Den endelige værdi er antallet af levedygtige celler/mL i cellesuspension, der er der centrifugeres.
  9. Fjern væsken konisk centrifugeglasset samtidig med at celle pellet ikke forstyrres. Resuspend celler i MCDB-131 fuld medierne i en koncentration på 4 x 105 celler/mL.
  10. Frø celler i suspension på hydrogels ved først at fjerne medierne som hydrogels blev udruget og derefter tilføje 1 mL cellesuspension på hver hydrogel.

3. infektion af menneskelige mikrovaskulære endotelceller med L. monocytogenes

  1. Advance forberedelse
    Bemærk: Forberede følgende løsninger på forhånd.
    1. Streptomycin, chloramphenicol og gentamycin bestande
      1. Forberede 50 mg/mL af streptomycin stamopløsninger af vejer 0,5 g af streptomycin sulfat og opløse det helt ind i 10 mL i ultrarent vand.
      2. Forberede 7,5 mg/mL af chloramphenicol stamopløsninger af vejer 75 mg chloramphenicol og opløse det helt ind i 10 mL 100% ethanol.
      3. Forberede 20 mg/mL af gentamicin stamopløsninger af vejning 0,2 g af gentamicin sulfat og opløse det helt ind i 10 mL i ultrarent vand.
      4. Filter-sterilisere alle stamopløsninger med 0,2 µm sprøjte filter og gemme dem på-20 ° C til langvarig brug (1-2 måneder).
    2. Hjernen hjerte infusion (BHI) medier og agar plader
      1. Find to 1-L kolber og tilføje en magnetisk røre bar inde hver kolbe.
      2. BHI medier, tilføje 37 g BHI pulver i en kolbe og tilføje ultrarent vand op til 1 L. Mix løsningen kraftigt ved at placere kolben paa en magnetic røre plade, indtil pulveret er opløst.
      3. For BHI agar plader, tilføje 37 g BHI pulver og 15 g granuleret agar (Se Tabel af materialer) i den anden kolbe og tilsættes ultrarent vand op til 1 L. Mix opløsningen kraftigt ved at placere kolben paa en magnetic røre plade, indtil pulveret er opløst.
      4. Skru lågene på kolberne ikke for stramt og autoklave løsninger ved hjælp af flydende indstilling eller i henhold til den autoklave specifikationer.
      5. Fjerne løsningen fra autoklave og derefter køle ned agar-BHI løsningen til 55 ° C. Hvis BHI medier i 1 L målekolbe holdes sterilt, det kan bruges til op til en måned.
      6. For at forberede bakterierne agar-BHI plader, først tilføje antibiotika, hvis det er relevant, anbringes i en kolbe indeholdende BHI og agar (afhængigt af bakteriestammer skal dyrkes). Kort sæt kolben på en magnetisk røre plade til at tillade hurtig blanding.
        Bemærk: De antibiotika, der anvendes her er specifikke for Lm stammer bruges, men eventuelle nødvendige antibiotika kan anvendes i BHI-agar plader. Vi tilføjet streptomycin til en koncentration på 200 µg/mL og chloramphenicol til en koncentration af 7,5 µg/mL, fordi 10403S Lm stammer er resistente over for streptomycin. Disse stammer har været konjugeret med et plasmid, der indeholder chloramphenicol acetyltransferase åben læsning rammen, derfor resistens for chloramphenicol.
      7. Hæld blandingen i 10 cm polystyren bakterier kultur plader (ca 20 mL pr. plade). For at slippe af med bobler, flamme oversiden af pladerne kort. Cool plader natten over ved stuetemperatur.
      8. Den næste dag, forsegle de tørre plader og gemme dem på 4 ° C.
  2. Infektion af menneskelige mikrovaskulære endotelceller med L. monocytogenes
    1. Tre dage før infektionen, streak ud Lm stamme til at blive brugt fra en glycerol bestand (opbevares ved-80 ° C) på en BHI-agar plade, som indeholder 7,5 µg/mL af chloramphenicol og 200 µg/mL af streptomycin, hvis det er relevant.
      Bemærk: Stamme at være stribet ud kan være en wild-type eller mutant, constitutively udtrykker fluorescens (for immunfarvning JAT1045 blev brugt) eller udtrykke fluorescens ActA promotor (for flow flowcytometri eller trækkraft force mikroskopi JAT983 eller JAT985 blev brugt)22.
    2. Inkuber plader ved 37 ° C, indtil diskrete kolonier er dannet (1-2 dage).
    3. Dagen før infektionen, vokse den ønskede stamme natten, ryster det på 150 rpm ved 30 ° C i BHI medier med 7,5 µg/mL af chloramphenicol (hvis relevant).
      1. Sted 5 mL af BHI medier i en 15 mL konisk centrifugeglas, tilsættes 7,5 µg/mL af chloramphenicol (hvis relevant), og derefter podes en enkelt koloni fra agar plade ved hjælp af en steril 10 µL tip.
    4. Den næste dag, lige før infektionen, måling af Ekstinktionen af opløsningen bakterier på 600 nm (OD600) ved fortynding af prøven 1:5; Brug en kuvette, der indeholder BHI alene til at tjene som en tom.
    5. Fortyndes de overnattende kultur til en OD600 på 0,1 og inkuberes det, ryster i 2 timer ved 30 ° C, BHI medier med 7,5 µg/mL af chloramphenicol (hvis relevant) for at tillade bakterier at nå log-fase vækst.
    6. Måle OD600 af den bakterielle løsning, der forventes at være omkring 0,2 - 0,3. Hvis OD600 er højere, fortyndes til 0,2 - 0,3 med BHI alene.
    7. Tage 1 mL af bakteriel løsning i et microcentrifuge rør. Spinde det ned i 4 min på 2.000 x g ved hjælp af centrifugering ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og bakteriel resuspenderes i 1 mL vævskultur-grade PBS, i vævskultur hætte. Vaske bakterierne to gange flere ved at dreje dem ned i 4 min på 2.000 x g ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og resuspend bakterier i 1 mL PBS.
    8. Forberede infektion mix ved at blande 10 eller 50 µL af bakterier genopslemmes i PBS med 1 mL af MCDB-131 fuld medier for en mangfoldighed af infektion (MOI; dvs., antal bakterier pr. vært celle) af cirka 50 bakterier pr. vært celle eller 10 bakterier pr. vært celle.
    9. Fjerne medier fra wells af 24-godt plader, passe på ikke at forstyrre hydrogels eller celler. Vaske cellerne 1 x med 1 mL af MCDB-131 fuld medier og derefter tilsættes 1 mL af bakterier til hver brønd.
    10. Holde nogle infektion mix (mindst 100 µL) til bestemmelse af MOI (Se trin 3.3).
    11. Dække pladen med låg og wrap plader med polyethylen mad wrap til at undgå udsivning. Læg pladerne i centrifugen og spin prøver i 10 min ved 200 x g at synkronisere invasionen. Flytte pladerne i vævskultur inkubator og Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
    12. Vaske prøver 4 x med MCDB-131 fuld medier og flytte dem ind i vævskultur inkubator. Efter en yderligere 30 min, skal du erstatte medierne med media suppleret med 20 µg/mL af gentamicin.
  3. Bestemmelse af mangfoldigheden af infektion (MOI)
    1. Under den indledende 30-min inkubation af værtsceller med bakterier, forberede 10-fold serielle fortyndinger af infektion blanding til at bestemme MOI. Lav 10-fold fortyndinger ved at blande 100 µL af infektion mix med 900 µL 1 x PBS (10-1 fortynding). Derefter blandes 100 µL af 10-1 fortynding med 900 µL af PBS (10-2 fortynding).
    2. Fortsætte indtil en 10-5 fortynding er opnået.
      Bemærk: Alle løsninger skal være blandet godt før udvande dem, og frisk ren pipette tips skal bruges på hvert trin.
    3. Når Fortyndingerne er gjort, placere 100 µL af den 10-2 - 10-5 fortyndinger på midten af BHI/agar/chloramphenicol/streptomycin plader (hvis relevant).
    4. Foretage en sprederen fra glas pipette ved hjælp af ild til at bøje pipette for at oprette en krog. Dyp pipette i 100% ethanol til sterilisation og derefter brænde ud ethanol med en flamme.
    5. Når sprederen er afkølet, sprede de bakterielle fortyndinger administrationsprocedurerne på plader med udgangspunkt i 10-5 fortyndingen og flytning til mere koncentreret blandinger. Inkuber plader op og ned ved 37 ° C i 2 dage.
    6. Afhængigt af koloni tætheden, afgør antallet af kolonier af enten den 10-3 og 10-4 eller den 10-4 og 10-5 fortynding plader. Beregn MOI som følger:
      antallet af kolonier × faktor ÷ fortyndingsvolumen indledende tilføjet = antal CFU pr. µL
      antal CFU pr. µL × volumen af bakterier mix pr. brønd = antal CFU pr. brønd
      antal CFU pr. godt × volumen af celler pr. brønd = antal bakterier pr. celle
      Bemærk: CFU står for kolonidannende enheder.
    7. Gennemsnit MOIs fra to plader til at opnå de endelige MOIs.

4. flowcytometri at kvantificere ekstracellulære matrix stivhed afhængige modtagelighed af værtsceller for infektion

  1. 5 mg af collagenase og placere det i en 15 mL konisk centrifugeglas. Der tilsættes 10 mL 0,25% trypsin-EDTA og bland dem godt.
  2. 8 h efter infektionen, fjerne medier fra wells af 24-godt-plade og vask wells 1 x med vævskultur PBS. Fjern PBS fra brøndene og tilføje 200 µL af trypsin-EDTA/collagenase mix til hver brønd. Placere dette i vævskultur inkubator for 10 min at tillade fuld løsrivelse af celler.
  3. Bruge en frisk pipette til hver brønd og afpipetteres mix op og ned 8 x. Være blid så man ikke skader cellerne. Tilføje 200 µL af fuld medier til hver brønd til at neutralisere trypsin.
  4. Overføre den 400-µL celle løsning af hver godt ind i et 5-mL polystyren rør med en 35-µm celle si cap (Se Tabel af materialer).
  5. Analysere 10.000-20.000 celler pr. prøve ved flowcytometri. Udføre dataopsamling via flowcytometri og bestemme procentdelen af inficerede celler pr. brønd ved hjælp af en relevant kommercielt tilgængelige software. Brug af forward scatter versus side scatter observationsområder til gate hovedparten af fordelingen af cellen tæller.
    Bemærk: Dette vil sikre analyse af enkelt celler og fjerne snavs eller celle dubletter eller trillinger.
    1. Måle fluorescens signalet fra kontrol-inficerede celler og gate befolkningen i inficerede celler undtagen autofluorescence.

5. immunfarvning af ekstracellulære bakterier, mikroskopi og billedbehandling

Bemærk: Denne tilgang er fulgt for at skelne mellem ECM-stivhed afhængige bakteriel adhæsion vært celle overfladen versus bakteriel internalisering (invasion) i værter.

Figure 4
Figur 4 : Immunfarvning af Lm-inficeret HMEC-1 celler bosat på hydrogels af varierende stivhed til at differentiere bakteriel adhæsion versus invasion. Disse billeder viser et repræsentativt eksempel på differential immunfarvning viser A. cellekerner (DAPI), B. alle bakterier (normal god landbrugspraksis), og C. bakterier (Alexa-546). HMEC-1 celler var bosat på en blød 3-kPa hydrogel. Pilene peger på bakterier, som er blevet internaliseret, så er vist på den grønne kanal kun. Data i D-F henvises til N = 20 billeder taget til de inficerede HMEC-1 celler bosat på bløde 3-kPa og stiv 70-kPa hydrogels ogVis D. de samlede bakterier pr. kerner; E. internaliseret bakterier pr. kerner; og F. invasion effektivitet (forholdet mellem internaliseret bakterier for total bakterier). De vandrette bjælker skildrer de data nedrig. P-værdi blev beregnet med den ikke-parametrisk Wilcoxon rang summen test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. 30 min efter infektionen, vask HMEC-1 celler inficeret med JAT1045 (Lm, der constitutively udtrykker grøn fluorescerende proteiner (NGL)) 4 x med medier.
  2. Efter den fjerde vask, Bland 1 µL af 1 mg/mL Hoechst farvning med 1 mL af MCDB-131 fuld medier og tilføje det til hver brønd pletten cellernes kerner. Placer cellerne i vævskultur inkubator i 10 min.
  3. Vaske cellerne 1 x med PBS. Fastgør dem med en ikke-permeabilizing fixativ for differential immunfarvning for 20 min. ved stuetemperatur28.
    Bemærk: Fiksativ indeholder 0.32 M saccharose, 10 mM MES pH 6.1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl2, 2 mM EGTA, og 4% formaldehyd (elektronmikroskopi grade).
  4. Vaske cellerne 1 x med PBS. Blokere prøver for 30 min med 5% bovint serumalbumin (Se Tabel af materialer) i PBS.
  5. Inkuber prøver for 1 h med en anti-Lmprimære antistof (Se Tabel af materialer) fortyndes 1: 100 i PBS, som indeholder 2% BSA.
  6. Vask prøverne i PBS 3 x og derefter inkuberes dem i 1 h med en AlexaFluor-546 gede-anti-kanin sekundær antistof (Se Tabel af materialer) fortyndet 1:250 i PBS, som indeholder 2% BSA. Vaske prøver 3 x i PBS. Opbevare prøverne i 1 mL PBS for billeddannelse.
  7. Billede og analysere mere end 1.000 celler pr. betingelse.
    1. Imaging, at bruge et omvendt epifluorescensmikroskop med en CCD kamera (Se Tabel af materialer) og en 40 X luft plan fluorit luft mål med 0,6 numerisk blænde (NA).
      Bemærk: Strømmen er indstillet til 25% og eksponeringstiden til 100 ms. mikroskop filtre anvendes til mCherry er 470/525 nm, for normal god landbrugspraksis 530/645 nm og for DAPI 395/460 nm, for excitations- og henholdsvis. Mikroskopet vi brugte var kontrolleret af en open source microscopy software pakke29.
    2. Differential immunfarvning, tælle alle 'grønne' bakterier forbundet med individuelle celler som vedhængende. Tælle bakterier, der er 'grøn' og 'røde' (på grund af antistof bindende) som ikke-internaliseret.
      Bemærk: Vi identificeret kerner antallet ved at køre en custom-made script og CellC software (Se Tabel af materialer) til tælling af bakterier30.

6. multi-godt trækkraft Force mikroskopi og éncellelag Stress mikroskopi

Figure 5
Figur 5: Lm-inficeret HMEC-1 celler mindsker trækkraft styrker de lægge på deres ECM under infektion. Panel A viser billedet fase B viser feltet deformation, C viser trækkraft stress felt, og D viser intracellulære spændinger inden for de ikke-inficerede HMEC-1 celler opholder sig på en 20-kPa hydrogel. Farvelinjer af deformationen kort (µm), af trækkraften stress kort (Pa), og af de intracellulære spænding maps (nNµm-1) er vist på den øverste del af de varme kort. Kolonnerne viser tre repræsentative tidspunkter: 3, 8 og 18 h efter infektionen. E-H. Samme som paneler A-D , men for celler inficeret med Lm på en MOI 300. Billeder af bakterier (røde kanal) er overlejret på fase billeder af celler. TFM optagelser blev udført af imaging flere brønde samtidigt. Vinduesstørrelsen for PIV var 32 pixel med en overlapning af 16. Skalalinjen er 32 µm. Dette tal er blevet ændret fra Bastounis og Theriot59. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Forberede PA hydrogels på en 24-godt plade (Se trin 1). Frø HMEC-1 celler (Se trin 2) og inficere dem med JAT983 som beskrevet ovenfor (Se trin 3).
  2. Forberede et live-mikroskopi medie ved at supplere Leibovitz's L-15 med 10% føtal bovint serum, 10 ng/mL for epidermal vækstfaktor og 1 μg/mL hydrocortison.
    Bemærk: L-15 allerede indeholder 2 mM L-glutamin, så det ikke er nødvendigt at tilføje ekstra som i tilfælde af MCDB-131 medier.
  3. 4 h efter infektionen (når den internaliseret JAT983 starter fluorescerende), Bland 1 μL af 1 mg/mL Hoechst farvning med 1 mL af L-15 fuld medier og tilføje det til hver brønd pletten cellernes kerner. Placere cellerne i vævskultur inkubator i 10 min og derefter erstatte i hver brønd L-15 fuld medier med 1 mL af L-15 fuld media suppleret med 20 µg/mL af gentamicin.
  4. Cover plade med dens låg og læg det i et mikroskop miljømæssige kammer (Se Tabel af materialer) ekvilibreres til 37 ˚C.
    Bemærk: For billedbehandling, bruge en inverteret epifluorescensmikroskop med en CCD kamera (Se Tabel af materialer) og en 40 X luft plan fluorit luft mål med 0,6 NA.
  5. Erhverve multi-kanal time-lapse billeder af de fluorescerende perler og fluorescerende bakterier og fase kontrast billeder af værtsceller, hver 10 min for 4-12 h.
    Bemærk: For billedbehandling, magt blev sat til 25% og eksponeringstiden til 100 ms. mikroskop filtre (excitation/emission) bruges til mCherry og normal god landbrugspraksis er 470/525 nm og 530/645 nm henholdsvis.
  6. I slutningen af optagelsen, skal du tilføje 500 µL af 10% natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS) i vand i hver af brøndene.
    Bemærk: Cellerne vil være løsrevet fra hydrogel og hydrogel vil vende tilbage til sin oprindelige udeformerede tilstand, da det er elastisk.
  7. Tage et billede af hydrogel og bruge det som udeformerede referenceafbildning.
  8. Bestemme den todimensionale deformation af hydrogel i hvert øjeblik af tid ved hjælp af partikel billede Velocimetri (PIV)31, sammenligne hvert billede af time-lapse serien med reference billede af den udeformerede hydrogel. Brug de relevante vinduesstørrelser og overlapper afhængigt af eksperimentet.
    Bemærk: Vi brugte windows 32 pixel med en overlapning af 16 pixels.
  9. Beregne 2D trækkraft understreger, at celler udøve på hydrogel som beskrevet andetsteds32,33.
  10. Beregn éncellelag spændingen fra trækkraft understreger som tidligere beskrevet34 ved at løse ligninger af mekanisk ligevægt for en tynd elastisk plade under reaktionsstyrker lavet af PA hydrogel på éncellelag, som er af en overfor tegn til de målte trækkraft belastninger.
    Bemærk: Se supplerende materiale 1.

7. kvantitative Time-lapse mikroskopi til at vurdere Extracellular-matrix-stivhed afhængig af L. monocytogenes formidling gennem Endothelial Cells

Figure 6
Figur 6: Time-lapse kvantitative mikroskopi data af Lm formidling gennem HMEC-1 encellelag seedede på substrater med 3-kPa og 70 kPa stivhed. A. dette panel viser stadig billeder fra to repræsentative infektion foci på 0, 200, 400 og 600 min. Fase kanal skildrer HMEC-1 celle encellelag, og den røde kanal skildrer intracellulære Lm (Se trin 7 i protokollen). B. Dette panel viser området af den konvekse skrog omfatter infektion fokus afbildet som en funktion af tiden. Fokusområde 3-kPa tilstand (rød), vokser hurtigere end 70-kPa (grøn). C. dette panel viser den radiale afstand fra centrum til kanten af infektion fokus afbildet som en funktion af tid for repræsentant infektion foci vokser i HMEC-1 encellelag seedede på PA substrater af 3-kPa (rød) og 70-kPa (grøn) stivhed. Den radiale hastighed (dr/dt) er konstant for 3-kPa tilstand, men bifasisk for 70 kPa tilstand. D. disse data viser den radiale hastighed for de første 200 min af 10 uafhængige infektion foci. Rød (3-kPa) og grønt (70-kPa) datapunkter skildrer skråninger af de to foci beskrevet i de foregående paneler. De vandrette bjælker skildrer de data nedrig. P-værdi blev beregnet med den ikke-parametrisk Wilcoxon rang summen test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Forberede PA hydrogels på en 24-godt plade (Se trin 1), frø HMEC-1 celler (Se trin 2), og vokse overnight JAT983 kulturer, som beskrevet ovenfor (Se trin 3).
  2. Dagen for infektion, forberede infektion mix ved at blande 10 µL af bakteriel pellet pr. mL af MCDB-131 fuld medier. Forsigtigt fjerne medier fra wells af 24-godt plader, og tilføje 1,9 mL af MCDB-131 fuld medier og 0,1 mL af den bakterielle mix til hver brønd.
    Bemærk: De lavere MOI bruges i denne analyse er nødvendigt at analysere formidling begivenheder, der starter fra en enkelt bakterie invaderer en vært celle.
  3. Dække pladen med låg og forsegle det med en plastic wrap til at undgå udsivning. Læg pladerne i centrifugen og spin prøver i 10 min ved 200 x g at synkronisere invasionen.
  4. Flytte pladerne i vævskultur inkubator og Inkuber dem i 5 min.
  5. Vaske prøver 4 x med medier og flytte dem til vævskultur inkubator. Efter en yderligere 5-7 min, erstatte medierne med media suppleret med 20 µg/mL af gentamicin.
  6. Inkuber plade i inkubator for en ekstra 5 h for at tillade actA initiativtageren til at tænde og køre udtryk for mTagRFP åben læsning frame35.
  7. Forberede et live-mikroskopi medie ved at supplere Leibovitz's L-15 med 10% føtal bovint serum, 10 ng/mL for epidermal vækstfaktor og 1 µg/mL hydrocortison.
    Bemærk: L-15 allerede indeholder 2 mM L-glutamin, så det ikke er nødvendigt at tilføje ekstra som i tilfælde af MCDB-131 medier.
  8. Mix 1 μL af 1 mg/mL Hoechst farvning med 1 mL af L-15 fuld medier og tilføje det til hver brønd pletten cellernes kerner. Placere cellerne i vævskultur inkubator i 10 min og derefter erstatte i hver brønd L-15 fuld medier med 1 mL af L-15 fuld media suppleret med 20 µg/mL af gentamicin. Cover plade med dens låg og læg det i et mikroskop miljømæssige kammer (Se Tabel af materialer) ekvilibreres til 37 ˚C.
    Bemærk: For billeddannelse, en inverteret epifluorescensmikroskop blev brugt med en CCD kamera (Se Tabel af materialer) og en 20 X luft plan fluorit luft mål med 0,75 NA. Styrken blev sat til 50% og eksponeringstiden til 50 ms. mikroskop filtre anvendes til mCherry er 470/525 nm for excitations- og henholdsvis.
  9. Billede flere positioner hvert 5 min ved hjælp af en autofokus-funktionen til at overvåge, hvordan Lm spredes gennem HMEC-1 encellelag seedede på varierende stivhed hydrogels.
    Bemærk: Bufferlagres, L-15 med HEPES, så det ikke er nødvendigt at bruge CO2 under billeddannelse.

Representative Results

ECM stivhed-afhængige modtagelighed af HMEC-1 celler til Lm infektion:
PA hydrogels af varierende stivhed, alle overflade-belagt med kollagen jeg, blev bygget på flere godt glas bundplade, som beskrevet i trin 1 i protokollen (Se figur 1). AFM målinger blev udført for at bekræfte den nøjagtige stivhed af hydrogels, som tidligere beskrevet26,27 (Se figur 2). Tidligere undersøgelser har vist, at den lokale overholdelse af basalmembranen i endothelial celler kan variere fra 1 kPa (fx, hjernevæv) til 70 kPa (fx, aorta)36,37,38, 39 , 40. Derfor valgte vi at teste infektion af HMEC-1 celler bosat på matricer med følgende stivhed: 0,6 kPa, 3 kPa, 20 kPa og 70 kPa. For hver hydrogel stivhed, blev seks hydrogels fabrikeret for at vurdere reproducerbarhed af resultaterne.

Flowcytometri blev brugt til at vurdere den ECM stivhed-afhængige modtagelighed af HMEC-1 celler til Lm infektion (Se figur 3). HMEC-1 celler var smittet med en Lm stamme (JAT985), der udtrykker en fluorescerende markør efter internalisering (actAp::mTagRFP), giver mulighed for påvisning af intracellulære bakterier kun (Se figur 1 L - 1N). JAT985 mangler også ActA, forhindrede bakterier i at sprede sig fra celle til celle, da ActA er nødvendigt for dannelsen af actin komet haler og efterfølgende bakteriel formidling. 7 - 8 h efter infektionen, HMEC-1 celler infektion blev vurderet ved hjælp af flowcytometri. For at sikre, at analysen af enkelt celler, hovedparten af fordelingen af celletal var gated bruger frem versus side scatter plot, og derefter en anden gating skridt blev udført for at udelukke celler, der udviser autofluorescence (Se tal 3A - 3 C ). De foreløbige resultater, der er afbildet i figur 3 viser, at HMEC-1 infektion med Lm ca to gange større for HMEC-1 celler bosiddende på de stive 70 kPa hydrogels i forhold til cellerne bosiddende på de bløde 0,6 kPa hydrogels (Se tal 3B - 3D). øget Lm infektion modtagelighed af HMEC-1 celler bosat på stive i forhold til bløde matricer kunne være grund til: 1. øget Lm vedhæftning på HMEC-1; 2. øget Lm invasion i HMEC-1; eller 3. begge de ovenstående Co-forekommende. For at teste hvilken hypotese holder, HMEC-1 celler var seedet på soft (3 kPa) og stiv (70 kPa) hydrogels og inficeret med constitutively normal god landbrugspraksis udtrykker Lm (Se tal 4A - 4 C). Prøverne blev fastsat kort efter infektion og de eksterne (vedhængende) bakterier blev plettet af antistoffer. Ved hjælp af kvantitative mikroskopi, fandt vi, at der er betydeligt flere bakterier tilslutte sig HMEC-1, når værtsceller opholde sig på stive i forhold til blød gel (Se figur 4D). Overensstemmelse med flow flowcytometri data, der er betydeligt flere bakterier internaliseret af HMEC-1, når værtsceller opholde sig på stive i forhold til blød gel (Se figur 4E). Dog invasion effektivitet (bakterier internaliseret/samlet antal bakterier) af Lm til HMEC-1 celler er den samme, uanset substrat stivhed (Se figur 4F).

Trækkraft force mikroskopi af Lm-inficeret HMEC-1 celler:
LM infektion af HMEC-1 celler kunne ændre biomekanik af inficerede værtsceller, herunder styrken af tilknytning til deres ECM eller til hinanden, påvirker deres barriere integritet. Vi forsøgte at vurdere, om det kunne være tilfældet ved hjælp af trækkraft Force mikroskopi32 til at beregne de celle-ECM trækkraft styrker og éncellelag Stress mikroskopi41 til at beregne de intracellulære tensional styrker. Figur 5 viser kort over deformation felt, trækkraft stress felt og intracellulære spændinger inden for HMEC-1 celler bosat på 20-kPa hydrogels på forskellige tidspunkter point efter infektionen. Tal 5A - 5 D refererer til ikke-inficerede kontrol HMEC-1 celler, mens tallene 5E - 5 H refererer til HMEC-1 celler inficeret med Lm på en mangfoldighed af infektion lig med 300 bakterier/celle. Dette indledende arbejde tyder på, at inficerede HMEC-1 celler reducere størrelsen af deres celle-ECM og intracellulære understreger i løbet af en infektion med Lm, der henviser til, at der ikke er observeret for ikke-inficerede kontrol celler.

ECM stivhed-afhængige Lm udbredelse på tværs af HMEC-1 encellelag:
Time-lapse mikroskopi blev brugt til at undersøge effekten matrix stivhed har på Lm formidling gennem HMEC-1 monolag. Da Lm spredes gennem éncellelag, skabe bakterier fokus på infektion, der vokser som funktion af tiden (Se figur 6A og Video tallene 1 og 2). Området af infektion fokus blev målt ved at tegne en konvekse skrog, den mindste konvekst polygon, der omfatter et sæt punkter, omkring bakterier42. Der er ingen standard metrisk i feltet for at måle effektiviteten af L. monocytogenes celle til celle spredning gennem en éncellelag af værtsceller. For at vurdere spredningen effektivitet, nogle har optalt antal værtsceller i en infektion fokus41, og andre har trukket grænserne manuelt omkring gruppen af infektion vært celler43. Vi har valgt at tegne et konvekst polygon omkring bakterier, fordi det er en automatiseret, konsekvent og beregningsmæssigt billig proces til at måle effektiviteten af L. monocytogenes spredning. Dermed, fandt vi en mindre nedgang i infektion fokusområde i HMEC-1 celler seedede på 70 kPa hydrogels sammenlignet med dem seedede på 3 kPa matricer (Se figur 6B og Video tallene 1 og 2). For at bestemme væksten af infektion fokus, var den radiale afstand afbildet som en funktion af tid ved at tage kvadratroden af området i infektion fokus og dividere det med pi. Denne matematiske transformation forudsætter, at formen af infektion fokus er nogenlunde cirkulær44. For at måle hastigheden af fokus vækst, blev antallet af ændring (dvs., skrænten) af den radiale afstand til både 3 og 70 kPa matricer målt. Denne tilgang belyst, at infektion fokus voksede hurtigere og monoton i HMEC-1 celler seedede på 3-kPa matricer. Imidlertid voksede fokus betydeligt langsommere (første 200 min.) og lidt langsommere (200 til 600 min) i celler seedede på 70 kPa matricer (Se figur 6C). Faktisk analyse af yderligere data bekræftede, at infektion fokus voksede, i gennemsnit to gange langsommere i 70-kPa matricer, især i de første 200 min. (Se figur 6D).

Figure 3
Figur 3 : ECM stivhed-afhængige modtagelighed af HMEC-1 celler til Lm invasion målt ved hjælp af flowcytometri .  HMEC-1 celler blev smittet med Lm (JAT985) og infektion blev analyseret ved flowcytometri. A. Dette panel viser en side versus forward scatter plot for repræsentative HMEC-1 celler kommer fra en enkelt brønd. Bulk fordelingen af celler blev udvalgt via gating for at udelukke vragrester (venstre) og celle dubletter eller trillinger (til højre). B. denne graf viser et histogram over logaritmen af Lm fluorescens intensitet pr. celle for HMEC-1 forgyldt på bløde 0,6 kPa. C. denne graf viser et histogram over logaritmen af Lm fluorescens intensitet pr. celle til HMEC-1 forgyldt på stiv 70 kPa hydrogels. Histogrammer for N = 4-6 gentagelser er vist i forskellige farver. Kontrol inficerede celler histogrammet er lilla. Porten bruges til at definere, hvad er inficeret er vist med rødt. MOI er 100 og infektionen var vurderet 8 h efter infektionen. D. Data viser procentdelen af inficerede celler, HMEC-1 versus hydrogel stivhed (N = 5). De vandrette bjælker skildrer de data nedrig. P-værdi blev beregnet med den ikke-parametrisk Wilcoxon rang summen test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video Figure 1
Video figur 1: formidling af intracellulære Lm (røde kanal) gennem en HMEC-1 cell éncellelag (fase) seedede på en 3-kPa substrat. Cellerne blev afbildet i Leibovitz's L-15 medier (10% FBS, 20 µg/mL af gentamicin) indeni en miljømæssig kammer ekvilibreres til 37 ˚C. Billederne blev indsamlet hvert 5 min. Film hastighed er 15 frames/s. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video Figure 2
Video figur 2: spredning af intracellulære Lm (røde kanal) gennem en HMEC-1 cell éncellelag (fase) seedede på 70 kPa substrat. Cellerne blev afbildet i Leibovitz's L-15 medier (10% FBS, 20 µg/mL af gentamicin) indeni en miljømæssig kammer ekvilibreres til 37 ° C. Billederne blev indsamlet hvert 5 min. Film hastighed er 15 frames/s. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Young's modulus (E, kPa) Acrylamid % (fra 40% stock) Bisacrylamide % (fra 2% stock)
0,6 3 0,045
3 5 0.075
10 10 0.075
20 8 0.195
70 10 0,45

Tabel 1. Sammensætning af polyacrylamid (PA) hydrogels af varierende stivhed. i denne tabel, procentdel af stock 40% acrylamid løsning og procentdelen af lager 2% bis-acrylamid løsning til at opnå en given stivhed (Youngs modulus, E) er angivet i forskellige kolonner.

Supplemental Material
Supplerende materiale 1. Beregning af intracellulære spændinger fra beregnede trækkraft understreger. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Celler kan fornemme en række fysiske miljømæssige stikord, som kan påvirke cellernes morfologi, men også deres gen udtryk og protein aktivitet, hvilket påvirker afgørende celle funktioner og adfærd,45,46. Stivhed af ECM celler er i stigende grad værdsat som et vigtigt modulator af cellulære motilitet, differentiering, spredning og i sidste ende celle skæbne47,48,49. Selv om der har været mange de seneste fremskridt i forståelsen af komplekse biomekaniske interaktion mellem celler og deres ECM, er lidt kendt om hvordan miljømæssige stivhed påvirker modtagelighed af celler til bakteriel infektion. For at lette sådanne undersøgelser, udviklet vi denne nye multi godt analyse baseret på den veletablerede fabrikation af polyacrylamid hydrogels afstemmelige stivhed, som er kompatibel med infektion assays50. Traditionelt, er en bakteriel infektion af celler i vævskultur blevet undersøgt på glas eller polystyren overflader, der er ca 1-3 størrelsesordener stivere end de naturlige ECM mest vedhængende celler8,51. Analysen beskrives her åbner nye motorveje ved at aktivere studiet af bakterier-værtssammenspil i en fysiologisk relevante miljømæssige stivhed regime.

Til bevis for begrebet præsenteres analysen blev HMEC-1 celler valgt som model vedhængende værtsceller og Lm som en model bakteriel patogen. Analysen kan dog forlænges for yderligere undersøgelser, hvis passende modificeret. Sådanne undersøgelser kan omfatte infektion af forskellige pattedyr vedhængende vært celletyper af yderligere patogener, herunder bakterier og vira. For denne særlige assay, gels var protein-coated med kollagen jeg, men afhængigt af værten celletype, er det muligt at bruge en anden ECM protein-belægning, såsom laminin eller fibronektin, at lette udlæg i værtsceller af interesse på hydrogel 52. en yderligere overvejelse, der afhænger af værten celletype er rækken hydrogel stivhed skal undersøges. Rækken af stivhed bør afhænge af hvad er fysiologisk relevante for den specifikke vært celletype og hvor godt at vært lægger danner en éncellelag på en given stivhed hydrogel. Ligeledes, afhængigt af model patogenet ønskede at blive undersøgt, mindre ændringer muligvis skal gennemføres på infektion analysen beskrevet heri.

Innovation af analysen i forhold til tidligere metoder til fremstilling polyacrylamid hydrogels24,50,53 ligger i visse unikke funktioner integreret i den foreslåede infektion assay. Først, hydrogels er bygget på flere godt glas bundplade, som gør det muligt for screening af flere betingelser samtidig samt automatisering af visse procedurer. Overvåger flere betingelser på samme tid eller undersøge flere gentagelser er afgørende, da resultatet af en sådan fremgangsmåde kan være påvirket af faktorer såsom vært celle passage og den præcise antal bakterier tilføjet for at inficere værter, som ofte ændre mellem uafhængige forsøg. En ekstra unik funktion af denne analyse er, at hydrogels har en højde på cirka 40 µm, som er tynd nok til at billedet ved hjælp af konventionelle mikroskopi. Vi viste, at vi med succes kan udføre både levende celle mikroskopi og celle fiksering og immunfarvning efterfulgt af imaging, uden at indføre høje baggrund fluorescens. Endelig, hydrogels er fremstillet af to lag, med den øverste have indlejret fluorescerende microbeads, indespærret i en enkelt fokalplan. Denne attribut sikrer, at der vil være nogen out-of-fokus lys indblanding under imaging. Tilstedeværelsen af perlerne kan både gennemgangen af den overflade topografi af gel til at sikre, at de er ensartede og forbedrer ydeevnen af TFM og MSM24,32,41. Med TFM og MSM er det muligt at beregne de celle-ECM og cell-celle kræfter henholdsvis celler bosat på varierende stivhed matricer. Med denne roman assay, er det muligt at foretage sådanne målinger af fysiske kræfter ved at sammenligne både bidrag af miljømæssige stivhed og infektion samtidigt. Efter en sådan fremgangsmåde har virkning infektion på vært celle mekanik i hele sit løb kan bestemmes. Desuden udviklingen af de intracellulære belastninger af celler kan beregnes ved hjælp af MSM og kan bruges som en foranstaltning af barriere integriteten af éncellelag. Endelig, da multi godt af analysen, det er muligt at samtidig indføre farmakologiske og genetiske forstyrrelser med en bakteriel infektion, at undersøge mere indgående komplekse samspillet mellem vært celle mekanik og infektion.

En iboende begrænsning af teknikken, der ligger i effekt substrat stivhed kan have om spredning sats af celler. Typisk, i infektion assays, vi skal sikre, at host celle tæthed under forskellige betingelser er de samme. Det er fordi celle tæthed i sig selv kan have en effekt på modtagelighed af værter til infektion. HMEC-1 celler, der blev brugt som værtsceller viser ikke en signifikant forskel i deres antal, når frøet i 24 timer på hydrogels. Dog kan forskellige celletyper udviser differential spredning, afhængigt af hydrogel stivhed, der kan bias infektion undersøgelser. Ligeledes kan infektion bias opstår, når cellerne ikke danne encellelag eller Monter ikke godt på hydrogels, som opstår, når visse celletyper udsås på meget blød matricer (fx, menneskelige navlestrengen endotelceller eller Madin-Darby canine nyre epitelceller seedede på 0,6-kPa hydrogels54,55). Så vidt angår patogener visse bakterier (fx, Borrelia burdgorferi) kan vedhæfte på vært celler og invadere dem men kan også transmigrate gennem dem56. Vi har endnu ikke testet hvis dette assay ville arbejde for patogenet transmigration undersøgelser, men det synes muligt, da tidligere undersøgelser af neutrofiler transmigrating endotelceller seedede på PA hydrogels har dokumenteret for at arbejde med succes57. Der har været masser af undersøgelser viser hvordan man fremstiller polyacrylamid hydrogels af en bestemt Youngs modulus ved at blande de relevante koncentrationer af acrylamid og bis-acrylamid24,25,26 ,27. Især når man ønsker at udføre TFM eksperimenter på celler bosat på hydrogels af varierende stivhed, er det imidlertid afgørende at bekræfte den forventede stivhed af hydrogels enten gennem AFM eller andre indrykning teknikker58. Mindre afvigelser fra den forventede værdi kan opstå på grund af forskellige opløsningsmiddel anvendes eller en stamopløsning, hvis alderen acrylamid, eller af måder AFM målinger er udført (f.eks.figur af AFM tip). Endelig er tilgang præsenteres heri baseret på såning værtsceller på 2D matricer, som eventuelt kan afvige fra en mere realistisk og fysiologisk relevante 3D scenario. Men fremstiller 3D geler med afstemmelige stivhed, såning dem med værtsceller og derefter inficerer dem med patogener, stadig omfatter visse tekniske vanskeligheder. Ikke desto mindre forventer vi, at vi i den nærmeste fremtid vil være stand til at udvide den nuværende assay for at studere infektion i 3D omgivelser.

Sammenfattende beskrevet protokollen sammen med de foreløbige resultater fremlægge bevis at denne roman assay kan blive et ekstremt nyttigt værktøj til at studere infektion af vedhængende værtsceller med patogene bakterier i en kvantitativ mode og meget mere fysiologisk relevante miljø end tidligere undersøgt. Magt opdigte polyacrylamid hydrogels i den foreslåede setup ligger i, at analysen er kompatibel med udførelsen af flere teknikker såsom flowcytometri, immunfarvning efterfulgt af lysmikroskopi og trækkraft kraft mikroskopi. Analysen kan anvendes til undersøgelser der involverer infektion af forskellige vedhængende vært celletyper af patogener, som vi forventer vil have en betydelig indvirkning i både optrævler strategier som patogener inficere værter og lette udviklingen af terapeutiske indgreb mod infektioner.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vores tak til M. sidefod, R. Lamason, M. Rengaranjan og medlemmer af Theriot Lab for deres diskussioner og eksperimentel understøttelse. Dette arbejde blev støttet af NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Gilliam Fellowship for Advanced Study (F.E.O.), Stanford Graduate stipendium (F.E.O.) og American Heart Association (E.E.B.). Flowcytometri blev udført på Stanford delt FACS facilitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Sodium hydroxide pellets Fisher S318-500
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma A3648
25% gluteraldehyde Sigma G6257-100ML
40% Acrylamide Sigma A4058-100ML
Bis-acrylamide solution (2%w/v) Fisher Scientific BP1404-250
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) Invitrogen F8803
Ammonium Persulfate Fisher BP17925
TEMED Sigma T9281-25ML
Sulfo-SANPAH Proteochem c1111-100mg
Collagen, Type I Solution from rat Sigma C3867-1VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) J.T. Baker 9224-01
HEPES, Free acid J.T. Baker 4018-04
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red Thermofischer 21083027
MCDB 131 Medium, no glutamine Life technologies 10372019
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A Gemini Bio-Prod 900108 500ml
Epidermal Growth Factor, EGF Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0888
L-Glutamine 200mM Fisher SH3003401
DPBS 1X Fisher SH30028FS
Gentamicin sulfate MP biomedicals 194530
Cloramphenicol Sigma C0378-5G
DifcoTM Agar, Granulated BD 214530
BBL TM Brain-heart infusion BD 211059
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water Invitrogen H3570
Formaldehyde 16% EM grade Electron microscopy 15710-S
Anti-Listeria monocytogenes antibody Abcam ab35132
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate Thermofischer A-11035
0.25% trypsin-EDTA , phenol red Thermofischer 25200056
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC Sigma C8051
Streptomycin sulfate Fisher Scientific 3810-74-0
Sucrose Calbiochem 8510
Sodium dodecyl sulfate Thermofischer 28364
MES powder Sigma M3885
KCl J.T. Baker 3040-05
MgCl2 J.T. Baker 2444-1
EGTA Acros 40991
Disposable lab equipment
12 mm circular glass coverslips Fisherbrand 12-545-81 No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated
Glass bottom 24 well plates Mattek P24G-1.5-13-F
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap  Falcon 352235
T-25 flasks Falcon 353118
50 ml conical tubes Falcon 352070
15 ml conicals tubes Falcon 352196
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Falcon 357551
Pasteur Glass Pipettes VWR 14672-380
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Denville P1122, P1126
Powder Free Examination Gloves Microflex XC-310
Cuvettes bacteria Sarstedt 67.746
Razors VWR 55411-050
Syringe needle BD 305167
0.2um sterilizng bottles Thermo Scientific 566-0020
20 ml syringes BD 302830
0.2um filters Thermo Scientific 723-2520
wooden sticks Grainger 42181501
Saran wrap Santa Cruz Biotechnologies sc-3687
Plates bacteria Falcon 351029
Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood Baker SG504
Hemacytometer Sigma Z359629
Bacteria incubator Thermo Scientific IGS180
Tissue culture Incubator NuAire NU-8700
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope Nikon NIKON-DIAPHOT-200
Cage Incubator Haison Custom
Scanford FACScan analyzer  Stanford and Cytek upgraded FACScan Custom
Pipette Aid Drummond 4-000-110
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) Gilson F144802, F123601, F123602
pH meter Mettler Toledo 30019028
forceps FST 11000-12
1 L flask Fisherbrand FB5011000 
Autoclave machine Amsco 3021
Stir magnet plate Bellco 7760-06000
Magnet stirring bars Bellco 1975-00100
Spectrophotometer Beckman DU 640
Scanford FACScan analyzer Cytek Biosciences Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan
Software
Microscope Software (μManager) Open Imaging
Matlab Matlab Inc
Flowjo FlowJo, LLC
Automated image analysis software, CellC https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
  2. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: a dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  3. Trepat, X., Lenormand, G., Fredberg, J. J. Universality in cell mechanics. Soft Matter. 4 (9), 1750-1759 (2008).
  4. Maruthamuthu, V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Cell-ECM traction force modulates endogenous tension at cell-cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4708-4713 (2011).
  5. Fujiwara, I., Suetsugu, S., Uemura, S., Takenawa, T., Ishiwata, S. Visualization and force measurement of branching by Arp2/3 complex and N-WASP in actin filament. Biochemical and Biophysical Research Communications. 293, 1550-1555 (2002).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 97 (2-3), 163-179 (2008).
  7. LaValley, D. J., Zanotelli, M. R., Bordeleau, F., Wang, W., Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness enhances VEGFR-2 internalization, signaling, and proliferation in endothelial cells. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 044001 (2017).
  8. Mason, B. N., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness: a regulator of cellular behavior and tissue formation. Engineering Biomaterials for Regenerative Medicine: Novel Technologies for Clinical Applications. Bhatia, S. K. , Springer. New York, NY. 19-37 (2012).
  9. El-Mohri, H., Wu, Y., Mohanty, S., Ghosh, G. Impact of matrix stiffness on fibroblast function. Materials Science and Engineering: C. 74, Supplement C 146-151 (2017).
  10. Asano, S., et al. Matrix stiffness regulates migration of human lung fibroblasts. Physiological Reports. 5 (9), (2017).
  11. Burgess, J. K., Mauad, T., Tjin, G., Karlsson, J. C., Westergren-Thorsson, G. The extracellular matrix: the under-recognized element in lung disease. The Journal of Pathology. 240 (4), 397-409 (2016).
  12. Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
  13. Jackson, K. A., Iwamoto, M., Swerdlow, D. Pregnancy-associated listeriosis. Epidemiology and Infection. 138 (10), 1503-1509 (2010).
  14. Theriot, J., Rengarajan, M. Exploitation of host cell processes for bacterial cell-to-cell spread. The FASEB Journal. 28, 1 Supplement (2014).
  15. Pollard, T. D., Beltzner, C. C. Structure and function of the Arp2/3 complex. Current Opinion in Structural Biology. 12 (6), 768-774 (2002).
  16. Pollard, T. D. Cellular motility powered by actin filament assembly and disassembly. Harvey Lectures. 98, 1-17 (2002).
  17. Reed, S. C., Lamason, R. L., Risca, V. I., Abernathy, E., Welch, M. D. Rickettsia actin-based motility occurs in distinct phases mediated by different actin nucleators. Current Biology. 24 (1), 98-103 (2014).
  18. Gerbal, F., Chaikin, P., Rabin, Y., Prost, J. An elastic analysis of Listeria monocytogenes propulsion. Biophysical Journal. 79 (5), 2259-2275 (2000).
  19. Weber, I. Is there a pilot in a pseudopod. European Journal of Cell Biology. 85 (9-10), 915-924 (2006).
  20. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76 (3), 505-517 (1994).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
  22. Rengarajan, M., Hayer, A., Theriot, J. A. Endothelial cells use a formin-dependent phagocytosis-like process to internalize the bacterium Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005603 (2016).
  23. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11 (10), 1212-1218 (2009).
  24. Bastounis, E., et al. Both contractile axial and lateral traction force dynamics drive amoeboid cell motility. The Journal of Cell Biology. 204 (6), 1045-1061 (2014).
  25. Georges, P., Miller, W., Meaney, D., Sawyer, E., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  26. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
  27. Engler, A., Bacakova, L., Newman, C., Hategan, A., Griffin, M., Discher, D. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  28. Yam, P. T., Theriot, J. A. Repeated cycles of rapid actin assembly and disassembly on epithelial cell phagosomes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5647-5658 (2004).
  29. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
  30. Selinummi, J., Seppala, J., Yli-Harja, O., Puhakka, J. A. Software for quantification of labeled bacteria from digital microscope images by automated image analysis. BioTechniques. 39 (6), 859-863 (2005).
  31. Gui, L., Wereley, S. T. A correlation-based continuous window-shift technique to reduce the peak-locking effect in digital PIV image evaluation. Experimental Fluids. 32, 506-517 (2002).
  32. del Alamo, J. C., et al. Spatio-temporal analysis of eukaryotic cell motility by improved force cytometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13343-13348 (2007).
  33. Hur, S. S., et al. Roles of cell confluency and fluid shear in 3-dimensional intracellular forces in endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11110-11115 (2012).
  34. Banerjee, I., et al. Cyclic stretch of embryonic cardiomyocytes increases proliferation, growth, and expression while repressing Tgf-β signaling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 79, 133-144 (2015).
  35. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 7 (3), 1002005 (2011).
  36. Wood, J. A., Liliensiek, S. J., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 3 (3), 1620-1639 (2010).
  37. Kohn, J. C., Lampi, M. C., Reinhart-King, C. A. Age-related vascular stiffening: causes and consequences. Frontiers in Genetics. 6, 112 (2015).
  38. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  39. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
  40. Onken, M. D., Mooren, O. L., Mukherjee, S., Shahan, S. T., Li, J., Cooper, J. A. Endothelial monolayers and transendothelial migration depend on mechanical properties of the substrate. Cytoskeleton (Hoboken). 71 (12), 695-706 (2014).
  41. Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
  42. Wu, T. -C., Belteton, S., Pack, J., Szymanski, D. B., Umulis, D. LobeFinder: a convex hull-based method for quantitative boundary analyses of lobed plant cells. Plant Physiology. 171 (4), 2331-2342 (2016).
  43. Czuczman, M. A., et al. Listeria monocytogenes exploits efferocytosis to promote cell-to-cell spread. Nature. 509 (7499), 230-234 (2014).
  44. Liebhold, A. M., Tobin, P. C. Population ecology of insect invasions and their management. Annual Reviews in Entomology. 53, 387-408 (2008).
  45. Miller, C. J., Davidson, L. The interplay between cell signaling and mechanics in developmental processes. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 733-744 (2013).
  46. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), Cambridge, England. 1407-1420 (2010).
  47. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), 46889 (2012).
  48. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. 10 (44), 8829-8837 (2014).
  49. Tse, J., Engler, A. Stiffness gradients mimicking in vivo tissue variation regulate mesenchymal stem cell fate. PLoS ONE. 6 (1), 15978 (2011).
  50. Ananthakrishnan, R., Ehrlicher, A. The forces behind cell movement. International Journal of Biological Sciences. 3, 303-317 (2007).
  51. Kolahi, K. S., et al. Effect of substrate stiffness on early mouse embryo development. PLoS ONE. 7 (7), 41717 (2012).
  52. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  53. Kiener, H. P., Lee, D. M., Agarwal, S. K., Brenner, M. B. Cadherin-11 induces rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes to form lining layers in vitro. American Journal of Pathology. 168, 1486-1499 (2006).
  54. Kaliman, S., Jayachandran, C., Rehfeldt, F., Smith, A. -S. Novel growth regime of MDCK II model tissues on soft substrates. Biophysical Journal. 106 (7), 25-28 (2014).
  55. Saunders, R. L., Hammer, D. A. Assembly of human umbilical vein endothelial cells on compliant hydrogels. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 60-67 (2010).
  56. Wu, J., Weening, E. H., Faske, J. B., Hook, M., Skare, J. T. Invasion of eukaryotic cells by Borrelia burgdorferi requires β1 integrins and Src kinase activity. Infection and Immunity. 79 (3), 1338-4138 (2011).
  57. Stroka, K. M., Aranda-Espinoza, H. Endothelial cell substrate stiffness influences neutrophil transmigration via myosin light chain kinase-dependent cell contraction. Blood. 118 (6), 1632 (2011).
  58. Keer, L. M. Stress distribution at the edge of an equilibrium crack. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 12 (3), 149-163 (1964).
  59. Bastounis, E. E., Theriot, J. A. A highly quantitative multi-well format assay for studying the effect of extracellular matrix mechanics on the bacterial infection of endothelial cells. Athens Journal of Sciences. 4 (1), 7-20 (2017).

Tags

Immunologi og infektion sag 137 tilhænger pattedyrceller bakteriel infektion endotel flowcytometri trækkraft force mikroskopi polyacrylamid hydrogels immunfarvning substrat stivhed
En multi godt Format polyacrylamid-baseret analyse for at undersøge effekten af ekstracellulære Matrix stivhed på bakteriel infektion af vedhængende celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bastounis, E. E., Ortega, F. E.,… More

Bastounis, E. E., Ortega, F. E., Serrano, R., Theriot, J. A. A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells. J. Vis. Exp. (137), e57361, doi:10.3791/57361 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter