Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Несколько хорошо формат на основе полиакриламида Assay для изучения влияния внеклеточной матрицы жесткости на бактериальные инфекции адэрентных клеток

Published: July 5, 2018 doi: 10.3791/57361
Automatic Translation
1, 1, 2, 3
1Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California San Diego, 3Departments of Biochemistry, Microbiology and Immunology and Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine

Summary

Мы разработали несколько хорошо формат на основе полиакриламида assay для зондирования эффект внеклеточной матрицы жесткости на бактериальные инфекции адэрентных клеток. Этот assay совместим с проточной цитометрии, иммуноокрашивания и тяги силовой микроскопии, позволяя для количественных измерений биомеханических взаимодействия клеток, их внеклеточного матрикса и патогенных бактерий.

Abstract

Внеклеточные матрицы жесткости включает один из нескольких экологических механические раздражители, которые хорошо известны поведению клеток, функции и судьбу влияют в целом. Хотя все больше и больше типов адэрентных клеток ответов на матрицы жесткости характеризовались, как сторонник клеток восприимчивость к бактериальной инфекции зависит от матрицы жесткости во многом неизвестным, как действует бактериальной инфекции на Биомеханика клеток хозяина. Мы предполагаем, что подверженность эндотелиальных клеток хозяина бактериальной инфекции зависит от жесткости матрицы, на котором располагаются эти клетки, и что инфекция принимающей ячейки с бактериями изменит их биомеханики. Для тестирования этих двух гипотез, эндотелиальные клетки были использованы как модель хостов и Listeria monocytogenes как модель патогена. Развивая пробирного Роман несколькими хорошо формате, мы показываем, что эффект матрицы жесткости на инфекции эндотелиальных клеток л моноцитогенес может количественно оцениваться проточной цитометрии и иммуноокрашивания следуют микроскопии. Кроме того с помощью микроскопии силы тяги, эффект л моноцитогенес инфекции на хост биомеханики эндотелиальных клеток могут быть изучены. Предложенный метод позволяет для анализа влияния ткани соответствующих механики на бактериальной инфекции адэрентных клеток, который является важным шагом на пути к пониманию биомеханических взаимодействия между клетками, их внеклеточного матрикса, и патогенных бактерий. Этот метод также применим на широкий спектр других видов исследований клеток биомеханики и реагирования на субстрат жесткость, где важно иметь возможность выполнять многие реплицирует параллельно в каждом эксперименте.

Introduction

Клетки в большинства животных тканях обычно сторонником, придавая соседних клеток и их внеклеточного матрикса (ECM). Анкоридж клеток к их ECM имеет решающее значение для многих клеточных процессах, начиная от подвижности ячейки в ячейку для распространения и выживания1,2. Клеточных креплений для ECM зависит от состава ECM и жесткость. Клетки реагируют на изменения в последнем устраивая динамически повторного их цитоскелета, клетки ECM и ячеек спайки, которые в свою очередь критически изменить ячейку биомеханики и функции3,4,5,6 . ECM жесткость может варьироваться в пространстве (т.е., анатомическое расположение), время (то есть, старение) и патофизиологических процессов (например, атеросклероз, рак, инфекции, и т.п.). Например, общепризнано, что эндотелиальных клеток, расположенных на жестче-по сравнению с мягче матрицы оказывают увеличение силы их ECM и друг к другу и демонстрируют увеличение подвижности и распространения7,8. Аналогичным образом фибробласты, проживающих на жестче матрицы распространять высокие сократительной силы для их ECM и показать увеличение распространения, моторики и ECM производство9,10,11. Хотя клеток механики и ответ на ECM жесткость широко изучены для различных типов клеток, отношения между приверженцами принимающей ячейки, жесткость их ECM и бактериальных инфекций по-прежнему во многом неизвестным.

Для изучения роли ECM жесткость в взаимодействия клеток бактерий хост, моноцитогенес л (Lm) был выбран в качестве модели возбудителя. LM является вездесущий пищевого бактерия, которая может привести к системной инфекции в широкий спектр млекопитающих хостов. Эта факультативная внутриклеточных патогенов может перейти от кишечного эпителия в отдаленные органы путем обхода различных типов сосудистых endothelia. Если он нарушит blood - brain барьер, Lm может вызвать менингит, и когда он проникает через плаценту, это может вызвать самопроизвольный аборт12,13. LM могут заразить различных принимающих типы клеток и может сделать это с помощью различных патогенных стратегий. LM инфекции была изучена главным образом в контексте эпителиальных клеток, в то время как гораздо меньше известно о как Lm могут заразить и обход эндотелиальных клеток, выстилающих просвета кровеносных сосудов14,,1516. Кроме того во многом по-прежнему неизвестно, как жесткость ECM, где проживают эндотелиальных клеток модулирует Lm в способности вторгнуться в эти клетки хозяина и затем распространить. LM и несколько дополнительных видов бактериальных (т.е., риккетсии parkeri) воспользоваться Цитоскелет актина хозяина клетки, они заражают как вторгнуться в их цитоплазме и облегчить распространение к ячейке17 , 18 , 19. они достичь этого через экспрессию белков, которые позволяют им вмешиваться с принимающей актина полимеризации пути и производить хвостов кометы актина, облегчить их вперед тяги16,20. В результате инфекции клетки-хозяина Цитоскелет актина необходимо динамически изменить таким образом, который характеризуется все еще не в полной мере, потенциально затрагивающих биомеханики клеток хозяина, включая физические силы, которую они оказывают на их ECM и на каждом другие. Для изучения этих процессов, человека микрососудистой эндотелиальных клеток (HMEC-1) были выбраны в качестве модели клетки хозяина по трем причинам: 1. эндотелиальные клетки, как известно, быть очень mechanosensitive как они постоянно подвергаются воздействию различных физических сигналы21; 2 стратегии, Lm использует заразить эндотелиальные клетки все еще малоизвестная22; и 3. HMEC-1 являются увековечен клеточной линии и таким образом, легко выращиваются и подвергнуты генетической манипуляции.

Бактериальные инфекции клеток хозяина основном был учился в пробирке путем заполнения ячеек на стекло или полистирольных субстратов, которые значительно жестче, чем физиологических ECM большинства клеток12,14,23. Для изучения инфекции клеток посеян на матрицу, чьи жесткость физиологически соответствующих и прояснения роли ECM жесткость на инфекцию клеток от бактериальных патогенов, мы последовали за новаторский подход, основанный на изготовление тонких microbead встроенный Полиакриламидные гидрогели перестраиваемый жесткости на нескольких хорошо пластины. Новизна предлагаемого подхода заключается в том, что он позволяет контролировать несколько условий одновременно за несколькими хорошо формате, и в том, что он совместим с несколькими методами из-за определенным образом, строятся субстратов. HMEC-1 клетки были посеяны на этих белков покрытием гидрогелей и затем инфицированных различными Lm штаммов, которые становятся флуоресцентные по интернализации или конститутивно флуоресцентные. Роль ECM жесткость на подверженность инфекции клеток хозяина HMEC-1 был оценен проточной цитометрии. Кроме того иммуноокрашивания и флуоресцентной микроскопии были использованы для различения присоединившихся и интернализированных бактерий. Наконец тяговой силы микроскопии (TFM) была успешно проведена охарактеризовать воздействие Lm инфекции на тяговых подчеркивает, что эндотелиальных клеток хозяина оказывают на их матрицы во время инфекции. Представленные assay могут быть легко изменены для включения дальнейших исследований о влиянии ECM жесткость на инфекции, чувствительности возбудителя адэрентных клеток с использованием различных клеточных линий или патогенов.

Protocol

1. производство гидрогели тонкий двухслойный полиакриламид (PA) на нескольких хорошо пластины

  1. Персульфат аммония (APS) растворяют в дистиллированной воде сверхчистого для достижения конечной концентрации 10 г/мл. Алиготе и магазин раствор при температуре 4 ° C для кратковременного использования (3 недели).
    Примечание: Приведенные выше решения могут быть подготовлены до начала изготовления гидрогеля.
  2. Активация стекла 24-ну блюд
    1. Инкубируйте 24-ну стекло нижней пластины с 13 мм диаметр скважины (см. Таблицу материалы) за 1 час с 500 мкл 2 M NaOH в хорошо при комнатной температуре.
    2. Промыть лунки 1 x с ультрачистая вода и затем добавить 500 мкл triethoxysilane 2% (3-аминопропил) (см. Таблицу материалы) в 95% этаноле каждому хорошо за 5 мин.
    3. Промыть лунки 1 x снова с водой и добавить 500 мкл глютаральдегид 0,5% в каждой скважине на 30 минут Промыть лунки 1 x с водой и высушить их на 60 градусов с крышкой.

Figure 1
Рисунок 1 : Бактериальные инфекции пробирного клеток хозяина, проживающих на тонкий двухслойный флуоресцентные бывшего в шарик встроенный полиакриламид (PA) гидрогели различной жесткости. A. стеклянные coverslips химически изменена включить гидрогеля вложений. Б. 3.6 мкл ПА смесей осаждаются на дно стекла. C. смесь покрыта coverslip круглые стекло 12 мм для включения полимеризации. Д. coverslip удаляется с иглой шприца. Е. 2.4 мкл раствора ПА с микрошарики добавляется поверх нижнего слоя и ограничен с круговой стекла coverslip. Ф. буфер добавляется в колодец и coverslip удаляется. Г. УФ-облучения за 1 ч обеспечивает стерилизации. Ч. сульфогруппу-SANPAH-содержащих решение добавляется на гели, которые затем помещаются под УФ на 10 минут, я. Гидрогели промывают с буфером и затем инкубированы всю ночь с коллагеном I. J. Гидрогель является достижение равновесного уровня с ячейки СМИ. K. посеян клетки хозяина. L. LM бактерии добавляются в решение, и инфекция синхронизируется через центрифугирования. М. 1 час после инфекции бактерий в решении смываются и СМИ, дополнена антибиотик добавляется. Н. В 4 ч после инфекции, ЛМ (JAT985) начинает флуоресцирующих. О. HMEC-1 клетки отсоединяются от их матрицы и решения передаются трубы для выполнения цитометрии расходометрии. Обратите внимание, что дни и приблизительное время для каждого этапа анализа также указаны. Этот рисунок был изменен с Bastounis и Териот59. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Изготовление гидрогеля полиакриламида
    : Примечание рис. 1.
    1. Подготовить водные растворы, содержащие 3-10% 40% акций акриламида раствор (см. Таблицу материалы) и 0,06 - 0,6% от 2% запасов бис акриламида раствор (см. Таблицу материалов) для производства гидрогели перестраиваемый жесткость, начиная от 0,6 кПа до 70 кПа. Приведены в таблице 1.
      1. Для 0,6 кПа гидрогели Смешайте 3% акриламида с 0,045% бис акриламида. Для 3 кПа гидрогели смесь 5% акриламида с 0,074% бис акриламида. Для 10 кПа гидрогели Смешайте 10% акриламида с 0,075% бис акриламида. Для 20 кПа гидрогели смесь 8% акриламида с 0.195% бис акриламида. Для 70 кПа гидрогели Смешайте 10% акриламида с 0,45% бис акриламида.
        Примечание: Более подробная информация о достижении желательных жесткость гидрогеля ПА можно найти в других24,25,,2627.
    2. Подготовьте два водных растворов для каждого желательного гидрогеля жесткость. Подготовить раствор 1 быть шарик бесплатно и решения 2 содержат 0,03% 0,1 мкм диаметром флуоресцентные микро бусы (см. Таблицу материалы).
    3. Дега решений 1 и 2, вакуумные для 15 мин для устранения кислорода, который известен для подавления полимеризации решений.
    4. Добавьте 0,6% 10 г/мл бульона APS решения и 0,43% tetramethylethylenediamine (TEMED) решения 1, чтобы включить инициации полимеризации. Действуйте быстро.
    5. 3.6 мкл раствора 1 в центр каждой скважины 24-ну блюдо (см. Шаг 1.2 для его приготовления).
    6. Немедленно Заклеить лунки с необработанной круговой coverslips 12 мм и пусть раствор 1 сидеть в течение 20 мин, таким образом, чтобы он полностью polymerizes.
    7. Аккуратно нажмите иглой шприца к поверхности для создания небольшой крюк на его кончик, чтобы облегчить удаление coverslips. Поднимите coverslips иглой шприца.
    8. Добавить 0,43% и 0,6% 10 г/мл раствора запасов APS TEMED решение 2. Месторождения 2.4 мкл смеси поверх первого слоя в каждой скважине 24-ну блюдо.
    9. Крышка 2 решения с круговой стекло 12 мм coverslips, нежно нажатия вниз с помощью пары щипцы для обеспечения толщины второго слоя является минимальным. Пусть решение 2 полимеризоваться за 20 мин.
    10. 500 мкл 50 мм HEPES рН 7,5 каждому из скважины и затем удалите стекло coverslips с иглой шприца и пинцет.
  2. Стерилизация, коллаген покрытие и уравновешивания Полиакриламидные гидрогели
    1. УФ подвергать гидрогели на 1 ч в культуре ткани капот позволить стерилизации.
    2. Приготовить смесь из 0,5% вес/объем sulfosuccinimidyl 6-(4′-azido-2′-nitrophenylamino) hexanoate (сульфогруппу-SANPAH, смотрите Таблицу материалы) в 1% ДМСО и 50 мм HEPES pH = 7,5.
    3. Добавьте 200 мкл этого решения в верхней поверхности гидрогели. Действует быстро, подвергать их УФ (302 Нм) на 10 минут, чтобы активировать их.
    4. Вымойте гидрогели дважды с 1 мл 50 мм HEPES рН = 7,5. Повторите при необходимости обеспечить, чтобы любой избыток сшивателя удаляется.
    5. Белок пальто гидрогели с 200 мкл 0,25 мг/мл крысы хвост коллаген I (см. Таблицу материалы) в 50 мм HEPES. Инкубируйте гидрогели, с коллагена раствор на вершине, на ночь при комнатной температуре.
      Примечание: Для предотвращения обезвоживания/испарения, поместите пластины для нескольких хорошо в средней сдерживания и добавить Лаборатория очистки ткани замачивают в воде на внутренней периферии сдерживания.
    6. Для измерения толщины гидрогели используйте эпифлуоресцентного или Конфокальный микроскоп с 40 X цель. Сделать это путем размещения z позиции нижней (где это поверхность стекла) и сверху самолеты гидрогеля (где флуоресцентные бусины интенсивности максимум). Затем вычтите z позиции для определения высоты.
      Примечание: Мы использовали Перевернутый эпифлуоресцентного микроскопа и 40 X цели с числовой апертуры 0,65 для измерения толщины гидрогели. Измерения атомной силовой микроскопии (АСМ) могут также выполняться на данный момент подтвердить точное жесткость гидрогели (см. Рисунок 2).
    7. Перед посевом клетки интереса на гидрогели, добавьте 1 mL СМИ на гидрогелей и инкубировать их в 37 градусов за 30 мин до 1 ч для обеспечения сбалансированности.
      Примечание: Мы добавили полный СМИ MCDB-131, потому что это средства массовой информации, где были культивированный модели клетки хозяина (HMEC-1) (см. Шаг 2.1 для подробной информации).

Figure 2
Рисунок 2: AFM измерения ПА гидрогеля жесткость и распределения бусы. А. данные показывают ожидаемые Юнга (измерения жесткости) ПА, гидрогели, учитывая количество акриламида и бис акриламида использован против Юнга, измеряется с помощью AFM (N = 5-6). Турники изображают среднее. Жесткость 0,6 кПа гидрогели не может быть измерена, потому что гидрогели были очень мягкими и соблюдать кончик AFM. Б. это образ фазы вырожденная клеток HMEC-1 и соответствующее изображение бусы из встроенных на верхней поверхности мягкой 3 кПа PA гидрогеля. HMEC-1 были посеяны в течение 24 ч при концентрации 4 x 105 клеток на хорошо. C. Этот образ-это то же самое как Рисунок 2B , но для клеток, проживающих на жесткой 70-КНА ПА гидрогеля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. человека микрососудистой эндотелиальных клеток культуры и посев на гидрогели

  1. Культура HMEC-1 (человека, микрососудистой эндотелия) клетки в MCDB-131 полный СМИ, содержащие MCDB-131 СМИ дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 10 нг/мл эпидермального фактора роста, 1 мкг/мл, гидрокортизон и 2 мм L-глютамин (см. таблица материалов ).
  2. Разделение вырожденная культур 1:6 каждые 3-4 дня и сохранить клетки до прохода 40.
  3. Один день до эксперимента, отсоедините клетки от их культуры судна с помощью трипсин 0.25% / ЭДТА. Сначала помыть клетки и их культура судна 1 x с стерильных фосфат буфер солевой раствор (PBS), а затем добавьте соответствующее количество 0,25% трипсина/ЭДТА (2 мл на 100-мм блюдо или настой 75см, 1 мл на 60-мм блюдо или колбу 25-см), инкубации настой при 37 ° C за 5-10 мин чтобы разрешить отряд клетки от их субстрата.
  4. Нейтрализовать трипсина, добавив желаемый объем MCDB-131 полный СМИ, накапайте осторожно, чтобы порвать пряди клеток, а затем поместите решение в конической пластиковых пробирок.
  5. Аккуратно водоворот решение клеток для того чтобы обеспечить что клетки равномерно распределены и затем вынимают 20 мкл раствора и очень аккуратно заполнить две камеры под coverslip стекла Горяева.
  6. Пелле вниз решение ячеек, содержащихся в конической пластиковых пробирок с помощью центрифугирования для 10 мин на 500 x g.
  7. В течение периода ожидания 10 мин подсчитать количество ячеек с помощью Горяева. Использование микроскопа, сосредоточиться на линии сетки Горяева с 10 X цели и затем использовать ручной подсчет счетчик для подсчета количества ячеек в одной 1 мм x 1 мм квадратный.
  8. Переместить Горяева другой квадрат 1 мм x 1 мм, подсчитать ячейки там и затем повторить процесс еще два раза. Вычислить среднее из четырех измерений и затем умножить среднее 104. Окончательное значение — количество жизнеспособных клеток/мл в суспензии клеток, что это время центрифугируют.
  9. Удалите жидкость из конических пластиковых пробирок при обеспечении, что клетки гранулы не нарушается. Ресуспензируйте клетки в полной СМИ MCDB-131 в концентрации 4 x 105 кл/мл.
  10. Семя клеток в суспензии на гидрогели, сначала удалив средств массовой информации, с которой были инкубировали гидрогели и затем добавления 1 мл суспензии клеток на каждом гидрогеля.

3. инфекции человека микрососудистой эндотелиальных клеток с моноцитогенес л

  1. Заблаговременная подготовка
    Примечание: Заранее подготовьте следующие решения.
    1. Стрептомицин, хлорамфеникола и гентамицин запасы
      1. Подготовьте 50 мг/мл стрептомицина акций решения весом 0,5 г Стрептомицина сульфат и растворения его полностью в 10 мл сверхчистой воды.
      2. Подготовьте 7,5 мг/мл левомицетина акций решения, весом 75 мг хлорамфеникол и растворяют в 10 мл 100% этанола.
      3. Подготовьте 20 мг/мл гентамицина акций решения массой 0,2 г гентамицина сульфат и растворения его полностью в 10 мл сверхчистой воды.
      4. Фильтр стерилизовать всех запасов решения с 0,2 мкм фильтром шприц и хранить их при-20 ° C для длительного использования (1-2 месяца).
    2. Мозг сердца инфузии (BHI) средства массовой информации и агар пластины
      1. Найдите два 1-Л флаконы и добавьте магнитные перемешать бар внутри каждого колбу.
      2. Для BHI СМИ добавьте 37 g BHI порошка в одной колбе а ультрачистая вода до 1 л смеси решение энергично, поместив колбу на Плиты магнитные перемешать до полного растворения порошка.
      3. Для плиты агара BHI, добавить 37 g BHI порошка и 15 г гранулированного агар (см. Таблицу материалы) в втором колбу и добавить ультрачистая вода до 1 л смеси решение энергично, поместив колбу на Плиты магнитные перемешать до полного растворения порошка.
      4. Не слишком плотно завинтите крышки колбы и решения с использованием жидкости установка или согласно спецификациям автоклава.
      5. Удаление решения из автоклава, а затем охладить вниз агар BHI решение 55 ° C. Если BHI СМИ в флакон 1 Л хранится стерильные, он может использоваться для до одного месяца.
      6. Подготовить бактерии агар BHI пластины, сначала добавьте антибиотиков, если это целесообразно, флакон, содержащий BHI и агар (в зависимости от бактериальных штаммов вырастись). Кратко поставьте колбы на Плиты магнитные перемешать разрешить быстрое смешивание.
        Примечание: Антибиотиков, используемых здесь являются специфическими для Lm штаммов, используемых, но любые необходимые антибиотики могут быть использованы в BHI-агар пластины. Мы добавили стрептомицина к концентрации 200 мкг/мл и хлорамфеникол к концентрации 7.5 мкг/мл, потому что 10403S Lm штаммов устойчивы к стрептомицина. Эти штаммы были проспряганное с плазмида, содержащий хлорамфеникол Ацетилтрансфераза открытых рамка чтения, поэтому сопротивление хлорамфеникола.
      7. Вылейте смесь в 10 см полистирола бактерий культуры пластин (примерно 20 мл на пластине). Чтобы избавиться от пузырей, кратко пламя на верхней поверхности плиты. Прохладный пластины на ночь при комнатной температуре.
      8. На следующий день, печать сухой плиты и хранить их на 4 ° C.
  2. Заражение человека микрососудистой эндотелиальных клеток с моноцитогенес л
    1. За три дня до инфекции, полоска, Lm напрягаться, чтобы использоваться из запаса глицерин (температуре-80 ° C) на пластину BHI-агар, содержащий 7.5 мкг/мл хлорамфеникола и 200 мкг/мл стрептомицина, если это уместно.
      Примечание: Напрягаться, чтобы быть прожилками из может быть одичал типа или мутант, конститутивно выражая флуоресцирования (для иммуноокрашивания, использованные JAT1045) или выражая флуоресценции под ActA промоутер (для потока цитометрии или тяги силовой микроскопии JAT983 или JAT985 были использованы)22.
    2. Инкубируйте пластины при 37 ° C, до тех пор, пока отдельные колонии формируются (1-2 дня).
    3. За день до инфекции, растут желаемого нагрузку на ночь, покачивая его на 150 об/мин при 30 ° C в BHI СМИ с 7.5 мкг/мл Хлорамфеникол (при необходимости).
      1. Место 5 мл BHI СМИ в 15 мл конические пластиковых пробирок, добавьте 7.5 мкг/мл Хлорамфеникол (при необходимости), а затем инокуляции единую колонию из агар пластину, используя кончик стерильные 10 мкл.
    4. На следующий день, перед инфекцией, измерения оптической плотности раствора бактерий на 600 Нм (OD600) путем разбавления образца 1:5; Используйте кювета, содержащие BHI только для того, чтобы служить пробел.
    5. Разбавить ночь культуры OD600 0.1 и проинкубируйте его, встряхивания в течение 2 ч при 30 ° C, в средствах массовой информации BHI с 7.5 мкг/мл Хлорамфеникол (при необходимости) позволяют достичь лаг фазы роста бактерий.
    6. Измерить OD600 бактериальных решение, которое, как ожидается, составит около 0,2 - 0,3. Если OD600 выше, разбавляют до 0,2 - 0,3 с BHI одиночку.
    7. 1 мл раствора бактериальной учитывать пробки microcentrifuge. Спина его вниз по 4 мин на 2000 x g с помощью центрифугирования при комнатной температуре. Удалить супернатант и Ресуспензируйте бактериальных Пелле в 1 мл культуры ткани класс PBS, в культуре ткани капот. Промойте бактерий, вдвое больше, вращая их вниз по 4 мин на 2000 x g при комнатной температуре. Удалить супернатант и Ресуспензируйте бактерий в 1 мл ФСБ.
    8. Подготовка смеси инфекции путем смешивания 10 или 50 мкл бактерий высокомобильна в PBS с 1 мл раствора MCDB-131 полный СМИ для разносторонности инфекции (МВД; то есть, количество бактерий на клетки-хозяина) приблизительно 50 бактерий на клетки-хозяина или 10 бактерий на клетки-хозяина.
    9. Удалите средства массовой информации из скважин 24-ну плит, осторожны, чтобы не нарушить гидрогели или клетки. Вымыть клетки 1 x с 1 мл раствора MCDB-131 полный СМИ и затем добавить 1 мл бактерий в каждой скважине.
    10. Держите некоторые инфекции микс (по крайней мере 100 мкл) для определения MOI (см. Шаг 3.3).
    11. Крышка с крышкой и обернуть пищевой пленкой полиэтилена во избежание утечки пластины. Поместите пластины в центрифуге и спина образцы для 10 минут при 200 x g для синхронизации вторжения. Переместить пластины в инкубатор культуры ткани и Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C.
    12. Стирать образцы 4 x с MCDB-131 полный СМИ и переместить их в инкубатор культуры ткани. После дополнительных 30 мин замените средства массовой информации СМИ, дополнены 20 мкг/мл гентамицина.
  3. Определение количества инфекции (МВД)
    1. Во время первоначального 30-мин-инкубации клеток хозяина с бактериями Подготовьте десятикратного серийных разведений инфекции смеси для определения МВД. Сделайте десятикратного разведений путем смешивания 100 мкл инфекции смеси с 900 мкл ПБС (разбавления 10-1 ). Затем смешайте 100 мкл разбавления 10-1 с 900 мкл PBS (разбавления 10-2 ).
    2. Продолжайте, пока получается разбавления 10-5 .
      Примечание: Все решения должны быть смешанными задолго до разбавления их, и свежий чистый наконечники должны использоваться на каждом шагу.
    3. После того как сделаны разведений, место 100 мкл 10-2 - 10-5 разведений в центре BHI/агар/хлорамфеникол/стрептомицина пластин (при необходимости).
    4. Сделайте разбрасыватель из стеклянной пипетки, используя огонь согнуть пипетку для создания обработчика. DIP пипетку в 100% этанола для стерилизации и затем сжечь этанола с пламенем.
    5. После того, как разбрасыватель остыл, распространение бактериальной разведений однородно на тарелках, начиная от разбавления 10-5 и Переходя к более концентрированной смеси. Инкубируйте пластины вниз при 37 ° C в течение 2 дней.
    6. В зависимости от плотности колонии Определите количество колоний 10-3 и 10-4 или 10-4 и 10-5 разрежения плит. Рассчитайте МВД следующим образом:
      количество колоний × разрежения фактор ÷ объем первоначальных добавил = количество кое за мкл
      количество кое за мкл × объем бактерий смесь хорошо = количество кое в колодец
      количество кое за хорошо × количество клеток на хорошо = количество бактерий в клетку
      Примечание: CFU стенды для формирования колонии единиц.
    7. Средняя MOIs из двух пластин для получения окончательного MOIs.

4. проточной цитометрии для количественного определения внеклеточной матрицы жесткости зависимых восприимчивость клеток хозяина к инфекции

  1. Весят 5 мг коллагеназы и поместите его в 15 мл конические пластиковых пробирок. Добавить 10 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и хорошо перемешайте.
  2. 8 h послеоперационные инфекции, удалить медиафайл из скважин пластину 24-Ну и Промыть лунки 1 x с тканевой культуры PBS. Удаление PBS из скважин и 200 мкл трипсина ЭДТА/коллагеназы смеси для каждой скважины. Поместите это в инкубатор культуры ткани за 10 минут позволить полный отряд клеток.
  3. Используйте свежие пипетки для каждой скважины и пипетки смеси вверх и вниз 8 x. Будьте нежны с тем, чтобы не повредить клетки. Добавьте 200 мкл полной СМИ в каждой скважине для нейтрализации трипсина.
  4. Перевести 400 мкл ячейки решения каждой скважины в 5 мл полистирола с крышкой ситечко ячейки 35 мкм (см. Таблицу материалы).
  5. Анализировать 10 000-20 000 ячеек на сэмпл проточной цитометрии. Выполните сбор данных через проточной цитометрии и определить процент инфицированных клеток в колодец, с использованием соответствующих коммерчески доступного программного обеспечения. Используйте вперед разброс против стороны точечные участки для ворот основную часть распределения клеток.
    Примечание: Это обеспечит анализ единичных клеток и ликвидации мусора или ячейки Дуплеты или тройня.
    1. Измерения флуоресценции сигнал от управления неинфицированных клеток и строба населения зараженных клеток, исключая аутофлюоресценция.

5. иммуноокрашивания внеклеточные бактерий, микроскопии и обработки изображений

Примечание: Этот подход используется для различения ECM-жесткость зависимых бактериальной адгезии на поверхности клеток принимающей против бактериальных интернализации (вторжения) в хозяев.

Figure 4
Рисунок 4 : Иммуноокрашивания Lm инфицированных HMEC-1 клетки, проживающих на гидрогели различной жесткости дифференцировать бактериальной адгезии против вторжения. Эти изображения показывают репрезентативного примера дифференциальной иммуноокрашивания показаны A. клеточных ядер (DAPI), Б. все бактерии (КГВ) и C. за пределами бактерии (Alexa-546). HMEC-1 клетки проживающие на мягкой 3-КНА гидрогеля. Стрелки указывают на бактерии, которые учитываются, поэтому отображаются только зеленый канал. Данные в D-F касаются N = 20 изображения, снятые для инфицированных клеток HMEC-1, проживающих на мягких 3-КНА и жесткой 70-КНА гидрогелей иПоказать D. общее бактерии за ядер; Е. интернализированных бактерий на ядер; и Ф. вторжения эффективность (отношение интернализированных бактерий всего бактерии). Турники изображают данных среднее. P-значение было рассчитано с непараметрический тест Вилкоксон ранг сумма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. 30 мин после инфекции, мыть инфицированных клеток HMEC-1 с JAT1045 (Lm что выражается конститутивно Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП)) 4 x со средствами массовой информации.
  2. После четвертого мыть смешать 1 мкл 1 мг/мл Хойста с 1 мл раствора MCDB-131 полный СМИ и добавить его в каждой скважине пятно ядер клеток. Место клетки в инкубатор культуры ткани за 10 мин.
  3. Вымыть клетки 1 x с PBS. Исправьте их с не permeabilizing фиксатором для дифференциальной иммуноокрашивания для 20 мин при комнатной температуре28.
    Примечание: Фиксатор содержится 0,32 М сахарозы, 10 мм MES рН 6.1, 138 мм хлористого калия, 3 мм MgCl2, 2 EGTA и 4% формальдегида (микроскопия класс).
  4. Вымыть клетки 1 x с PBS. Блокировать образцов для 30 минут с 5% бычьего сывороточного альбумина (см. Таблицу материалы) в PBS.
  5. Проинкубируйте образцы для 1 h с анти Lmосновное антитело (см. Таблица материалов) разводят 1: 100 в PBS, содержащий 2% BSA.
  6. Стирать образцы в PBS 3 x и инкубировать их за 1 час с AlexaFluor-546 и вторичные антитела кролика анти коза (см. Таблицу материалы) разводят 1: 250 в PBS, содержащий 2% BSA. Стирать образцы 3 x в PBS. Храните образцы в 1 мл PBS для воображения.
  7. Изображение и анализ более чем 1000 ячеек на условие.
    1. Для изображений, используйте Перевернутый эпифлуоресцентного микроскопа с ПЗС-камеры (см. Таблицу материалы) и 40 X воздуха план флюорит воздушные цели с 0.6 числовой апертуры (NA).
      Примечание: Власть равным 25% и время экспозиции в 100 г-жа Микроскоп фильтров, используемых для mCherry, 470/525 Нм, GFP 530/645 Нм и DAPI 395/460 Нм, для возбуждения и выбросов соответственно. Микроскоп, который мы использовали контролировался пакет программного обеспечения микроскопии открытым исходным кодом29.
    2. Для дифференциальной иммуноокрашивания граф всех «зеленых» бактерии, связанные с отдельными ячейками как сторонником. Количество бактерий, которые «зеленых» и «красный» (благодаря антитела связывая) как не учитываются.
      Примечание: Мы определили число ядер, запустив сценарий на заказ и CellC программного обеспечения (см. Таблицу материалы) для перечисления бактерий30.

6. мульти-хорошо тяги силовой микроскопии и монослоя стресс микроскопии

Figure 5
Рисунок 5: Lm инфицированных HMEC-1 клетки уменьшение величины силы тяги, которую они оказывают на их эхо во время инфекции. Группа A показывает изображение фазы, B показывает поле деформации, C показывает тяговых стресс поля и D показывает внутриклеточных напряженность поля неинфицированных клеток HMEC-1, проживающих на 20 кПа гидрогеля. Цветные полосы деформации карты (мкм), тяги стресс карты (ПА) и внутриклеточных напряженности карты (nNµm-1) отображаются в верхней части карты тепла. Столбцы показывают три представителя время точки: 3, 8 и 18 h послеоперационные инфекции. E-H. Так же, как панели A-D , но для клеток, инфицированных Lm в MOI 300. Изображения бактерий (красный канал) накладываются на фазу изображения клеток. TFM записи были проведены одновременно визуализации несколько скважин. Размер окна для PIV был 32 пикселей с напуском на 16. Линейки шкалы составляет 32 мкм. Этот рисунок был изменен с Bastounis и Териот59. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Подготовить ПА гидрогели на тарелку, 24-а (см. Шаг 1). Семя HMEC-1 клетки (см. Шаг 2) и заразить их с JAT983, как описано выше (см. Шаг 3).
  2. Подготовьте средства жить микроскопия, дополняя Лейбовиц в L-15 с плода бычьим сывороточным 10%, 10 нг/мл эпидермального фактора роста и гидрокортизон 1 мкг/мл.
    Примечание: L-15 уже содержит 2 мм L-глютамином, поэтому нет необходимости добавлять дополнительные как в случае MCDB-131 средств массовой информации.
  3. 4 h после инфекции (когда внутреннюю JAT983 начинает флуоресцирующих), смешайте 1 мкл 1 мг/мл Хойста с 1 мл раствора L-15 полный СМИ и добавить его в каждой скважине пятно ядер клеток. Место клетки в инкубатор культуры ткани для 10 мин и затем замените в каждой скважине L-15 полный СМИ 1 мл L-15 полный СМИ дополнены 20 мкг/мл гентамицина.
  4. Обложка тарелка с крышкой и место он в экологические камеры микроскопа (см. Таблицу материалы) достижение равновесного уровня до 37 градусов.
    Примечание: Для изображений, используйте Перевернутый эпифлуоресцентного микроскопа с ПЗС-камеры (см. Таблицу материалы) и 40 X воздуха план флюорит воздушные цели с 0.6 НС.
  5. Приобрести многоканальный покадровой изображения флуоресцентных бусины и флуоресцентные бактерий и фаза контраст изображения клеток хозяина, каждые 10 мин на 4-12 ч.
    Примечание: Для изображений, власть был установлен равным 25% и время экспозиции в 100 г-жа Микроскоп фильтры (возбуждение/излучение) используется для mCherry и GFP, 470/525 Нм и 530/645 Нм соответственно.
  6. В конце записи добавьте 500 мкл 10% лаурилсульфат натрия (SDS) в воду в каждом из скважин.
    Примечание: Клетки будет отсоединена от гидрогеля и гидрогеля вернется в исходное состояние недеформированного, так как это эластичный.
  7. Возьмите изображение гидрогеля и использовать его как ссылку недеформированного изображения.
  8. Определите двумерной деформации гидрогеля на каждый момент времени с помощью частицы изображения Велосиметрия (PIV)31, сравнивая каждое изображение покадровой серии с изображением ссылка недеформированного гидрогеля. Используйте соответствующее окно размеров и пересекаются в зависимости от эксперимента.
    Примечание: Мы использовали windows 32 пикселей с напуском на 16 пикселей.
  9. Рассчитайте 2D тяги подчеркивает, что клетки оказывают на гидрогеля, как описано в других разделах32,33.
  10. Рассчитать монослоя напряжение от тягового подчеркивает как описано ранее34 путем решения уравнений Механическое равновесие для тонкой упругой пластины при условии силы реакции, создаваемые па гидрогеля на монослое, которые имеют напротив знак подчеркивает измеренной тяги.
    Примечание: См. Дополнительные материалы 1.

7. Количественная микроскопия промежуток времени для оценки-жесткость внеклеточные матрицы зависимых л моноцитогенес распространения через эндотелиальные клетки

Figure 6
Рисунок 6: данных покадровой количественная микроскопия Lm распространения через HMEC-1 монослои посеян на подложках с 3-кПа и 70 кПа жесткость. A. эта группа по-прежнему показывает изображения из двух представительных инфекции очаги на 0, 200, 400 и 600 мин. Фаза канал изображает монослои клеток HMEC-1, и красный канал описывается внутриклеточные Lm (см. Шаг 7 протокола). Б. Эта панель показывает область выпуклую, охватывающих фокуса инфекции, как функцию от времени. Области фокуса состояния 3-кПа (красный) растет быстрее, чем у 70 кПа (зеленый). C. эта панель показывает, что радиальное расстояние от центра до края инфекции фокус на печать как функцию от времени для представителя очагов инфекции, растущих в HMEC-1 монослои посеян на подложках ПА 3-кПа (красный) и жесткость 70-кПа (зеленый). Радиальная скорость (dr/dt) является постоянным для условия 3-КНА, но двухфазный состояния 70 кПа. Д. Эти данные показывают радиальная скорость для первых 200 мин очагов десяти независимых инфекции. Красный (3-кПа) и зеленый (70-кПа) точек данных изображают на склонах двух окружностей, описанных в предыдущих групп. Турники изображают данных среднее. P-значение было рассчитано с непараметрический тест Вилкоксон ранг сумма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Подготовить ПА гидрогели на тарелку, 24-а (см. Шаг 1), семя клеток HMEC-1 (см. Шаг 2) и расти на ночь JAT983 культур, как описано выше (см. Шаг 3).
  2. В день инфекции, Подготовьте смесь инфекции, смешивая 10 мкл бактериальной Пелле мл MCDB-131 полный средств массовой информации. Тщательно удалить медиафайл из скважин 24-ну пластин и добавьте 1.9 мл MCDB-131 полный СМИ и 0,1 мл смеси бактериальной каждой скважины.
    Примечание: Нижняя MOI, используемые в этот assay необходима для анализа распространения событий, которые начинаются от одной бактерии, вторгаясь клетки-хозяина.
  3. Крышка с крышкой и запечатать его с полиэтиленовой пленкой, чтобы избежать утечки. Поместите пластины в центрифуге и спина образцы для 10 минут при 200 x g для синхронизации вторжения.
  4. Переместить пластины в инкубатор культуры ткани и инкубировать их за 5 мин.
  5. Стирать образцы 4 x со средствами массовой информации и перемещать их в инкубатор культуры ткани. После дополнительных 5-7 мин замените средства массовой информации СМИ, дополнены 20 мкг/мл гентамицина.
  6. Инкубируйте пластину в инкубаторе для дополнительную 5 h разрешить actA промоутер включите и диск выражение mTagRFP открытой чтении кадра35.
  7. Подготовьте средства жить микроскопия, дополняя Лейбовиц в L-15 с плода бычьим сывороточным 10%, 10 нг/мл эпидермального фактора роста и гидрокортизон 1 мкг/мл.
    Примечание: L-15 уже содержит 2 мм L-глютамином, поэтому нет необходимости добавлять дополнительные как в случае MCDB-131 средств массовой информации.
  8. Смешайте 1 мкл 1 мг/мл Hoechst красителя с 1 мл раствора L-15 полный СМИ и добавить его в каждой скважине пятно ядер клеток. Место клетки в инкубатор культуры ткани для 10 мин и затем замените в каждой скважине L-15 полный СМИ 1 мл L-15 полный СМИ дополнены 20 мкг/мл гентамицина. Обложка тарелка с крышкой и место он в экологические камеры микроскопа (см. Таблицу материалы) достижение равновесного уровня до 37 градусов.
    Примечание: Для изображений, Перевернутый эпифлуоресцентного микроскопа был использован с ПЗС-камеры (см. Таблицу материалы) и 20 X воздуха план флюорит воздушные цели с 0,75 NA. Питания был установлен на 50% и время экспозиции до 50 г-жа Микроскоп фильтров, используемых для mCherry являются 470/525 Нм для возбуждения и выбросов соответственно.
  9. Изображение, несколько позиций каждые 5 минут, используя функцию автофокуса для мониторинга, как Lm распространяются через HMEC-1 монослои посеян на различной жесткости гидрогели.
    Примечание: L-15 буферизуется с HEPES, поэтому нет необходимости использовать CO2 во изображений.

Representative Results

ECM жесткость зависимых восприимчивость клеток HMEC-1 к Lm инфекции:
ПА гидрогели различной жесткости, все поверхности покрытием с коллагеном я, были построены на нескольких хорошо стекла дно тарелки, как описано в Шаг 1 протокола (см. Рисунок 1). Чтобы подтвердить точное жесткость гидрогели, как описано ранее,26,27 произведены измерения AFM (см. Рисунок 2). Последние исследования показали, что местные соответствия базальной мембраны эндотелиальных клеток может варьироваться от 1 кПа (например, ткани мозга) до 70 кПа (например, аорты)36,,3738, 39 , 40. Таким образом, мы решили проверить инфекцию клеток HMEC-1, проживающих на матрицы с следующим жесткость: 0,6 кПа, 3 кПа, 20 кПа и 70 кПа. Для каждого гидрогеля жесткость шесть гидрогели были сфабрикованы для оценки воспроизводимости результатов.

Проточной цитометрии была использована для оценки подверженности ECM жесткость зависимых клеток HMEC-1 Lm инфекции (см. рис. 3). HMEC-1 клетки были инфицированы Lm штамм (JAT985), который выражает флуоресцентные маркер после интернализации (actAp::mTagRFP), позволяя обнаружения только внутриклеточных бактерий (см. рисунки 1 L - 1N). JAT985 также не хватает ActA, отключение бактерии от распространение от ячейки к ячейке, так как ActA является необходимым для формирования актина комета хвосты и последующего распространения бактерий. 7 - 8 ч после инфекция, HMEC-1 клетки была оценена с помощью проточной цитометрии. Для обеспечения анализа единичных клеток, основная часть распределения клеток был воротами с помощью вперед против стороны точечной, и затем второй шлюзовой шаг была исполнена исключить клетки, которые демонстрируют аутофлюоресценция (см. показатели 3А - 3 C ). Предварительные результаты, изображенные на рисунке 3 показывают, что HMEC-1-инфекции с Lm примерно два раза больше для клеток HMEC-1, проживающих на жесткой гидрогели 70 кПа по сравнению с клетки, проживающих на мягкой гидрогели 0,6 кПа (см. показатели 3B - 3D). Повышенная восприимчивость Lm инфекции клеток HMEC-1, проживающих на жесткой по сравнению с мягкими матрицы может быть связано с: 1. увеличение адгезии Lm на HMEC-1; 2. увеличение Lm вторжение в HMEC-1; или 3. оба наступления выше совместно. Чтобы проверить какие гипотезы трюмы, HMEC-1 клетки были посеяны на мягкие (3 кПа) и жесткой гидрогели (70 кПа) и инфицированных конститутивно GFP, выражая Lm (см. показатели 4A - 4 C). Образцы были устранены вскоре после инфекции и внешние (придерживаясь) бактерии были окрашенных с антителами. С помощью количественная микроскопия, мы обнаружили, что существует значительно больше бактерий, придерживаясь HMEC-1, когда клетки хозяина находятся на жесткой по сравнению с мягких гелей (см. рис. 4D). В соответствии с данными цитометрия потоков, существует значительно больше бактерий относить на счет HMEC-1 когда клетки хозяина находятся на жесткой по сравнению с мягких гелей (см. Рисунок 4E). Однако, аналогична эффективности вторжения (бактерии интернализации/общее количество бактерий) Lm в клетки HMEC-1, независимо от субстрата жесткость (см. Рисунок 4F).

Тяги силовой микроскопии клетки Lm инфицированных HMEC-1:
LM инфекции клеток HMEC-1 может изменить биомеханику зараженных принимающей клеток, включая прочность крепления их ECM или друг к другу, затрагивающих их целостности барьер. Мы стремились оценить ли что может быть в случае с помощью тяги силовой микроскопии32 для вычисления ячейки ECM тяговой силы и41 монослоя стресс микроскопии для вычисления внутриклеточных растягивающих сил. На рисунке 5 изображена карты деформации поля, тяговые стресс поля и внутриклеточных напряженность поля клеток HMEC-1, проживающих на 20 кПа гидрогели в разное время точек послеоперационные инфекции. Фигуры 5A - 5 D обратитесь к клетки неинфицированных управления HMEC-1 во время цифры 5E - 5 H относятся к HMEC-1 клетки, инфицированные с Lm на разносторонности инфекции равным 300 бактерий на ячейку. Эта предварительная работа свидетельствует о том, что инфицированные клетки HMEC-1 сократить масштабы их клетки ECM и внутриклеточных подчеркивает в течение инфекции с Lm, то что не наблюдается для неинфицированных управления клеток.

ECM жесткость зависимых Lm распространение через монослои HMEC-1:
Покадровой микроскопия была использована для исследовать эффект матрицы жесткости имеет на Lm распространение через монослои HMEC-1. Как Lm распространяется через монослоя, бактерии фокусирования инфекции, который растет как функцию времени (см. Рисунок 6A и видео рисунки 1 и 2). Область фокуса инфекции была измерена путем рисования выпуклую, наименьший выпуклый многоугольник, который включает в себя набор точек, вокруг бактерии42. Существует нет стандартной метрики в поле, чтобы измерить эффективность л моноцитогенес в ячейке распространения через монослоя клеток хозяина. Чтобы оценить эффективность распространения, некоторые подсчитали количество клеток хозяина в фокус инфекции41, и другие рисованные границ вручную вокруг группы инфекции принимающей ячейки43. Мы решили нарисовать выпуклый многоугольник вокруг бактерии, потому что это автоматизированный, последовательной и вычислительно недорогой процесс для измерения эффективности распространения моноцитогенес л . Поступая таким образом, мы нашли небольшое уменьшение в области фокуса инфекции в клетках HMEC-1 посеян на 70 кПа гидрогели, когда по сравнению с теми посеян на 3 кПа матрицы (см. Рисунок 6B и видео рисунки 1 и 2). Чтобы определить темпы роста фокуса инфекции, радиальное расстояние было изобразить как функцию от времени путем извлечения квадратного корня из области фокуса инфекции и деления это Пи. Это математическое преобразование предполагает, что форма инфекции фокус находится примерно круговой44. Чтобы измерить скорость роста внимания, была измерена скорость изменения (т.е., склон) радиальное расстояние для обоих матрицы 3 - х и 70-х кПа. Этот подход дал разъяснения в фокус инфекции росло быстрее и монотонно в клетках HMEC-1 посеян на 3-КНА матрицы. Однако фокус росли значительно медленнее (первые 200 мин) и немного медленнее (200 до 600 мин) в клетках посеян на 70 кПа матрицы (см. рис. 6C). Действительно, анализ дополнительных данных подтвердил, что фокус инфекции росло, в среднем два раза медленнее в матрицах 70 кПа, особенно во время первых 200 мин (см. рис. 6D).

Figure 3
Рисунок 3 : ECM жесткость зависимых восприимчивость клеток HMEC-1 для Lm вторжения измеряется с помощью проточной цитометрии .  HMEC-1 клетки были заражены лм (JAT985), и инфекции был проанализирован проточной цитометрии. А. Эта группа показывает сторона против вперед точечный график для представительных клеток HMEC-1, из одной скважины. Массового распространения клеток был выбран через стробирования исключить мусора (слева) и клетки Дуплеты или тройня (справа). Б. Этот график показывает гистограмму логарифма Lm интенсивности флуоресценции в клетку для HMEC-1 покрытие на мягкой 0,6 кПа. C. Этот график показывает гистограмму логарифма интенсивности флуоресценции Lm на ячейку для HMEC-1 покрытием на жесткой гидрогели 70 кПа. Гистограммы для N = 4-6 реплицирует отображаются разными цветами. Гистограмма управления неинфицированных клеток фиолетовый. Ворота, используемый для определения, что заражен отображается красным цветом. МВД-100 и инфекция была начисленных 8 h послеоперационные инфекции. Д. данные показывают процент инфицированных клеток HMEC-1 против гидрогеля жесткость (N = 5). Турники изображают данных среднее. P-значение было рассчитано с непараметрический тест Вилкоксон ранг сумма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Video Figure 1
Видео Рисунок 1: распространение внутриклеточных Lm (красный канал) через монослоя клеток HMEC-1 (фаза) с семенами на подложке 3-кПа. Клетки были отражаться в средствах массовой информации Лейбовиц L-15 (10% FBS, 20 мкг/мл гентамицина) внутри, климатическая камера, достижение равновесного уровня до 37 градусов. Изображения были собраны каждые 5 мин. Фильм скорость-15 кадров в секунду пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Video Figure 2
Видео Рисунок 2: распространение внутриклеточных Lm (красный канал) через монослоя клеток HMEC-1 (фаза) с семенами на подложке 70 кПа. Клетки были отражаться в средствах массовой информации Лейбовиц L-15 (10% FBS, 20 мкг/мл гентамицина) внутри, климатическая камера, достижение равновесного уровня до 37 ° C. Изображения были собраны каждые 5 мин. Фильм скорость-15 кадров в секунду пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Модуль Юнга (E, кПа) Акриламид % (от 40% акций) Bisacrylamide % (от 2% акций)
0.6 3 0.045
3 5 0,075
10 10 0,075
20 8 0.195
70 10 0,45

В таблице 1. Состав гидрогели полиакриламид (PA) различной жесткости. В этой таблице, процент акций 40% акриламида раствор и процент фондовых бис акриламида раствор 2% для достижения заданной жесткость (Юнга, E) указаны в разных столбцах.

Supplemental Material
Дополнительные материалы 1. Вычисление внутриклеточных напряженности от вычисляемых тяги напряжений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Клетки могут смысле различных физических экологических подсказки, которые могут повлиять не только морфологии клеток, но также их деятельности выражение и белка гена, влияя таким образом на критических клеток функций и поведения45,46. Жесткость ECM клеток все больше ценится как важный модулятором клеточной подвижности, дифференциация, распространения, и в конечном итоге клеток судьба47,,4849. Несмотря на многие последние достижения в понимании комплекс биомеханических взаимодействие между клеток и их ECM, мало что известно о как экологические жесткость влияет на восприимчивость клеток к бактериальной инфекции. Для облегчения таких исследований, мы разработали этот роман несколькими хорошо assay основанный на устоявшихся изготовление Полиакриламидные гидрогели перестраиваемый жесткости, который совместим с инфекцией assays50. Традиционно бактериальной инфекции клеток в культуре ткани была изучена на стекло или полистирол поверхности, которые приблизительно 1-3 порядков жестче, чем естественный ECM наиболее адэрентных клеток8,51. Assay, описанные здесь открывает новые дороги, позволяя изучение взаимодействия бактерий хост в физиологически соответствующих экологических жесткости режима.

Для доказательства концепции представлены assay HMEC-1 клетки были выбраны в качестве модель адэрентных принимающей ячейки и Lm как модель бактериальных патогенов. Однако assay могут быть расширены для дальнейшего исследования, если соответствующим образом изменены. Такие исследования могут включать инфекции типов клеток различных млекопитающих адэрентных принимающей дополнительные патогенных микроорганизмов, включая бактерии и вирусы. Для этого конкретного assay гели были белка покрытием с коллагеном я, но в зависимости от типа принимающей ячейки, можно использовать различные ECM белка покрытия, например, Ламинин или фибронектин, для облегчения вложение клеток хозяина интерес на Гидрогель 52. дополнительного рассмотрения, который зависит от типа принимающей ячейки — это диапазон жесткости гидрогеля быть изучены. Диапазон жесткости должно зависеть от физиологически то, что актуально для конкретного узла типа клеток и как хорошо что хост придает формирование монослоя на данной жесткости Гидрогель. Аналогичным образом в зависимости от модели возбудителя желательно быть расмотренным, незначительные изменения может потребоваться осуществляться на инфекции assay, описанные здесь.

Инновации assay по сравнению с предыдущими методами для изготовления Полиакриламидные гидрогели24,50,53 лежит в некоторых уникальных особенностей интегрированы в assay предлагаемого инфекции. Во-первых гидрогели строятся на нескольких хорошо стекла нижней пластины, которые одновременно позволяет проверки нескольких условий, а также автоматизации определенных процедур. Мониторинг нескольких условий в то же время или изучения нескольких реплицирует имеет решающее значение, поскольку результаты такого подхода может быть под влиянием таких факторов, как принимающей ячейки прохода и точное количество бактерий, добавил заразить хозяева, которые часто меняют между независимыми экспериментов. Дополнительные уникальной особенностью этот assay является, что гидрогели имеют высоту около 40 мкм, который является достаточно тонким, чтобы изображение с помощью обычных микроскопии. Мы показали, что мы можем успешно выполнить микроскопия живой клетки и клетки фиксацию и иммуноокрашивания, следуют изображений, без введения высоких фон флуоресценции. И наконец гидрогели изготовлены из двух слоев, с верхней 1, встроенные люминесцентные микрошарики, замкнутые в одной фокальной плоскости. Этот атрибут обеспечивает, что там будет не из из фокус света вмешательства во время визуализации. Присутствие бисер позволяет изучение топографии поверхности гели для обеспечения единообразной и улучшает производительность TFM и МСМ32,24,41. TFM и МСМ можно вычислить ячейки ECM и ячеек сил соответственно клеток, находящихся на разной жесткости матрицы. Используя этот роман assay, это можно сделать путем сравнения одновременно как вклад окружающей среды жесткости и инфекции такие измерения физических сил. После такого подхода эффект инфекции имеет на клетки-хозяина, механика всей его курс может быть определено. Кроме того эволюция внутриклеточных подчеркивает клеток могут быть рассчитаны с помощью МСМ и может использоваться как мера целостности барьер монослоя. Наконец учитывая несколько хорошо характер анализа, это можно одновременно ввести фармакологических и генетические возмущения с бактериальной инфекцией, чтобы исследовать более подробно сложного взаимодействия между принимающей ячейки механики и инфекции.

Один, которые свойственны ограничения метода лежит в субстрат жесткость эффект может иметь на скорость распространения клеток. Как правило в инфекции анализов, мы должны обеспечить, что хост плотность клеток при различных условиях является то же самое. Это потому, что плотность клеток само по себе может иметь влияние на подверженность хостов к инфекции. HMEC-1 клетки, которые были использованы в качестве клеток хозяина не показывают значительную разницу в их число, когда семенами для 24 h на гидрогели. Однако различных типов клеток могут демонстрировать дифференциального распространения, в зависимости от жесткости гидрогеля, что может исказить инфекции исследования. Аналогичным образом предвзятости инфекции могут возникнуть, когда клетки не образуют монослои или не придают хорошо на гидрогели, как происходит, когда определенные типы клеток посеян на очень мягкий матрицы (например, эндотелиальных клеток человека пуповины или Мадин-Дарби собак почек эпителиальные клетки посеян на 0,6 кПа гидрогели54,-55). Что касается патогенов, некоторые бактерии (например, Borrelia burdgorferi) можно прикрепить на принимающей ячейки и вторгнуться в их, но может также высыпками через них56. Мы еще не проверены если этот assay будет работать для исследования трансмиграции возбудителя, но это представляется возможным, поскольку предыдущие исследования на нейтрофилы пролетный эндотелиальных клеток посеян на ПА гидрогели были задокументированы, чтобы успешно работать57. Там было много исследований, проведенных показаны способы изготовления Полиакриламидные гидрогели данного Юнга, смешивая соответствующей концентрации акриламида и бис акриламид24,25,26 ,27. Однако особенно, когда один хочет выполнить TFM эксперименты на клетки, проживающих на гидрогели различной жесткости, важно для подтверждения ожидаемых жесткость гидрогели через АСМ или другие методы отступ58. Незначительные отклонения от ожидаемого значения могут возникнуть из-за различных растворителей используется или возрасте акриламида раствор, или способами AFM измерений, выполненных (например, форма кончика AFM). Наконец подход, представленные здесь основан на заполнение клеток хозяина на 2D матриц, которые могут отличаться от более реалистичным и физиологически соответствующие 3D сценария. Однако производство 3D гели с перестраиваемой жесткость, заполнения их с клетки хозяина и затем заразить их с патогенами, по-прежнему охватывает определенные технические трудности. Тем не менее мы ожидаем, что в ближайшем будущем мы сможем продлить текущий assay для изучения инфекции в 3D обстановке.

Короче говоря, описывается протокол вместе с предварительные результаты предоставляют доказательства того, что этот роман assay может стать чрезвычайно полезным инструментом для изучения инфекции клеток адэрентных хозяина с патогенных бактерий количественного моды и в гораздо более физиологически соответствующей окружающей среды, чем ранее рассмотренных. Власти фабрикуют Полиакриламидные гидрогели в предлагаемой установке лежит в том, что assay совместим с производительностью нескольких методов, таких как проточной цитометрии, иммуноокрашивания следуют светлую микроскопию и тяги силовой микроскопии. Assay может использоваться для исследований с участием инфекции типов различных принимающих адэрентных клеток патогенами, которые мы ожидаем, будет иметь значительное влияние в обоих распутывая стратегий, которыми патогенов заразить хостов и содействия развитию Терапевтические вмешательства против инфекций.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Наша благодарность м. Нижний колонтитул, р. Lamason, м. Rengaranjan и члены Териот лаборатории для их обсуждения и экспериментальная поддержка. Эта работа была поддержана низ R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Гиллиам стипендий для передовых исследований (F.E.O.), Стэнфорд выпускников стипендий (F.E.O.) и Американской ассоциации сердца (E.E.B.). Проточной цитометрии была исполнена на объекте совместно СУИМ Стэнфорд.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Sodium hydroxide pellets Fisher S318-500
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma A3648
25% gluteraldehyde Sigma G6257-100ML
40% Acrylamide Sigma A4058-100ML
Bis-acrylamide solution (2%w/v) Fisher Scientific BP1404-250
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) Invitrogen F8803
Ammonium Persulfate Fisher BP17925
TEMED Sigma T9281-25ML
Sulfo-SANPAH Proteochem c1111-100mg
Collagen, Type I Solution from rat Sigma C3867-1VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) J.T. Baker 9224-01
HEPES, Free acid J.T. Baker 4018-04
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red Thermofischer 21083027
MCDB 131 Medium, no glutamine Life technologies 10372019
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A Gemini Bio-Prod 900108 500ml
Epidermal Growth Factor, EGF Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0888
L-Glutamine 200mM Fisher SH3003401
DPBS 1X Fisher SH30028FS
Gentamicin sulfate MP biomedicals 194530
Cloramphenicol Sigma C0378-5G
DifcoTM Agar, Granulated BD 214530
BBL TM Brain-heart infusion BD 211059
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water Invitrogen H3570
Formaldehyde 16% EM grade Electron microscopy 15710-S
Anti-Listeria monocytogenes antibody Abcam ab35132
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate Thermofischer A-11035
0.25% trypsin-EDTA , phenol red Thermofischer 25200056
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC Sigma C8051
Streptomycin sulfate Fisher Scientific 3810-74-0
Sucrose Calbiochem 8510
Sodium dodecyl sulfate Thermofischer 28364
MES powder Sigma M3885
KCl J.T. Baker 3040-05
MgCl2 J.T. Baker 2444-1
EGTA Acros 40991
Disposable lab equipment
12 mm circular glass coverslips Fisherbrand 12-545-81 No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated
Glass bottom 24 well plates Mattek P24G-1.5-13-F
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap  Falcon 352235
T-25 flasks Falcon 353118
50 ml conical tubes Falcon 352070
15 ml conicals tubes Falcon 352196
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Falcon 357551
Pasteur Glass Pipettes VWR 14672-380
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Denville P1122, P1126
Powder Free Examination Gloves Microflex XC-310
Cuvettes bacteria Sarstedt 67.746
Razors VWR 55411-050
Syringe needle BD 305167
0.2um sterilizng bottles Thermo Scientific 566-0020
20 ml syringes BD 302830
0.2um filters Thermo Scientific 723-2520
wooden sticks Grainger 42181501
Saran wrap Santa Cruz Biotechnologies sc-3687
Plates bacteria Falcon 351029
Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood Baker SG504
Hemacytometer Sigma Z359629
Bacteria incubator Thermo Scientific IGS180
Tissue culture Incubator NuAire NU-8700
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope Nikon NIKON-DIAPHOT-200
Cage Incubator Haison Custom
Scanford FACScan analyzer  Stanford and Cytek upgraded FACScan Custom
Pipette Aid Drummond 4-000-110
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) Gilson F144802, F123601, F123602
pH meter Mettler Toledo 30019028
forceps FST 11000-12
1 L flask Fisherbrand FB5011000 
Autoclave machine Amsco 3021
Stir magnet plate Bellco 7760-06000
Magnet stirring bars Bellco 1975-00100
Spectrophotometer Beckman DU 640
Scanford FACScan analyzer Cytek Biosciences Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan
Software
Microscope Software (μManager) Open Imaging
Matlab Matlab Inc
Flowjo FlowJo, LLC
Automated image analysis software, CellC https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
  2. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: a dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  3. Trepat, X., Lenormand, G., Fredberg, J. J. Universality in cell mechanics. Soft Matter. 4 (9), 1750-1759 (2008).
  4. Maruthamuthu, V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Cell-ECM traction force modulates endogenous tension at cell-cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4708-4713 (2011).
  5. Fujiwara, I., Suetsugu, S., Uemura, S., Takenawa, T., Ishiwata, S. Visualization and force measurement of branching by Arp2/3 complex and N-WASP in actin filament. Biochemical and Biophysical Research Communications. 293, 1550-1555 (2002).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 97 (2-3), 163-179 (2008).
  7. LaValley, D. J., Zanotelli, M. R., Bordeleau, F., Wang, W., Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness enhances VEGFR-2 internalization, signaling, and proliferation in endothelial cells. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 044001 (2017).
  8. Mason, B. N., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness: a regulator of cellular behavior and tissue formation. Engineering Biomaterials for Regenerative Medicine: Novel Technologies for Clinical Applications. Bhatia, S. K. , Springer. New York, NY. 19-37 (2012).
  9. El-Mohri, H., Wu, Y., Mohanty, S., Ghosh, G. Impact of matrix stiffness on fibroblast function. Materials Science and Engineering: C. 74, Supplement C 146-151 (2017).
  10. Asano, S., et al. Matrix stiffness regulates migration of human lung fibroblasts. Physiological Reports. 5 (9), (2017).
  11. Burgess, J. K., Mauad, T., Tjin, G., Karlsson, J. C., Westergren-Thorsson, G. The extracellular matrix: the under-recognized element in lung disease. The Journal of Pathology. 240 (4), 397-409 (2016).
  12. Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
  13. Jackson, K. A., Iwamoto, M., Swerdlow, D. Pregnancy-associated listeriosis. Epidemiology and Infection. 138 (10), 1503-1509 (2010).
  14. Theriot, J., Rengarajan, M. Exploitation of host cell processes for bacterial cell-to-cell spread. The FASEB Journal. 28, 1 Supplement (2014).
  15. Pollard, T. D., Beltzner, C. C. Structure and function of the Arp2/3 complex. Current Opinion in Structural Biology. 12 (6), 768-774 (2002).
  16. Pollard, T. D. Cellular motility powered by actin filament assembly and disassembly. Harvey Lectures. 98, 1-17 (2002).
  17. Reed, S. C., Lamason, R. L., Risca, V. I., Abernathy, E., Welch, M. D. Rickettsia actin-based motility occurs in distinct phases mediated by different actin nucleators. Current Biology. 24 (1), 98-103 (2014).
  18. Gerbal, F., Chaikin, P., Rabin, Y., Prost, J. An elastic analysis of Listeria monocytogenes propulsion. Biophysical Journal. 79 (5), 2259-2275 (2000).
  19. Weber, I. Is there a pilot in a pseudopod. European Journal of Cell Biology. 85 (9-10), 915-924 (2006).
  20. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76 (3), 505-517 (1994).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
  22. Rengarajan, M., Hayer, A., Theriot, J. A. Endothelial cells use a formin-dependent phagocytosis-like process to internalize the bacterium Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005603 (2016).
  23. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11 (10), 1212-1218 (2009).
  24. Bastounis, E., et al. Both contractile axial and lateral traction force dynamics drive amoeboid cell motility. The Journal of Cell Biology. 204 (6), 1045-1061 (2014).
  25. Georges, P., Miller, W., Meaney, D., Sawyer, E., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  26. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
  27. Engler, A., Bacakova, L., Newman, C., Hategan, A., Griffin, M., Discher, D. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  28. Yam, P. T., Theriot, J. A. Repeated cycles of rapid actin assembly and disassembly on epithelial cell phagosomes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5647-5658 (2004).
  29. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
  30. Selinummi, J., Seppala, J., Yli-Harja, O., Puhakka, J. A. Software for quantification of labeled bacteria from digital microscope images by automated image analysis. BioTechniques. 39 (6), 859-863 (2005).
  31. Gui, L., Wereley, S. T. A correlation-based continuous window-shift technique to reduce the peak-locking effect in digital PIV image evaluation. Experimental Fluids. 32, 506-517 (2002).
  32. del Alamo, J. C., et al. Spatio-temporal analysis of eukaryotic cell motility by improved force cytometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13343-13348 (2007).
  33. Hur, S. S., et al. Roles of cell confluency and fluid shear in 3-dimensional intracellular forces in endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11110-11115 (2012).
  34. Banerjee, I., et al. Cyclic stretch of embryonic cardiomyocytes increases proliferation, growth, and expression while repressing Tgf-β signaling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 79, 133-144 (2015).
  35. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 7 (3), 1002005 (2011).
  36. Wood, J. A., Liliensiek, S. J., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 3 (3), 1620-1639 (2010).
  37. Kohn, J. C., Lampi, M. C., Reinhart-King, C. A. Age-related vascular stiffening: causes and consequences. Frontiers in Genetics. 6, 112 (2015).
  38. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  39. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
  40. Onken, M. D., Mooren, O. L., Mukherjee, S., Shahan, S. T., Li, J., Cooper, J. A. Endothelial monolayers and transendothelial migration depend on mechanical properties of the substrate. Cytoskeleton (Hoboken). 71 (12), 695-706 (2014).
  41. Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
  42. Wu, T. -C., Belteton, S., Pack, J., Szymanski, D. B., Umulis, D. LobeFinder: a convex hull-based method for quantitative boundary analyses of lobed plant cells. Plant Physiology. 171 (4), 2331-2342 (2016).
  43. Czuczman, M. A., et al. Listeria monocytogenes exploits efferocytosis to promote cell-to-cell spread. Nature. 509 (7499), 230-234 (2014).
  44. Liebhold, A. M., Tobin, P. C. Population ecology of insect invasions and their management. Annual Reviews in Entomology. 53, 387-408 (2008).
  45. Miller, C. J., Davidson, L. The interplay between cell signaling and mechanics in developmental processes. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 733-744 (2013).
  46. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), Cambridge, England. 1407-1420 (2010).
  47. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), 46889 (2012).
  48. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. 10 (44), 8829-8837 (2014).
  49. Tse, J., Engler, A. Stiffness gradients mimicking in vivo tissue variation regulate mesenchymal stem cell fate. PLoS ONE. 6 (1), 15978 (2011).
  50. Ananthakrishnan, R., Ehrlicher, A. The forces behind cell movement. International Journal of Biological Sciences. 3, 303-317 (2007).
  51. Kolahi, K. S., et al. Effect of substrate stiffness on early mouse embryo development. PLoS ONE. 7 (7), 41717 (2012).
  52. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  53. Kiener, H. P., Lee, D. M., Agarwal, S. K., Brenner, M. B. Cadherin-11 induces rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes to form lining layers in vitro. American Journal of Pathology. 168, 1486-1499 (2006).
  54. Kaliman, S., Jayachandran, C., Rehfeldt, F., Smith, A. -S. Novel growth regime of MDCK II model tissues on soft substrates. Biophysical Journal. 106 (7), 25-28 (2014).
  55. Saunders, R. L., Hammer, D. A. Assembly of human umbilical vein endothelial cells on compliant hydrogels. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 60-67 (2010).
  56. Wu, J., Weening, E. H., Faske, J. B., Hook, M., Skare, J. T. Invasion of eukaryotic cells by Borrelia burgdorferi requires β1 integrins and Src kinase activity. Infection and Immunity. 79 (3), 1338-4138 (2011).
  57. Stroka, K. M., Aranda-Espinoza, H. Endothelial cell substrate stiffness influences neutrophil transmigration via myosin light chain kinase-dependent cell contraction. Blood. 118 (6), 1632 (2011).
  58. Keer, L. M. Stress distribution at the edge of an equilibrium crack. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 12 (3), 149-163 (1964).
  59. Bastounis, E. E., Theriot, J. A. A highly quantitative multi-well format assay for studying the effect of extracellular matrix mechanics on the bacterial infection of endothelial cells. Athens Journal of Sciences. 4 (1), 7-20 (2017).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 137 сторонник mammalian клеток бактериальной инфекции эндотелий проточной цитометрии тяги силовой микроскопии Полиакриламидные гидрогели иммуноокрашивания субстрат жесткость
Несколько хорошо формат на основе полиакриламида Assay для изучения влияния внеклеточной матрицы жесткости на бактериальные инфекции адэрентных клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bastounis, E. E., Ortega, F. E.,… More

Bastounis, E. E., Ortega, F. E., Serrano, R., Theriot, J. A. A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells. J. Vis. Exp. (137), e57361, doi:10.3791/57361 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter