Summary
이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할 연구
Abstract
Decidua, 일컬어 임신 endometrium, 비판적으로 중요 한 생식 조직 이다. Decidualized stromal 세포와 면역 세포의 주로 구성 decidual 세포는 호르몬 및 염증 성 요소는 성공적인 blastocyst 주입, placental 개발에 대 한 중요 한 역할의 분 비에 대 한 책임은 용어 및 preterm 노동의 개시입니다. 많은 임신 합병증은 다른 세포 인구 decidua 구성의 정밀한 균형의 물결에서 발생할 수 있습니다. 특정 decidual 세포 유형의 비율 변경 수 있습니다 이러한 중요 한 프로세스를 방해 하 고 배아 이식 실패, 자궁내 성장 제한, 자간 전 증 임신의 심각한 합병증 개발의 위험을 증가 하 고 preterm 노동입니다. 여기에 설명 된 프로토콜 비용 및 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 효과적인 방법 용어 placentae의 태아 세포 막에서 수집 하는 시간을 보여 줍니다. 결합 하 여 효소 소화와 부드러운 기계적 장애 decidual 조직, 고수익 decidual 셀 chorion 오염 거의 없이 함께 얻은 것입니다. 중요 한 것은, 격리 decidual 셀 특징 이었다 (stromal 세포 (55-60%), 백혈구 (35%), trophoblast (0.01%) 세포 또는 상피 (1%)) 유지 높은 생존 능력 (80%)는 멀티 컬러 이미징 흐름 cytometry 분석 결과 의해 확인 되었다. 이 프로토콜에 decidua parietalis 이며 첫 번째 및 두 번째 임신 placentae을 적용할 수 있습니다. 절연, 일단 decidual 세포는 다양 한 임신 합병증에 다른 decidual 셀 부분 모집단의 역할을 이해 하는 것을 목표로 하는 실험적인 응용 프로그램에 대 한 사용할 수 있습니다.
Introduction
가장 적극적인 성인 여성 조직 중 하나 endometrium 난소 호르몬, 에스트로겐 (E2)과 황 체 호르몬 (P4)에 의해 자극에 대 한 응답에서 각 생리 주기를 개장 하는 극적인 겪 습. 일컬어 임신 endometrium decidua P4 기반 차별화 E2 지배 증식 단계 결과로 postovulatory 단계의 끝에 의해 형성 되는 매우 중요 한 생식 조직 이다. Decidual 셀 성공적인 blastocyst 이식 한 태아 이식 모성 관용을 유지 하기 위한 utero placental 인터페이스의 개발을 위한 호르몬 요인의 분 비에 대 한 책임이 있습니다.
Decidualization는 주입 및 후속 decidual 나선형 동맥의 리 모델링 필요 합니다. 자궁내 막 기질 세포 decidualization을, P4 및 캠프, 통제 생리 주기1의 후반 luteal 단계를 겪는 다. 이 프로세스는 주위 혈관 및 개장 하는 맥 관 구조에 규제를 밀매 하는 백혈구의 역할을 제안 하는 기질에 걸쳐 확산 시작 됩니다. 이 세포 변환 원형 형태, 증가 핵 크기 및 거친 바인딩과 그물 및 Golgi 기구2의 확장 특징 이다. Decidualized stromal 세포 paracrine 요인 blastocyst 이식 지원 수 있으며 수많은 호르몬 (즉, prolactin), 신생 성장 인자, 인슐린 성장 인자 의무적인 단백질-1의 분 비에 의해 특징 (IGFBP-1), 스타 글란 딘 (PG) E (세포내 캠프의 자극), cytokines, 세포 외 기질 구성 요소 및 태 반 착상 및 개발3,,45,6에 대 한 필수적인 영양소 .
Decidual 셀 인구 decidualized stromal 세포와 전적으로 이루어진 하지 하지만 또한 큰, 임신 특정 decidual 백혈구 인구를 포함 되어 있습니다. Decidualization 과도 지역화 된 부 종 및 자연적인 살인자 (NK) 세포, T 세포, 수지상 세포, 대 식 세포의 유입을 포함 됩니다. 가장 큰 백혈구 부분 모집단은 자 궁 NK 세포, cytokines의 소스는 decidua 및 신생 요인 decidualization 과정에서 원조 하 고 증가 수 있습니다 침투 모든 모성 백혈구의 약 50-70%를 구성 임신7전체 수입니다. 대 식 세포, 면역 세포의 두 번째로 큰 부분 모집단을 되 고 이식 사이트 발견 하 고 임신8증가. Cytokines의 근원 그리고 성장 요소 (CSF-1)9, 종양 괴 사 인자 α (TNFα)10 및 스타 글란 딘을 자극 하는 식민지 같은 요인 (PG) E11.
임신, 내내 그리고 기간 노동 전에 decidua cytokines 및 발산 모성 주변 백혈구 활성화 및 노동 시작 자 궁 조직으로 마이그레이션하기에 대 한 책임의 주요 원천이 다. 동물 연구를 보여주는 수많은 프로 염증 성 cytokines 있습니다 마우스 decidua에 최대 통제 노동, 동안와 같은 TNF-, 일리노이-6, 일리노이-12, IL-1b12. 인간의 decidua에서 프로 염증 성 cytokines 일리노이-1b, 일리노이-6와 IL-8 (주요 호 중구 chemoattractant) 노동13에 비해 노동 하는 동안 더 높은 식 전시. 이러한 decidual 조직14;으로 활성화 및 백혈구의 유입에서 cytokines 결과 분 비 myometrial 4-fold, 가 두 인접 한 자 궁 조직 사이 활성화의 나타내는 더 큰 앞 decidual 침투 기간 노동, 동안 decidual 대 식 세포와 두 인간 호 중구 침투와 쥐에서 증가 볼 15. 백혈구 침투 이러한 PGs myometrium16의 동기 수축 활성화의 생산, 매트릭스 metalloproteinases (MMPs) 막 시작17,18, 파열 뿐만 아니라 증폭 자 궁 활성화 과정 ('cytokine 폭풍우') 프로 염증 성 cytokines.
Decidual 세포 이식 과정, 초기 임신 기간에 노동의 활성화에 참여 하는 고에 산 모-신생아 공차를 유지에 중요 한 역할을 하는 등의 많은 중요 한 기능으로 인해 다른 병 리 중 발생할 수 있는 임신입니다. 예를 들어, 회귀 이식 실패와 반복 임신 손실 (1) 불 임; decidual 성숙의 오류 로부터 발생할 수 있습니다. (2) 자궁내 성장 금지 (IUGR)과 부적 절 한 개발 및 부전 decidua/태 반 또는; decidual myometrial에 손상 된 혈관 변환의 자간 전 증 (3) 조산 뿐만 아니라 있는 조기 decidual 활성화에서 발생할 수 있습니다.
이러한 주요 질환, 인간 생체 내에 연구의 윤리적이 고 실질적인 제한 함께 비추어 이해의 목적으로 생체 외에서 분석을 위해 필수적 이다 기본 인간 decidual 세포 라인을 설립 하 고 임신 합병증의 임상 관리를 개선. 따라서, 우리의 연구의 목적은 높은 셀 생산량 및 생존 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집 된 인간의 기본 decidual 셀의 격리에 대 한 허용 하는 프로토콜을 개발 했다. 이 현재 프로토콜 명확 하 게 설명 합니다 시간 및 비용 effective 메서드는 세포 decidual의 특정 하위의 분리에 대 한 생체 외에서 분석의 다양 한 사용 될. 풍부의 특성화 및 기간과 비교를 첫 번째 또는 두 번째 임신에서 decidual 부분 모집단의 표현 형 인간의 임신 기간 내내 그들의 역할을 정의 하는 데 중요 하다.
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Protocol
Placentae 선택 제왕 섹션을 겪고 노동 여성에 건강 한 용어에서 수집 됩니다. 수집, 처리, 그리고 인간의 샘플의 일회용 마운트 시 나이 병원 윤리 위원회의 지침을 준수 합니다. 서 면된 동의 각 환자에 게 서 얻어진 다. 이 연구는 마운트 시 나이 병원에서 연구 윤리 위원회에 의해 승인 됩니다.
1입니다. 준비
참고: 모든 단계 증기 두건에서 실시 되어야 하 고 모든 수술 장비 통해 압력솥 증기 두건에 배치 하기 전에 소독 해야 합니다. (병, 50 mL 튜브, 등) 다른 모든 자료는 70% 에탄올 용액으로 살 균 해야 합니다. 항상 착용 개인 보호 장비에 항상 유해 쓰레기 (연구실 코트, 장갑, 긴 머리를 다시 묶어, 등)와 함께 작업 하는 경우.
-
효소 소화 솔루션 (최종 솔루션: 200 mL)
- 플라스틱의 HBSS-180 mL / 500 mL 비 커에 살 균 감동적인 자석을 추가 하 고 플레이트 실 온에서 교 반에-.
- 밖으로 무게 추가 하 고 다음 HBSS/솔루션에 천천히 순차적으로: 20 mL FBS, 400 mg 콜라 2 ([최종] = 2 mg/mL), 20 mg 간장 콩 트립 신 억제제 ([최종] = 0.1 mg/mL), 30 mg DNase 1 ([최종] = 0.15 mg/mL), 및 200mg BSA ([최종] = 1 mg/mL)
- 감동 중간 속도를 설정 하 고 10-20 분 (교 반 하면서 주석 포 일 또는 파라핀 필름 커버) 파문 혼합물 허용.
- 플라스틱 퍼 널을 사용 하 여 250 mL 유리 병에 혼합된 솔루션을 부 어 하 고 증기 두건에.
- 플라스틱 가기 여과 장치 (0.22 μ m 멤브레인 필터, 500 mL), aliquot 20 mL 50 mL 튜브 (총 10 관) 및 사용까지-20 ° C에서 저장소를 통해 솔루션을 전달 합니다.
-
RPMI 1640 미디어 (세척 솔루션 및 10% 완전 한 성장 매체는 2%)
- RPMI 1640와 FBS 증기 두건에서 유리 병에 결합 합니다.
- 2 %FBS 솔루션, 490 mL와 10 mL FBS RPMI 1640의 결합.
- 10 %FBS 솔루션 RPMI 1640 450 mL 및 50 mL FBS 결합 하 여.
- Normocin의 500 μ RPMI 미디어와 FBS (50 mg/mL 재고, 0.05 mg/mL 작업 농도)를 포함 하는 이전 단계에서 500 mL 유리병에 플라스틱.
- 사용까지 4 ° C에서 500 mL 유리병에는 0.22 μ m 멤브레인 필터 및 저장소를 통해 미디어를 전달 합니다.
- 실험을 시작 하기 전에 30 분 배치의 약 20 mL 수 37 ° C 비드 욕조에 효소 소화 솔루션 냉동, 2 %FBS 37 ° C 비드 욕조에 10% FBS RPMI 1640 미디어 락 물 목욕 설정 하 고 37 ° C로 설정 2 세대, 그리고 설정 4 ° c 온도 제어 원심 분리기
2. Decidual 조직 용어 Placental 세포 막에서의 수집
- HBSS 병 장소 + +, HBSS-/-5 50 mL 튜브 랙 연기 후드 아래에. HBSS 25 mL를 플라스틱 + + 1 개의 관에.
-
Gloved 손을 사용 하 여, 꺼내 용어 태 반 수술 실 극장에서 수송을 위해 사용 하는 컨테이너에서. 기저귀 패드 (어머니 쪽)에 태를 놓고 태아 막이 위와 집게를 사용 하 여 밖으로 확산.
- 증기 두건에 겹치는 기저귀 패드를 하다.
- 별도 기저귀를 사용 하 여 그래서 어머니 쪽 얼굴 태를 플립.
- 고 막 파열의 지점을 찾아 전개 하 여 fumehood 표면에 평평 하다 막 수 있도록 절 개.
참고: 막 태에서 철수는, 일단은 decidua 얼굴 뒤에 amnion 레이어와 chorion 레이어에 휴식 될 것입니다.
- Chorion 25 mL HBSS 포함 50 mL 튜브에 장소에서 decidual 조직을 긁어 신중 하 게 플라스틱 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 + +.
- 적당 한 압력으로 멤브레인을 다쳤어요. 그것은 chorion 오염 발생할 수 있습니다 너무 많은 압력을 적용 되지 않습니다. 뿐만 아니라, 일부 decidual 셀을 포함 하는 이러한 작은 혈전을 수집 합니다.
주의: decidual 컬렉션 후 태 고 해야 합니다 생물 플라스틱 상자에 포장 (제도적 규칙)에 따라 적절 한 처리 하기 전에-20 ° C 냉동 고에 얼. 피 묻은 기저귀 패드 인감 꽉 비닐 봉투에 포장 하 고 생물 안전 상자에서 삭제 해야 합니다.
3. 세탁기 및 효소 소화 Decidual 조직의
- 부드럽게 손으로 50 mL 튜브를 흔들어 하 메 마른 견본 (소변) 컨테이너에 휴식 250 μ m 금속 체 (250 μ m, 크기 60 메쉬)를 통해 전달 하 여 수집 된 조직 세척.
- HBSS로 두 번 세척을 반복 + +와 두 번 HBSS-/-각 세척에 대 한 신선한 튜브에. (최종 HBSS-세척 /-칼슘과 마그네슘 HBSS에 존재의 제거에 대 한 수 있습니다 + +는 그렇지 않으면 다음 효소 소화 과정을 방해).
참고입니다. 세척 단계 동안 chorion 조직 오염 decidual 조직 색상에 핑크 빛과 chorion 동안 비정 질 이며 백색, 밀도, 힘 줄은 명백한 될 것입니다. 따라서, chorion 오염 집게와 함께 쉽게 제거할 수 있습니다. - 필요에 따라 decidual 조직이 두꺼운 경우 무 균 10 cm 직경 페 트리 접시에 그것을 전송 하 고 접시에 두 개의 반대 scalpels와 조직의 말하다 계속 합니다.
-
효소 소화 솔루션의 조직/mL의 100 mg을 포함 하는 살 균 50 mL 튜브에 씻어 조직 배치 (준비 참조).
- 참조 점으로 decidual 조직의 수준 50 mL 튜브에 5-10 mL 마크에 도달 하면 확인 합니다.
- 효소 소화 솔루션 (단계 1.1에서에서 Prepared)의 약 20 mL를 사용 하 여 전체 기간 태아 막에서 수집한 총 decidua 소화.
- 파라핀 영화와 튜브의 뚜껑을 봉인 (튜브를 단단히 밀봉 하 고 포장 모자와 튜브의 상단 주위 파라핀 필름) 문화에서 후드를 떨고 물 목욕 (145 rpm에서에서 20 분 동안 37 ° C에서 decidual 조직을 품 어 2 세대).
- 부 화, 후 파라핀 필름을 제거 하 고 소화 조직 70% 에탄올을 포함 하는 튜브의 표면 소독 연기 후드 아래. 짧게 손으로 튜브 흔들.
- 새로운 살 균 견본 콘테이너로 금속 체 (250 μ m, 크기 60 메쉬)을 통해 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 효소 반응을 중지 RPMI + 10 %FBS 포함 0.1 %normocin 동등한 볼륨 (20 mL)와 희석. 원심 분리 단계 4.1 직접 진행 합니다.
- 필요한 경우, 나머지 소화 되지 않은 조직 20 mL 신선한 효소 소화 솔루션의 새로운 50 mL 튜브에 다시 놓고 소화 (20 분, 물 목욕을 떨고 37 ° C)를 반복 합니다.
- 두 번째 소화 필요한 경우 얼음 (무 균 유지 파라핀 필름 커버)에 셀 서 스 펜 션 첫 번째 튜브를 놓습니다. 3.5-3.6 단계를 반복 하 고 두 셀 정지를 결합.
4. 단일 셀 서 스 펜 션 생성
- 세포 현 탁 액 (420 g, 4 ° C, 11 분) 원심
- 상쾌한을 제거 하 고 resuspend RPMI + 2 %FBS 포함 0.1 %normocin ("워시 버퍼") 40 mL에 셀.
참고: 셀 펠 릿 느슨한 하 고 붉은 혈액 세포 오염 때문 젤라틴, 발음 주의 상쾌한 것입니다. 수동 피 펫을 상위 단계의 제거 필요할 수 있습니다. - 11 분 4 ° C에서 420 g에서 원심 분리를 반복 합니다.
- 조심 스럽게 (참고 단계 4.2 했 듯이)는 상쾌한을 제거 하 고 워시 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend 같은 튜브에 35 mL의 적혈구 세포의 용 해 버퍼를 추가.
참고: 펠 릿이 크거나 매우 살 벌 한, 그것은 수 분할 적혈구 세포 단계에 대 한 두 개의 튜브로 추가 하 여 워시 버퍼의 10 mL를 추가 하 고 두 개의 튜브를 똑같이 나누어 적혈구 세포의 용 해 버퍼의 35 mL 각 튜브를. - 20 분 시작 하 고 붉은 혈액 세포를 lyse에 외피의 끝에 짧게 소용돌이 tube(s)에 대 한 얼음에 품 어.
- 4 ° c.에 11 분 420 g에서 원심
- 신중 하 게, 제거는 상쾌한 고 워시 버퍼의 40 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 세포 세포 덩어리를 제거 하는 70 μ m 나일론 필터를 통해 전달 합니다.
- 4 ° c.에 11 분 420 g에서 원심 분리기
- 상쾌한을 제거 하 고 완전 한 매체의 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend (RPMI 10% + 0.1 %normocin 포함 하는 FBS).
-
Trypan 파랑 염료-제외 hemocytometer 절차 아래에 설명된대로 사용 하 여 셀의 개수:
- 문화 후드 부드럽게 trypan 블루와 결합 하기 전에 철저 하 게 혼합 하기 위하여 세포 현 탁 액 3 배 아래로 플라스틱. 1.5 ml에서 튜브 준비 세포 현 탁 액, 1:2 (trypan 블루 솔루션의 결합 20 μ)과 20 μ decidual 세포 현 탁 액의 희석. 조심 스럽게 몇 번 (이 솔루션은 불 임) 위아래로 pipetting으로 trypan 블루 셀 솔루션을 혼합.
- 위에 유리 coverslip와 현미경의 스테이지는 hemocytometer를 놓습니다.
참고: Hemocytometer 트리플 라인에 의해 분할의 큰 사각형 9 개에 게 그것에 격자와 현미경 슬라이드입니다. 각 큰 광장 1 m m2의 면적을가지고 그리고 챔버에 액체의 깊이 0.1 m m. 따라서, 각 큰 사각형을 채울 수 있는 액체의 볼륨은 1mm * 1mm * 0.1 m m = 0.1 m m3= 10-4 mL. - 천천히 전체 슬라이드 (정지 전에 혼합 잘 채우고) 동안 셀 혼합 분산을 모 세관 행동을 수 있도록 hemocytometer의 홈으로 trypan 블루 셀 혼합물의 10 μ를 추가 합니다.
- (10 배 확대)에서 현미경으로 세포를 확인 하 고 trypan 블루 (이들은 실행 가능한 세포)는 hemocytometer의 4 개의 큰 외부 사각형에 제외 된 모든 화이트/그린 셀. 라인을 터치 하는 셀을 계산 하는 경우 그 터치 오른쪽 및 위쪽 라인 하지만 왼쪽 및 아래쪽 라인을 만지고 그 들만 계산 합니다. 어두운 파란색 셀;를 계산 하지 않음 파란색 셀이 죽은 trypan blue 염료 관통할 수 있다 쉽게 플라즈마 세포 막을 통해 세포질으로 나타냅니다.
- 세포 현 탁 액 (X)의 1 mL에 가능한 셀의 수 계산:
2 = 희석 비율
10000 변환 계수 = (1 mL = 1 c m3 = 10, 000 * 0.1 m m3)
- Decidual 셀 RPMI + 10%에서 바람직한 최종 농도를 희석 FBS (성장 매체).
참고: 조직 문화 도금, 플라스틱 2 * 106 셀/잘 플라스틱 6 잘 플레이트, 10 cm 플라스틱 격판덮개로 10 * 106 세포 또는 유리 coverslip 75000 셀.
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Representative Results
효율성과 격리 된 셀의 유효성을 검사, 그들은 두 가지 방법으로 특징 했다: cytometry와 immunocytochemistry (ICC). 4 세포 인구를 표적으로 했다; 팬 백혈구 마커 CD45 decidual 면역 세포를 식별 하는 데 사용 되었다, cytokeratin 상피/내 피 세포를 감지 하는 데 사용 했다 및 cytokeratin 7 어떤 감지 하는 데 사용 되었다 마지막으로, decidualized stromal 세포 안티 vimentin 항 체에 의해 발견 된 잠재적인 trophoblast (chorion 또는 placental) 오염.
멀티 컬러 이미징 cytometry에 의해 특성화에 대 한 갓 격리 decidual 세포는 세포 생존 능력을 결정 하는 고칠 수 염료와 스테인드 했다. 셀 permeabilized 및 고정, vimentin APC, CD45-APC-H7, cytokeratin FITC와 cytokeratin 7-PerCP를 대상으로 하는 형광 색소 활용 된 마우스 단일 클론 항 체와 얼룩이 옵니다. 항 체 정보 자료의 테이블에에서 나열 됩니다. 고정 및 스테인드 셀 탠덤 색소의 분리를 방지 하기 위해 이미지 스트림 MK2 이미징 교류 cytometer에서 다음 날 실행 버퍼 얼룩에 하룻밤 4 ° C에서 저장 되었다. 분석은 소프트웨어를 사용 하 여 수행 되었다. 세포 파편 및 집계 직렬 게이팅 3 순차 기능/마스크 조합 (그림 1A-B)를 사용 하 여 제외 했다. 형광-1 (FMO) 제어 컨트롤 긍정적인 decidual 세포 인구를 식별 하는 데 사용 했다 그리고 단일 얼룩 세포 보상 (그림 2)을 위해 사용 되었다. 최종 점 플롯 4 마커 (그림 2)의 긍정적으로 얼룩진된 세포 인구 80% (그림 1C)의 세포 생존을 보여 줍니다. 그림 1D에 긍정적으로 얼룩진된 셀의 대표 이미지를 볼 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 우리가 발견 인구 주로 stromal 세포 (55-60%), 백혈구 (35%), 상피의 구성 (%1) 또는 trophoblast (0.01%) 세포 (그림 1E). 실험은 세 번 반복 되었다. 이러한 결과 순도 (trophoblast 오염은 chorion에서의 부재) 기본 인간 decidual 세포 수집 및 기간 placentae의 태아 세포 막에서 분리의 높은 생존 확인 합니다.
별도 ICC 실험에서 갓 격리 decidual 셀 유리 coverslips (75, 000 셀/coverslip), 첨부할 수 그리고 문화에서 48 시간 동안에 시드 했다. 미디어 연결 되지 않은 죽은 세포를 제거 하는 24 시간 후 변경 되었습니다. 셀 다음 50% 아세톤-50% 메탄올, 0.02% 비 이온 계면 활성 제와 permeabilized로 고정 하 고 불특정 바인딩 솔루션 차단 된 차단 되었습니다. 셀은 물 들일 다음 마우스 단일 클론 항 체: 안티-CD45 (팬 백혈구 표식), 안티-cytokeratin (상피 세포 마커) 및 안티-cytokeratin 7 (trophoblast 표식), 그리고 염소 안티 vimentin polyclonal 항 체 (stromal 세포 마커). 당나귀 반대로 염소와 당나귀 반대로 마우스 2 차 항 체로 사용 되었다. DAPI는 핵 얼룩에 사용 되었다. 마우스 IgG, 염소 IgG 및 이차 항 체 혼자 부정과 특이성 컨트롤으로 사용 되었다. 이미지 회전 디스크 confocal 현미경에 20 배 확대에서 찍은 사진. 항 체 사용 재료의 테이블에 에서 나열 되 고 대표 이미지는 그림 3에 표시 됩니다. 우리의 시각적인 관찰 나타냅니다 연결 된 기본 decidual 셀의 그 대다수는 vimentin 긍정적인 stromal 세포 (약 95%), 백혈구 (약 1-2%), 상피의 작은 수 (약 1%)와 trophoblast (단일 세포는 세포 인구 검색에 대 한 회계 < 모두의 0.01%). 흐름 cytometric와 ICC 결과 큰 차이점은 cytometry에 의해 감지 CD45 긍정적인 백혈구 인구에서 감소 이다. 이 불일치는 두 실험 실시 했다 하는 방법으로 설명 될 수 있다: 교류 cytometry 분석에서 격리 decidual 셀 즉시 처리 및 스테인드, 의미 백혈구 인구 분석에 포함 되었다. ICC, 총 decidual 셀 서 스 펜 션은 도금와 실질과 상피 세포, 하지만 하지 면역 세포의 첨부 파일을 지 원하는 대부분은 미디어에서 48 시간 동안 경작. 24 시간 후 미디어 변화,이 두 가지 방법으로 제시 하는 결과에 차이 대 한 회계 기간 동안 연결 된 면역 세포 제거 되었습니다. 우리가 복잡 한 임신 특별 한 예방에서 인간의 decidua 하위 인구 백혈구 인구의 실수로 제거를 방지 하기 위해 사용 해야 하는 백혈구를 공부 하는 결론을 내렸다.
그림 1: 게이팅 decidual 셀 인구 차별에 대 한 전략. (A) 갓 절연된 고정된 decidual 셀 셀 남자, 및 (B) 이후 세포 파편을 제외 하 3 순차 기능/마스크 조합을 사용 하 여 문이 제외 하 문이 처음 했다. (C) 라이브 셀 (핑크 게이트, 총인구의 80%)는 죽은 세포 (블루 문, 전체 인구의 20%)에서 분화 되었다 고칠 수 생존 염료를 사용 하 여. (D) decidual 셀의 대표 이미지 스테인드 생존 마커 및 4 개의 형광 활용 된 항 체 (Ab) (vimentin APC, CD45-APC-H7, cytokeratin FITC와 cytokeratin 7-PerCP). 점선된 눈금 막대 7 μ m을 같습니다. (E) 파편 무료, 라이브 세포 인구를 확인 이러한 마커 decidual 셀 인구 내의 각 셀 형식의 비율을 결정 하기 위해 사용 되었다. 그림 1B 및 1 C, 각 점은 단일 decidual 셀을 나타냅니다. 그림 1A 와 1c, 점 플롯의 색상 범위 셀 밀도, 빨간 기억을 고집적 세포와 파란색 셀의 덜 조밀한 묘사. 여기에 제시 된 데이터 3 생물 복제의 대표 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 플롯 게이팅 FMO와 함께 인간의 기본 decidual 셀 Representativeflow cytometric 분석. 셀의 대표 컬러 도트 플롯 용어 decidua에서 고립 되 고 (A) vimentin-APC (stromal 세포 마커), (B) CD45-APC-H7 (백혈구 표식), (C) cytokeratin FITC (상피 세포 마커)와 (D) 스테인드 cytokeratin 7-PerCP (trophoblast 마커) 각 각각 FMO 제어와 함께. 형광-마이너스-1 (FMO) 컨트롤, 튜브 질문에 마커 마이너스 칵테일와 동일 하 게 완전히 스테인드 실험 샘플 준비 전체 항 체를 포함 하는 진정한 긍정 확인 흐름 cytometry 데이터 분석 하는 동안 사용 되었다 decidual 셀의 인구 FMO 컨트롤 상대 배경을 표시 하 고 진정한 긍정적인 신호의 정확한 게이팅 허용 합니다. 여기에 제시 된 데이터 3 생물 복제의 대표 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 기본 인간의 decidual 셀의 대표 Immunocytochemical 분석. 기본 인간 decidual 셀 미디어 변경 24 헤 셀 아세톤-메탄올으로 고정 되었고 단일 클로 널 마우스 안티-CD45 (백혈구 마커) 물 들일 후 48 h에 대 한 유리 coverslips에 성장 했다 안티-cytokeratin (상피 세포 마커)와 안티-cytokeratin 7 (trophoblast 마커) 항 체, 그리고 염소 안티 vimentin polyclonal 항 체 (stromal 세포 마커). 대표 이미지 표시 (A) vimentin 양성 섬유 아 세포 (보조 Abs: 당나귀 안티 염소), (B) CD45 + 백혈구 (보조 Abs: 당나귀 반대로 마우스), (C) cytokeratin 긍정적인 상피 세포 (보조 Abs: 당나귀 반대로 마우스) 및 (D) cytokeratin 7-긍정적인 trophoblast 셀 (보조 Abs: 당나귀 반대로 마우스) 검색 (붉은 얼룩) 했다. DAPI 얼룩 (블루 얼룩) 세포의 핵 염색에 사용 되었다. 일반적인 마우스와 염소 IgG (M IgG와 G IgG) 부정적인 컨트롤 사용, 기본 생략 Abs 이차 항 체 컨트롤 (M 2nd 만 G 2nd 만)으로 사용 되었다. DMI 회전 디스크 confocal 현미경에 20 배 확대에서 이미지를 가져옵니다. 스케일 바 = 32 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 비용은 매우 간단 하 기본 decidual 세포를 고립 시키기를 위한 효과적인 방법 전체 인간의 용어 placentae의 태아 세포 막에서 수집 하는 시간을 보여 줍니다. 이 프로토콜의 성공은 두 가지 중요 한 요소, (1) 태아 막 및 (2) 치료는 decidual 세포 프로토콜 통해 처리의 chorion 계층에서 근 근이 살아가고 decidual의 효율에 따라 달라 집니다. 그것은 중요 한 chorion 조직 오염 보장 하 여 아무도 실수로 포함 decidual 된다고 하는 동안 및 식별 하 고 제거 하는 세척 단계 (decidua 및 chorion 형태학에 차이 중 어떤 오염 든 지에 의해 제어 됩니다. 수 수는 decidua와 실수로 수집 될 수 있습니다 있는 chorion의 쉬운 제거를 위한). Decidual 셀은 깨지기 따라서 빠르고 빈번한 pipetting 감소 가능성에 발생할 수 있습니다. 좋습니다, 그럼, 피 펫 배출 속도 설정을 느린 유지 한다 고 최소 pipetting 셀 때 사용 되어야 한다.
이 프로토콜 trophoblast 오염을 방지 하는 방법 중 하나는 전적으로 태 반 (decidua parietalis 함유)의 태아 세포 막에서 decidua을 모아서, 제외 biopsies을 취 함으로써 이루어집니다 decidua basalis의 컬렉션 태 반의의 모성 측. 따라서, 우리의 현재 프로토콜 우리가 분리 decidual 세포 인구의 순도 향상, 하는 동안 그것은 decidua (즉 decidua basalis)는 decidua의이 부분을 대상으로 하는 연구에 대 한 제한 사항으로 제기할 수 있는의 섹션 제외지 않습니다 또는 때 모두 섹션에 decidua의가 필요 합니다. 이 제외는이 연구의 가장 큰 한계를 구성 되어 있습니다. 또한, 인간 환자에서 decidual 세포를 분리 하는 동안 수 있습니다 decidual에 대 한 더 많은 생물학 관련 통찰력 임신 연구, 적은 조작 및 적은 기간 공부 될 수 있다 윤리적인 이유로 설치류 기반 연구에 비해.
이 프로토콜을 통해 어려움을 만들 증명할 수 있는 단계는 제대로 5 월을 완화 하는 경우 셀 생산량 및 생존 능력에 영향을 미칠. 이 일주, 수정 할 필요가 있습니다. 가장 중요 한 태아 막의 decidual 된다고 하는 것이 충분 한 (단계 2.4); 인지 확인 하는 것입니다. 인간의 다양성으로 인해 각 태 반 조직의 일관성 decidual 조직과 조직의 건조의 레벨의 양 측면에서 달라질 수 있습니다. 그것은 변조 decidua만 제거 되도록 된다고 하는 것이 중요입니다. Decidua 고 막이 건조, PBS/수 수 있도록 쉽게 된다고 막에 부 어. 두 번째 단계는 decidual 세포 현 탁 액 (3.4 단계)의 적혈구 세포 이다. 언급 했 듯이, 셀 펠 릿 매우 큰 이며 혈액의 높은 금액을 포함 하는 경우, 펠 릿은 lysing의 효율성을 개선 하기 위해 2 개의 관으로 나눌 수 있습니다. 아직이 단계 후에 적혈구는 최대 효율을 위한 더 튜브 펠 릿을 나눌 필요가 있을 수 있습니다.
동안 다른 decidual 격리 프로토콜 용어 태 반 및 hysterectomies를 받고 비 임신 여성에서 자궁내 막 세포의 고립에서 이전에 게시18,19, 이러한 방법은 다양 한 해결 하지 않습니다. 제한, 낮은 세포 생존 능력 등 인접 조직 오염. 우리 고려 이러한 경계 여기, 프로토콜을 설계할 때 더 큰 셀 생산량에 이르게 생존 능력을 증가 하 고 주위 조직에서 오염의 위험을 감소. 이전에, 자동 dissociations decidual 조직19,20뜨 기계적으로 사용 되었습니다. 이 방법은 상대적으로 가혹한 결과 그것은 신속 하 게 뜨 조직가 위를 회전 하 여 믹서 기에 유사 하 게 작용 하는 기계에 삽입 튜브에서 decidual 조직 수집 활발 한 기계적 분리를 포함 감소 세포 생존 능력입니다. 여기 설명 하는 우리의 새로운 방법을 행동 하는 조직에 적용 되는 기계적 힘 대신 부드러운 락 물 목욕 움직임과 함께 효소 소화는 짧은 (20 분)를 결합 합니다. 효소 소화 솔루션은 세포 생존 능력 및 수율, decidual 조직;의 기질을 소화 (1) 콜라를 포함 하도록 (콜라;의 나머지 trypsinolytic 활동으로 인해 일반적인 소화를 방지 하기 위해 콩 트립 신 억제제 2) (3) DNase 부동성 DNA (4) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 오버 소화에서 세포를 보호 하기 위해 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 단백질 제거를 1. 이전 연구의 두 번째 주요 한계는 사실에 있는 decidua basalis trophoblastic 오염에서 잠재적으로 발생할 수 있습니다는 태 반의의 모성 쪽의 상위 레이어를 절단 하 여 수집 된. 우리의 새로운 프로토콜 격리 decidua parietalis는 decidua 부드럽게 된다고 하 여 태아 막 (chorion) 끄고 chorion 오염 세척 단계 동안 쉽게 제거할 수 있습니다.
따라서, 우리의 메서드를 사용 하면 기본 decidual 셀의 단순한 격리 placental 세포 막에서 (전체 프로세스는 약 3 시간 소요) 시간의 짧은 기간에 높은 셀 생산량 및 우수한 세포 생존 능력의 결과로. Decidual 세포 격리 되 면 그들은 사용할 수 있습니다 다양 한 실험; 예를 들어, 인간의 기본 decidual 셀 immunocytochemical 분석에 대 한 coverslips에 시드할 수 있습니다, 그들은 수 다양 한 트리 트 먼 트 및 조작, 문화에서 성장 뿐만 아니라 수 직접 얼룩진 다 색 흐름 cytometry 분석 평가 하는 다른 셀 부분 모집단의 역할을 이해 하는 시도에 임신 합병증과 인간의 decidua의 구성. 여기에 제시 된 방법 용어 태 반 (인간 임신의 세 번째 3 개월의 끝)에서 세포를 분리 하는 데 사용 했다,이 프로토콜도 쉽게 적용할 수 있습니다 첫 번째 및 두 번째 임신 태 반 임신 단계의 유연성에 대 한 허용 그의 연구는 해결 됩니다.
이전 게시 프로토콜 자동 dissociations 떨어져 decidual 조직 또는 효소 소화 혼자21,22휴식을 사용. 결합 하 여 부드러운 기계적인 힘 (37 ° C에 물 목욕 락) 칵테일 효소 소화 소화와 세포 생존 능력을 최적화 하도록 설계 되었습니다 뿐만 아니라, 위에서 설명한 프로토콜 셀 생산량과 생존 사이 이상적인 균형을 만듭니다. 또한, 이전 프로토콜 요약 셀 수확량 그들의 격리와만 현재 셀 생존 비율19에서 얻은 언급 못했다. 여기 우리가 decidual 셀 셀 (태 반 당 10-20 백만에서 배열 하는) 계산을 통해 결정의 높은 수익률을 보여줍니다. 또한, 현재 간행물 쥐;에서 기본 decidual/자궁내 막 세포의 절연을 보여 줍니다. 우리의 프로토콜 인간의 조직, 세포 실험23의 더 생물학적으로 관련 소스 렌더링의 연구에 대 한 수 있습니다. 이 프로토콜도 쉽게 적용할 수 있습니다 첫 번째 고 그 하나는 임신 단계 연구의 유연성에 대 한 수 있도록 두 번째 임신 태 주소입니다. 일단 세포 격리 되어, 그들은 사용할 수 있습니다 다양 한 immunocytochemistry, cytometry, 단백질 및 RNA 추출, 백혈구 등의 후속 격리 실험 기법에에서 시도에서 다른 세포의 역할을 이해 하 부분 모집단입니다. 실시간 PCR 또는 게놈 넓은 사용 (자간 전 증 또는 preterm 노동) 등 복잡 하 고 건강 한 임신 사이 decidua 관련 연구에서 유전자와 단백질 식에 차이 식별에 도움이 수 있는 소설 대상 제공할 수 있습니다. 진단 및 치료 도구 개발입니다. Decidual 세포, 특히 백혈구, cytometry 사용을 통해 쉽게 확인 될 수 있는의 비율로 변경이 모두 백혈구의 변화와 같은 임신 합병증의 병 인에 대 한 답변을 제공할 수 있습니다 또한 또한, 부분 모집단 비율 뿐만 아니라 기간에 진통24변조 표시 되었습니다 그들의 정품 인증 상태.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
저자는이 연구에 사용 된 인간의 표본에 대 한 기증자, RCWIH BioBank 마운트 시 나이 병원/UHN 산부인과 부서 및 산부인과 감사 하 고 싶습니다. 우리는 잿 물 실험실, 특히 그녀의 방법 개발에 대 한 박사 캐롤라인 덩크의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 버로우즈 환영 기금 (부여 #1013759)에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
References
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