Summary
Denne protokollen viser en metode for isolering av primære menneskelige decidual celler fra fosterets membraner av begrepet placentae som kan brukes til en rekke programmer (dvs. immunocytochemistry, flowcytometri, etc.) sikter å studere rollen til ulike celle populasjoner i svangerskapet komplikasjoner.
Abstract
Decidua, også kjent som gravid endometrium, er en kritisk viktig reproduktive vev. Decidual celler, består hovedsakelig av decidualized stromal celler og immunceller, er ansvarlig for utskillelsen av hormonelle og provoserende faktorer som er kritiske for vellykket blastocysten implantasjon, placental utvikling og spille en rolle i den initiering av arbeidskraft på sikt og tidlig. Mange graviditet komplikasjoner kan oppstå fra forstyrrelser av en fin balanse mellom ulike celle populasjoner bestående av decidua. Endringer i andelen av spesifikke decidual celletyper kan forstyrre prosessene avgjørende og øke risikoen for å utvikle alvorlige komplikasjoner i svangerskapet, som fosteret implantasjon svikt, intrauterine vekst begrensning, preeclampsia og tidlig arbeid. Protokollen skissert her viser en kostnadene og tiden effektiv metode for isolering av primære decidual menneskeceller samlet fra fosterets membraner av begrepet placentae. Ved å kombinere enzymatisk fordøyelsen og mild mekanisk avbrudd av decidual vev, ble en høy avkastning decidual celler oppnådd med nesten ingen plasmocitara forurensning. Viktigere, isolerte decidual celler var preget (stromal celler (55-60%), leukocytter (35%), epiteliale (1%) eller trophoblast (0,01%) celler) og vedlikeholdes høy levedyktighet (80%) som ble bekreftet av multicolor tenkelig flyt cytometri analysen. Denne protokollen gjelder for decidua parietalis og kan tilpasses første og andre trimester placentae. Isolerte decidual celler kan brukes til en rekke eksperimentelle programmer å forstå rollen av ulike decidual celle undergrupper i svangerskapet komplikasjoner.
Introduction
Endometrium, en av de mest aktive voksne kvinnelige vev, gjennomgår dramatiske remodeling hver menstruasjonssyklusen svar til stimulering av ovarian hormoner, østrogen (E2) og progesteron (P4). Decidua, også kjent som gravid endometrium, er en kritisk viktig reproduktive vev som dannes ved slutten av den postovulatory fasen som følge av P4-drevet differensiering etter E2 dominerende proliferativ fase. Decidual cellene er ansvarlige for utskillelsen av hormonelle faktorer for vellykket blastocysten implantasjon og utvikling av utero-placental grensesnittet for å opprettholde mødre toleranse føtal allograft.
Decidualization kreves for implantasjon og påfølgende remodeling av decidual spiral arteriene. Endometrial stromal celler gjennomgå decidualization, under kontroll av P4 og cAMP, under sent luteal fase av menstruasjonssyklusen1. Denne prosessen er igangsatt rundt blodkar og sprer seg gjennom det stroma, tyder sin rolle i blodkar remodeling og leukocytter handel regulering. Denne mobilnettet transformasjonen er preget av en sirkulær morfologi, økt kjernefysiske størrelse og utvidelse av rough endoplasmatiske retikulum og Golgi apparatet2. Decidualized stromal cellene kan produsere paracrine faktorer støtte blastocysten implantasjon og preget av utskillelsen av utallige hormoner (i.e. prolaktin), angiogenic vekstfaktorer, insulin vekstfaktor bindende protein-1 (IGFBP-1), prostaglandin (PG) E (stimulator intracellulær Camp), cytokiner, ekstracellulær matrix komponenter og næringsstoffer avgjørende for placental implantation og utvikling3,4,5,6 .
Befolkningen decidual cellen utelukkende består ikke av decidualized stromal celler, men inneholder også store, graviditet-spesifikke decidual leukocytter populasjoner. Decidualization innebærer forbigående lokaliserte oedema og tilstrømningen av naturlige killer (NK) celler, T-celler, dendrittiske celler og makrofager. Den største leukocytter subpopulasjon er livmor NK celler, bestående av ca 50-70% av alle mors leukocytter infiltrert decidua som er en kilde til cytokiner og angiogenic faktorer som kan hjelpe i decidualization prosessen og øke i nummeret gjennom hele svangerskapet7. Makrofager, er den nest største subpopulasjon av immunceller, finnes rundt implantasjon området og øke under graviditet8. De er en kilde til cytokiner og vekst faktorer som koloni stimulerende faktor (CSF-1)9, tumor nekrose faktor î± (TNFα)10 og prostaglandin (PG) E11.
Gjennom hele svangerskapet, og før begrepet arbeidskraft er decidua en stor kilde av cytokiner og chemokines ansvarlig for mors perifere leukocytter aktivisering og påfølgende overføring inn i livmor vev å initiere arbeid. Dyrestudier viste at mange pro-inflammatoriske cytokiner er opp-regulert i musen decidua under arbeid, som TNF-a, IL-6, IL-12, og IL-1b12. I den menneskelige decidua vise pro-inflammatoriske cytokiner IL-1b, IL-6 og IL-8 (store nøytrofile chemoattractant) høyere uttrykk under arbeid ikke i arbeidskraft13. Disse utskilles cytokiner føre en aktivisering og tilstrømningen av leukocytter til decidual vev14; en økning i decidual macrophage og nøytrofile infiltrasjon i både menneskelige og rotten er sett under begrepet arbeid, med decidual infiltrasjon foran myometrial 4-fold større, som indikerer en kaskade av aktivisering mellom denne to tilstøtende livmor vev 15. dette infiltrere leukocytter produsere PGs i stand til å aktivere synkron sammentrekninger av myometrium16, matrise metalloproteinases (MMPs) å starte membran ruptur17,18, samt Pro-inflammatoriske cytokiner å forsterke livmor aktiveringsprosessen ("cytokin storm").
På grunn av mange viktige funksjoner i decidual celler, som spiller en avgjørende rolle i implantasjon prosessen, opprettholde mødre fosterets toleranse i tidlig svangerskapet og delta i aktiviseringen arbeid på sikt, kan ulike patologi oppstå under graviditet. For eksempel kan (1) ufruktbarhet tilbakevendende implantasjon feil og tilbakevendende graviditet skyldes feil på decidual modning; (2) intrauterine vekst restriksjonskoder (IUGR) og preeclampsia feilaktig utvikling og dysfunksjon av decidua/morkaken eller kompromittert vaskulær transformasjon i decidual myometrial krysset; og (3) tidlig fødsel som skyldes tidlig decidual aktivering.
I lys av disse store lidelser, kombinert med de etiske og praktiske begrensningene av menneskelig i vivo studier, etablere primære menneskelige decidual cellelinjer er avgjørende for i vitro analyse å bedre forståelse og bedre klinisk behandling av svangerskapet komplikasjoner. Målet med vår forskning var derfor å utvikle en protokoll som tillater isolering av menneskelige primære decidual celler med høyt yield og levedyktighet fra fosterets membraner av begrepet placentae. Denne gjeldende protokollen tydelig beskriver en tid - og kostnadseffektive metode for isolering av bestemte undergrupper av decidual celler som brukes til en rekke i vitro analyser. Karakterisering av overflod og fenotypen av decidual undergrupper på sikt og sammenligning med første eller andre trimester er avgjørende å definere sine roller gjennom menneskelige svangerskapet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Placentae er samlet inn fra sunn sikt, ikke i arbeid kvinner gjennomgår valgfag cesarean deler. Innsamling, behandling og fjerning av menneskelig prøver overholder retningslinjene av Mount Sinai Hospital etikk. En skriftlig samtykke er innhentet fra hver pasient. Denne studien er godkjent av forskning etikk styret på Mount Sinai Hospital.
1. forberedelser
Merk: Alle trinn må utføres under avtrekksvifte og alle kirurgisk utstyr må steriliseres via autoklav tidligere å plasseringen inne avtrekksvifte. Alle andre materialer (flasker, 50 mL rør, etc.) må steriliseres med 70% etanol løsning. Alltid bruk personlig verneutstyr hele tiden når du arbeider med biologisk farlige avfall (laboratoriefrakk, hansker, langhåret knyttet tilbake, etc.).
-
Enzymatisk fordøyelsen løsning (endelig løsning: 200 mL)
- Pipetter 180 mL av HBSS-/ - i et 500 mL beaker, legge sterilt gripende magnet og plassere lage platen ved romtemperatur.
- Veie og legge til følgende HBSS-/-løsningen sakte og sekvensielt: 20 mL FBS, 400 mg Collagenase 2 ([ferdig] = 2 mg/mL), 20 mg soya bean trypsin hemmer ([ferdig] = 0,1 mg/mL), 30 mg DNase 1 ([ferdig] = 0,15 mg/mL), og 200 mg BSA ([ferdig] = 1 mg/mL)
- Angi omrøring til middels hastighet, og la blandingen å røre i 10-20 min (cover med tinn folie eller parafin film under omrøring).
- Hell blandet løsningen i en 250 mL glassflaske med en plast trakt og plasser i avtrekksvifte.
- Passere løsningen gjennom en plast toppen filtrering enhet (0.22 μm membran filter, 500 mL), aliquot 20 mL til 50 mL rør (10 rør totalt) og butikk på 20 ° C før bruk.
-
RPMI 1640 Media (2% vaske løsning og 10% full vekst medium)
- Kombiner RPMI 1640 og FBS i ett glassflaske i avtrekksvifte.
- 2% FBS løsning Kombiner 490 mL av RPMI 1640 og 10 mL FBS.
- 10% FBS løsning Kombiner 450 mL RPMI 1640 og 50 mL FBS.
- Pipetter 500 μL normocin i 500 mL glassflaske fra det tidligere trinnet med RPMI media og FBS (50 mg/mL lager, 0,05 mg/mL arbeider konsentrasjon).
- Pass media gjennom et 0.22 μm membran filter og lagre i en 500 mL glassflaske på 4 ° C før bruk.
- 30 min før du starter eksperimentet, plasserer en 20 mL aliquot av frosne enzymatisk fordøyelsen løsning på 37 ° C perle badekar, legge til 2% FBS og 10% FBS RPMI 1640 media i 37 ° C perle badekar, slå på rock vannbad og satt til 37 ° C , 2 g og sett et Temperaturregulert sentrifuge til 4 ° C.
2. samling av Decidual begrepet Placental membraner
- Plasser flasker med HBSS + +, HBSS-/-fem 50 mL rør i et stativ under avtrekksvifte. Pipetter 25 mL av HBSS +/ + i en tube.
-
Med hansker hendene ta begrepet morkaken ut fra beholderen brukes til å transportere fra teateret operasjonssalen. Plasser morkaken på bleie pad (mors side opp) og spre fosterets membraner ut ved hjelp av saks og tang.
- Lå overlappende bleie pads på avtrekksvifte.
- Bruke en separat bleie vende morkaken så mors side er ansiktet opp.
- Finne poenget med membran brudd og gjøre incisions tillate membranen brette og ligge flatt på fumehood overflaten.
Merk: Når membranen er trukket tilbake fra morkaken, decidua blir med forsiden opp hviler på det plasmocitara laget med amnion laget på baksiden.
- Bruke plast celle skraper, forsiktig skrape decidual vev av plasmocitara og sted i 50 mL tube inneholder 25 mL HBSS +/ +.
- Skrape membranen med moderate trykk. Gjelde ikke for mye press som det kan resultere i plasmocitara forurensning. Samle små blodpropp i tillegg, disse inneholder noen decidual celler.
Advarsel: Etter decidual samling, morkaken må være pakket i en biohazard plast kasse og frosset i en 20 ° C fryser før riktig avhending (ifølge institusjonelle reglene). Blodig bleie pads må være innpakket i en sel stramme plastpose og avhendes i en biohazard safe.
3. vask og enzymatiske fordøyelsen av Decidual vev
- Vask samlet vev ved forsiktig risting 50 mL tube for hånd og sende det gjennom en 250 μm metall sil (250 μm, størrelse 60 mesh) hvile over et sterilt prøven (urin) beholder.
- Gjenta vask to ganger med HBSS +/ + og to ganger med HBSS-/ - i frisk rør for hver vask. (final vasker med HBSS-/-tillater fjerning av kalsium og magnesium i HBSS +/ +, som ellers ville forstyrre følgende enzymatisk fordøyelsen prosessen).
MERK. Under vask trinnene blir plasmocitara vev forurensning tydelig decidual vevet er lys rosa farge og amorf, mens plasmocitara er hvit, tett og trevlet. Derfor kan plasmocitara forurensning lett fjernes med tang. - Eventuelt hvis decidual vevet er tykk, overføre det til en steril 10 cm diameter Petriskål og fortsetter å hakke av vev med to motstridende skalpeller i fatet.
-
Plasser vasket vevet i sterilt 50 mL tube som inneholder 100 mg av vev/mL av enzymatisk fordøyelsen løsning (se forberedelser).
- Som et referansepunkt, sikre at nivået av decidual vev når 5-10 mL merket på 50 mL tube.
- Bruke ca 20 mL av enzymatisk fordøyelsen løsning (forberedt i trinn 1.1) å fordøye den totale decidua fra en hele begrepet fosterets membran.
- Forsegle hetten av rør med parafin filmen (forsegle røret tett og vikle parafin filmen rundt cap og toppen av røret) under kulturen hette og Inkuber decidual vev på 37 ° C for 20 min i et risting vannbad (145 rpm 2 g).
- Etter inkubasjon fjerne parafin filmen og sterilisere overflaten av røret som inneholder fordøyd vev med 70% etanol og bringe under avtrekksvifte. Riste røret kort for hånd.
- Samle celle suspensjon gjennom metall silen (250 μm, størrelse 60 maske) i en ny sterilt prøven container. Fortynn med en like volum (20 mL) RPMI + 10% FBS med 0,1% normocin for å stoppe den enzymatiske reaksjonen. Gå direkte til sentrifugering trinn 4.1.
- Eventuelt plassere gjenværende ufordøyd vevet tilbake i en ny 50 mL tube med 20 mL frisk enzymatisk fordøyelsen og gjenta fordøyelse (20 min, 37 ° C, risting vannbad).
- Hvis en andre fordøyelsen er nødvendig, sett første røret med cellen suspensjon på is (cover med parafin film å holde sterile). Gjenta trinn 3.5-3.6 og kombinere to celler suspensjoner.
4. generere en enkeltcelle suspensjon
- Sentrifuge celle suspensjon (420 g, 4 ° C, 11 min).
- Fjern nedbryting og resuspend cellene i 40 mL RPMI + 2% FBS med 0,1% normocin ("vaskebuffer").
Merk: Cellen pellet vil være løs og geléaktige på grunn av røde blodlegemer forurensning, Sug opp nedbryting med forsiktighet. Fjerning av øvre fase med en manuell pipette kan være nødvendig. - Gjenta sentrifugering 420 g på 4 ° C for 11 min.
- Nøye fjerne nedbryting (som nevnt i Note trinn 4.2) og resuspend celle pellet i 5 mL av vaskebuffer og Legg 35 mL av røde blodlegemer lyseringsbuffer i samme rør.
Merk: Hvis pellet er store eller svært blodig, det kan deles inn i to rør for røde blodlegemer lysis trinn ved å legge 10 mL av vaskebuffer og dele likt i to rør og deretter legge til 35 mL av røde blodlegemer lyseringsbuffer hver rør. - Ruge på is 20 min. kort vortex lysrør i begynnelsen og slutten av den inkubering å lyse røde blodlegemer.
- Sentrifuge 420 g i 11 minutter på 4 ° C.
- Nøye, Fjern nedbryting og resuspend pellet i 40 mL vaskebuffer.
- Cellene passere et 70 μm nylon filter fjerne celle klumper.
- Sentrifuge 420 g for 11 min på 4 ° C.
- Fjerne nedbryting og resuspend celle pellet i 10 mL av komplett medium (RPMI 10% + FBS med 0,1% normocin).
-
Telle celler ved hjelp av trypan blå farge-utestenging hemocytometer prosedyren som beskrevet nedenfor:
- Under panseret kultur Pipetter forsiktig celle suspensjon opp og ned 3 x å grundig blande før kombinere med trypan blå. I en 1,5 mL tube forberede celle suspensjon, utvannet 1:2 (kombinere 20 μL trypan blå løsning) og 20 μL decidual celle suspensjon. Nøye blanding trypan blå-cell løsningen av pipettering opp og ned et par ganger (denne løsningen ikke er sterile).
- Plasser hemocytometer på scenen av mikroskopet med glass dekkglassvæske på toppen.
Merk: Hemocytometer er et mikroskop lysbilde med rutenett for å gi ni store firkanter delt på tre linjer. Hver store plassen har et område på 1 mm2, og dybden av væske i kammeret er 0,1 mm. Volumet av væske som fyller hver store plassen er derfor 1 mm * 1 mm * 0,1 mm = 0,1 mm3= 10-4 mL. - Sakte legge 10 μL trypan blå-celle blandingen inn i sporet for hemocytometer, slik at kapillær handling å spre celle blandingen over hele lysbildet (Stopp før blandingen fyller godt).
- Vis cellene under et mikroskop (på 10 X forstørrelse) og telle alle hvit/grønn celler som ekskluderer trypan blå (disse er levedyktig cellene) i fire store ytre kvadrater av hemocytometer. Når teller celler som berører linjen, telle bare de touch høyre og øvre linjer, men ikke de berøre høyre og nederste linjene. Tell ikke mørk blå celler. blå farge indikerer at cellen er død som trypan blå farge kan lett trenge gjennom plasma membranen i cytoplasma.
- Beregne antall levedyktig celler i 1 mL av cellen suspensjon (X):
2 = fortynningsfaktoren
10.000 = konverteringsfaktor (1 mL = 1 cm3 = 10, 000 * 0,1 mm3)
- Fortynne decidual cellene til en ønskelig siste konsentrasjon i RPMI + 10% FBS (vekst medium).
Merk: For vev kultur plating, Pipetter 2 * 106 celler/godt i en plast 6-vel-plate, 10 * 106 celler i en 10 cm plast plate eller 75 000 celler til et glass dekkglassvæske.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å validere effektivitet og levedyktigheten til isolerte cellene, de var preget av to metoder: flow cytometri og immunocytochemistry (ICC). 4 celle populasjoner var rettet; decidualized stromal celler ble oppdaget av anti-vimentin antistoffer, pan-leukocytter markør CD45 ble brukt til å identifisere decidual immunceller, cytokeratin ble brukt til å oppdage epithelial/endotelceller og til slutt cytokeratin 7 ble brukt til å oppdage noen potensielle trophoblast (plasmocitara eller placental) forurensning.
For karakterisering av multicolor tenkelig flowcytometri, var ferske isolert decidual celler farget med en fixable fargestoff å bestemme mobilnettet levedyktighet. Cellene ble permeabilized og fast, etterfulgt av farging med fluorochrome-konjugerte musen monoklonale antistoffer målretting vimentin-APC, CD45-APC-H7, cytokeratin-FITC og cytokeratin 7-PerCP. Antistoff informasjon er oppført i Tabellen for materiale. Fast og farget celler ble lagret på 4 ° C over natten i flekker buffer for å hindre av tandem fargestoff og kjøre dagen på bilde stream MK2 tenkelig flyt cytometer. Analysen ble utført ved hjelp av en programvare. Celle rusk og aggregat ble utelukket av føljetong gating bruker tre sekvensiell funksjonen/maske kombinasjoner (figur 1A-B). Fluorescens Minus én (FMO) gating kontroller ble brukt til å identifisere positive decidual celle populasjoner og enkelt flekken celler ble brukt for kompensasjon (figur 2). Siste dot tomter demonstrere positivt farget celle befolkningen på fire markørene (figur 2) og mobilnettet levedyktigheten til 80% (figur 1 c). Representant bilder av positivt farget celler kan ses i figur 1 d. På denne måten, fant vi at befolkningen hovedsakelig består av stromal celler (55-60%), leukocytter (35%), epiteliale (1%) eller trophoblast (0,01%) celler (figur 1E). Forsøket ble gjentatt tre ganger. Disse resultatene bekrefter renhet (fravær av trophoblast forurensning fra plasmocitara) og høy levedyktigheten til primære menneskelige decidual celler samlet og isolert fra fosterets membraner av begrepet placentae.
I et separat ICC eksperiment, var fersk isolert decidual celler frø på glass coverslips (75 000 celler/dekkglassvæske), kan feste og forble i kulturen i 48 timer. Media ble endret etter 24 timer for å fjerne ikke-tilknyttede døde celler. Cellene ble deretter fast med 50% aceton - 50% metanol, permeabilized med 0,02% ikke-ioniske surfactant og uspesifikke binding ble blokkert med blokkering løsning. Cellene ble deretter farget med musen monoklonale antistoffer: anti-CD45 (pan-leukocytter markør), anti-cytokeratin (tarmepitelet markør) og anti-cytokeratin 7 (trophoblast markør), og geit polyklonale anti-vimentin antistoff (stromal cell markør). Esel anti-geit og esel anti-mus ble brukt som sekundær antistoffer. DAPI ble brukt stain kjerner. Musen IgG, geit IgG og sekundære antistoffer alene ble brukt som negative og spesifisitet. Bildene ble tatt på 20 X forstørrelse på en roterende plate AC confocal mikroskop. Antistoffer brukes er oppført i Tabellen for materiale og representant bilder vises i Figur 3. Våre visuell observasjon indikerer at flertallet av festet primære decidual celler er vimentin-positive stromal celler (ca. 95%), med et lite antall av leukocytter (ca 1-2%), epiteliale (ca. 1%) og trophoblast celle populasjoner (enkeltceller var oppdaget regnskap for < 0,01% av alle). Hovedforskjellen mellom flyt cytometric og ICC resultater er nedgangen i CD45 positiv leukocytter befolkningen oppdaget av flowcytometri. Denne uoverensstemmelsen kan forklares med metodene som ble det gjennomført to eksperimenter: i flyt cytometri analyse, isolerte decidual celler ble umiddelbart behandlet og farget, betydning leukocytter befolkningen ble inkludert i analysen. Med ICC, var totalt decidual celle suspensjonen belagt og kultivert i 48 timer i media som var mest støtte feste stromal og epithelial celler, men ikke immunceller. Etter 24 h ble immunceller som ikke fulgte fjernet under media endring, regnskap for forskjellen i resultatene presenteres av disse to metodene. Vi konkluderte med at for å studere leukocytter subpopulasjoner i menneskelig decidua fra komplisert svangerskap ekstra forholdsregel bør brukes ved eliminering av leukocytter befolkningen.
Figur 1: Gating strategi for decidual celle befolkningen diskriminering. (A) fersk isolert fast decidual celler var opprinnelig gated for å utelate celle doublets, og (B) senere gated bruker tre sekvensiell funksjonen/maske kombinasjoner for å ekskludere celle rusk. (C) lever celler (rosa gate, 80% av befolkningen) ble differensiert fra døde celler (blå gate, 20% av befolkningen) bruker en fixable levedyktighet fargestoff. (D) representant bilder av decidual celler farget med levedyktighet markør og fire fluorescerende-konjugerte antistoffer (Ab) (vimentin-APC, CD45-APC-H7, cytokeratin-FITC og cytokeratin 7-PerCP). Prikket skala bar tilsvarer 7 μm. (E) når en rusk-free, live celle befolkningen var bestemt, stikkordmerker ble brukt til å bestemme prosenter av hver celle i befolkningen decidual cellen. Tallene 1B og 1 Crepresenterer hvert punkt en decidual enkeltcelle. Tallene 1A og 1 Cviser fargeområdet for dot tomter cellen tetthet, rødt bety svært tette celler og blå mindre tett celler. Dataene som presenteres her er representant for 3 biologiske gjentak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representativeflow cytometric analyse av primære decidual menneskeceller med FMO gating tomter. Representant farge dot plott av celler isolert fra begrepet decidua og farget med (A) vimentin-APC (stromal cell markør), (B) CD45-APC-H7 (leukocytter markør), (C) cytokeratin-FITC (tarmepitelet markør) og (D) cytokeratin 7-PerCP (trophoblast markør) sammen med hver respektive FMO-kontroll. Fluorescerende-Minus-en (FMO) kontroller, rør som inneholder full antistoffer cocktail minus markøren i spørsmålet og forberedt identisk med fullt farget eksperimentelle prøven, ble brukt under flyt cytometri dataanalyse for å fastslå sanne positiv decidual celle populasjoner. FMO kontroller viser relativ bakgrunnen og gi nøyaktig gating sant positive signaler. Dataene som presenteres her er representant for 3 biologiske gjentak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant Immunocytochemical analyse av primære decidual menneskeceller. Primære decidual menneskeceller ble dyrket på glass coverslips 48 h, med medier som er byttet etter 24 h. celler ble løst med aceton-metanol og farget med monoklonalt musen anti-CD45 (leukocytter markør), anti-cytokeratin (tarmepitelet markør) og anti-cytokeratin 7 (trophoblast markør) antistoffer og geit polyklonale anti-vimentin antistoff (stromal cell markør). Representant bildene viser (A) vimentin-positive fibroblaster (sekundær Abs: esel anti-geit), (B) CD45 + leukocytter (sekundær Abs: esel anti-mus), (C) cytokeratin positive epitelceller (sekundær Abs: esel anti-mus) og (D) cytokeratin 7-positive trophoblast celler (sekundær Abs: esel anti-mus) ble oppdaget (røde flekker). DAPI flekker ble brukt fargestoff kjerner i celler (blå flekker). Non-spesifikke musen og geit IgG (M IgG og G IgG) ble brukt som negative kontroller, utelater primære Abs ble brukt som sekundær antistoff kontroller (M 2nd bare og G 2nd bare). Bildene er tatt på 20 X forstørrelse på DMI spinning plate AC confocal mikroskop. Skalere barer = 32 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her viser en kostnadene og tiden effektiv metode for å isolere primære decidual celler samlet fra fosterets membraner av hele human frist placentae som er svært tilgjengelig og grei. Suksessen til denne protokollen er avhengig av to viktige faktorer, (1) effektiviteten av decidual skrape fra plasmocitara laget av fetal membraner og (2) omsorg som decidual cellene behandles gjennom protokollen. Det er viktig at plasmocitara vev forurensning er kontrollert ved å sikre at ingen er tilfeldigvis inkludert under decidual skraping og ved å identifisere og fjerne enhver kontaminering under vask trinnene (forskjellen i decidua og plasmocitara morfologi tillater for enkel fjerning av plasmocitara som kan innhentes ved et uhell med decidua). Decidual celler er skjøre derfor raske og hyppige pipettering kan resultere i redusert levedyktighet. Vi anbefaler deretter at innstillingen pipette ejektor hastighet bør forbli på treg og minimal pipettering bør brukes når du blander celler.
En av måtene som forhindrer denne protokollen trophoblast forurensning er ved utelukkende å samle decidua fra fosterets membraner av morkaken (bestående av decidua parietalis), unntatt samlingen av den decidua basalis ved å ta biopsies fra morssiden av morkaken. Derfor, mens våre nåværende protokollen forbedrer renheten av befolkningen decidual celle isolerer vi, utelukker det en del av decidua (dvs. decidua basalis) som kan være som en begrensning for forskning målretting denne delen av decidua eller begge deler av decidua er nødvendig. Denne ansvarsbegrensningen omfatter største begrensningen av denne studien. I tillegg isolering decidual celler fra menneskelige pasienter gir en mer biologisk relevante innsikt i decidual og graviditet forskning, mindre manipulering og færre tidsperioder kan studeres sammenlignet med gnager-baserte studier av etiske grunner.
Gjennom denne protokollen, det er trinn som kan vise seg for å opprette vanskelighetsgrad, og hvis ikke skikkelig dempet kan påvirke celle avkastning og levedyktighet. For å circumnavigate dette, må endringer gjøres. Det viktigste er å sikre at decidual skrape av fetal membraner er tilstrekkelig (trinn 2,4); menneskelig variasjon, kanskje hver morkaken er forskjellig i forhold til decidual vev, vev konsistens og nivået på vev tørrhet. Det er viktig å modulere skrape for å sikre at bare decidua blir fjernet. Hvis decidua og membraner er tørr, helles PBS-/-kan på membraner å tillate enklere skraping. Det andre trinnet er den røde blodlegemer lysis av decidual celle suspensjon (trinn 3,4). Som nevnt, hvis cellen pellet er stor og inneholder en høy mengde blod, kan pellet deles i to rør til effektivisere den lysing. Hvis det er fortsatt røde blodlegemer etter dette trinnet kan det være behov for å dele pellet i flere rør for maksimal effektivitet.
Mens ulike decidual isolasjon protokoller begrepet morkaken og isolering av endometrial cellen fra ikke-gravide kvinner som gjennomgår hysterectomies har vært publisert tidligere18,19, ta disse metodene ikke ulike begrensninger, for eksempel lav celle levedyktighet og tilstøtende vev forurensning. Vi vurderte disse rammen når du utformer protokollen presenteres her, som fører til større celle avkastning, økt levedyktighet og redusert risiko for smitte fra omkringliggende vev. Automatisk dissociations har tidligere blitt brukt til mekanisk bryte ned decidual vev19,20. Denne metoden er relativt hardt som det inkluderer en sprek mekanisk dissosiasjon der decidual vevet samles i et rør, settes inn i maskinen som fungerer på samme måte til en blender raskt roterende saks å bryte ned vev, noe som resulterer i redusert celle levedyktighet. Vår nye metoden beskrevet her kombinerer en kort (20 minutter) enzymatisk fordøyelsen kombinert med milde rocking vann bad bevegelser opptrer i stedet for mekaniske kraften til vev. Enzymatisk fordøyelsen løsningen er utformet for å øke celle levedyktighet og avkastning, som inneholder (1) collagenase å fordøye den ekstracellulære matrisen av decidual vev; (2) en soyabønner trypsin hemmer å hindre uspesifisert fordøyelsen skyldes en gjenværende trypsinolytic aktivitet av collagenase; (3) DNase 1 fjerne frittflytende DNA (4) fetal bovin serum (FBS) og storfe serum albumin (BSA) protein for å beskytte cellene fra over fordøyelsen. Andre store begrensning av tidligere studier ligger i faktum decidua basalis innsamlede ved å kutte øvre lag av mors side av morkaken som potensielt kan føre til trophoblastic forurensning. Vår nye protokollen isolerer decidua parietalis ved å forsiktig skrape decidua av fetal membranen (plasmocitara) og gir enkel fjerning av plasmocitara forurensning i de vask trinnene.
Derfor våre metoden gjør en ukomplisert isolering av primære decidual celler samlet inn fra placental membraner i en kort periode (hele prosessen tar ca 3 timer) høyt yield og utmerket celle levedyktighet. Når decidual celler har vært isolert kan de brukes til en rekke eksperimenter; for eksempel primære decidual menneskeceller kan bli sådd på coverslips for immunocytochemical analyse, de kan være dyrket i kultur for ulike behandlinger og manipulasjoner, samt direkte farget for multicolor flyt cytometri analyse å vurdere den sammensetning av menneskelig decidua med graviditet komplikasjoner i forsøk på å forstå rollen av ulike celle undergrupper. Mens metoden presenteres her ble brukt til å isolere celler fra begrepet morkaken (slutten av tredje trimester av menneskelig svangerskapet), kan denne protokollen også være enkelt tilpasses til først og andre trimester morkaken tillater fleksibilitet av svangerskapet scenen som en forskning er adressering.
Tidligere har publiserte protokoller brukt automatisk dissociations for å bryte fra hverandre decidual vev eller enzymatisk fordøyelsen alene21,22. Ved å kombinere en mild mekanisk kraft (med rocking vannbad på 37 ° C) og en enzymatisk fordøyelsen cocktail designet for å optimalisere både fordøyelsen og celle levedyktighet, skaper protokollen skissert ovenfor den perfekte balansen mellom cellen avkastning og levedyktighet. I tillegg har tidligere protokoller ikke klarte å nevne total-celle avkastningen innhentet fra sine isolasjoner og bare presentere celle levedyktighet prosent19. Her viser vi en høy avkastning decidual celleområde avgjøres gjennom cellen teller (alt fra 10-20 millioner per morkaken). Videre, mange av de gjeldende publikasjonene demonstrere isolering av primære decidual/endometrial celler fra mus; våre protokollen tillater for studiet av menneskelig vev, gjengi det en mer biologisk relevante kilde til celler for eksperimentering23. Denne protokollen kan også være enkelt tilpasses til først og andre trimester morkaken tillater fleksibilitet av svangerskapet scenen som en forskning er adressering. Når cellene har vært isolert, kan de brukes i en rekke eksperimentelle teknikker som immunocytochemistry, flowcytometri, protein og RNA utvinning, etterfølgende isolering av leukocytter, etc. i forsøk på å forstå rollen annerledes celle Sub-populasjoner. Identifisere ulikheter i genet og protein uttrykk i decidua mellom sunn og komplisert svangerskap (for eksempel preeclampsia eller premature arbeid) ved hjelp av sanntids PCR eller genomet bredt knyttet studiene kan gi romanen mål som kan hjelpe i utviklingen av diagnostiske og terapeutiske verktøy. I tillegg, kan endringer i forholdet decidual celler, spesielt leukocytter, som lett kan identifiseres gjennom bruk av flowcytometri også gi svar for etiologien for graviditet komplikasjoner, som endringer i begge leukocytter subpopulasjon forhold samt deres aktivisering rang som har vist seg å være modulated i både begrepet og tidlig arbeid24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke givere, RCWIH BioBank, og Mount Sinai Hospital/UHN Institutt for obstetrikk og gynekologi for de menneskelige prøvene brukt i denne studien. Vi vil gjerne takke medlemmer av lut lab, spesielt Dr. Caroline Dunk hennes hjelp med metodeutvikling. Dette arbeidet er støttet av Burroughs velkommen fondet (grant #1013759).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
References
- Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. Decidualization and relevance to menstruation. , Cambridge University press. 187-212 (1990).
- Kariya, M. Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).
- Wu, W. -X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy. Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).
- Bell, S. C. Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua. Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).
- Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. Decidual natural killer cells: key regulators of placental development. Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).
- Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy. Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).
- Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor. Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).
- Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms. Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).
- Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).
- Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).
- Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women. Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biology of Reproduction. 86, 39 (2011).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. Cytokines and infection-induced preterm labour. Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).
- Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. The role of leukocyte traffic and activation in parturition. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).
- Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface. Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).
- Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface. Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).
- Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens. Journal of Visualized experiments. 87, (2014).
- Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue. Journal of Visualized experiments. 112, (2016).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).
- Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).
