Summary
本文所描述的协议使用鼠标提耳肌 (拉尔) 肌肉记录自发性和神经诱发突触后电位 (电流钳) 和电流 (电压钳) 在神经肌肉连接。使用该技术可以为正常和疾病条件下突触传递机制提供关键的见解。
Abstract
本协议描述了一种在电流钳和电压钳条件下记录神经肌肉结突触传递的技术。使用肛提耳肌 (拉尔) 的前体制备, 是因为它是一种薄肌肉, 可在马达终板上为微电极掷镖师掷提供易于可视化的神经肌肉连接。该方法允许记录自发微型终板电位和电流 (mEPPs 和 mEPCs), 神经诱发终板电位和电流 (无害性和 EPCs), 以及电机终板的膜性能。从该方法得到的结果包括量子含量 (QC), 囊泡释放部位的数量 (n), 囊泡释放的可能性 (p相对), 突触促进和抑郁症, 以及肌肉膜时间常数 (τm) 和输入电阻。这种技术应用于人类疾病的小鼠模型可以突出疾病状态中的关键病理, 并有助于确定新的治疗策略。通过完全压紧单个突触, 该方法提供了目前可用的突触传输的最详细的分析之一。
Introduction
研究神经肌肉连接处的突触传递, 可以洞察神经和骨骼肌肉系统之间的动态关系, 是检查突触生理学的绝佳模型。提肛耳肌 (拉尔) 是一种薄肌肉, 允许神经肌肉连接容易形象化。以前的报告描述了使用拉尔检查突触药物和毒素的便利性, 并描绘了拉尔12的骨骼肌纤维类型特征。许多研究使用了拉尔检查神经肌肉生理学3,4,5,6,7,8。对于电生理, 能够轻松地观察拉尔神经肌肉连接允许准确地放置电极在电机终板, 并大大减少空间钳位问题记录突触传输。现有的肌肉膜性能的钳位记录, 如膜时间常数 (τm) 和输入电阻 (R in) 是容易获得的.此外, 这些特性可以用用于记录神经肌肉传输的相同肌肉纤维来测量, 从而直接将突触功能与肌肉膜的特性进行比较。对这些数据的分析可以为许多神经肌肉疾病的物理机制和改变活动状态提供关键的洞察力。
这里描述的技术的一个关键方面是使用电压钳的突触录音, 这是不受非非线性遇到的电流钳和独立的肌肉膜的性质。使用电压钳, 而不是电流钳检查神经肌肉传输的优点是通过二十世纪五十年代9的开创性努力建立的。在电流钳下, 在振幅超过 10-15 mV 的无害产品不是 mEPP 振幅9的线性乘积。例如, 如果平均 mEPP 是 1 mv, 5 mv 的 EPP 可以假设是 5 mEPPs 的产品 (QC 5);然而, 40 mV 的 EPP 将是超过 40 mEPPs 的产品。这种非线性在更大的无害性发生, 因为 EPP 的驱动力, 这是不同的膜电位和平衡电位的乙酰胆碱受体 (10 mV), 大大减少在大型无害性。在电压钳实验中, 由于肌肉膜电位没有改变, 所以在压夹试验中避免了这个问题。缺点是, 在技术上比电流钳记录更难完成电压钳的实验。考虑到这一点, McLachlan 和马丁开发了一个简单的数学校正, 它在非线性10的当前钳型录音中占了不可用的。更正工作良好11,12,13, 但重要的是, 假设肌肉膜的性能没有中断。
肌肉膜的性质是特别重要的考虑, 如果研究条件或疾病状态, 扰乱肌肉。例如, R6/2 基因模型的骨骼肌从亨廷顿氏病是 hyperexcitable 由于逐步减少休息氯和钾电流14,15。结果, mEPPs 和无害的 R6/2 骨骼肌肉被放大。当然, 其他因素可以改变 mEPPs 和无害环境。与亨廷顿病小鼠 (R6/1) 的不同模型工作发现了无害性的变化, 似乎与诱捕蛋白8有关。为了评估导致神经肌肉传导改变的机制, 用电压钳消除改变肌肉膜性能的效果将是有益的。在最近的一项研究中, R6/2 神经肌肉传输的研究在电流和电压钳条件下使用的技术描述。通过将两个电极放在板板16的长度常数内, 电机终板的整体被压紧, 误差小于1%。结果表明, 电压钳和校正的电流钳记录产生了 R6/2 肌神经肌肉传递的对比测量。这突出表明, 如果肌肉膜的性能已经改变, 并显示获得独立于肌肉膜性能的电压钳记录的好处, 则可能很难纠正非非线性的无害化。本文提出的协议是检查影响突触传递和突触后膜性能的条件或疾病状态的理想选择。
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Protocol
所有动物程序都是按照赖特州立大学动物保育和使用委员会的规定进行的。
1. 老鼠安乐死
- 在通风罩中, 将鼠标放在密闭玻璃麻醉室中。
- 将老鼠吸入到致命剂量的异氟醚 (饱和, 或 ~ 25%)。把老鼠留在房间里, 直到呼吸不到为止。
- 将小鼠从腔室取出, 并作为安乐死的次要方法进行颈椎脱位。
2. 从头部、颈部和背部的背部表面取出毛发
- 使用电动剃须刀去除头部、颈部和背部背面的大部分毛发.....。另外, 去掉头发周围和左耳朵。
注意: 在剃须耳朵周围的皮肤时要小心, 皮肤会被剃须刀的刀片夹住, 可能会损伤底层的肌肉组织。 - 用棉签将脱毛膏涂抹在剃须部位, 除去剩下的毛发。等待约1分钟, 并用水洗瓶冲洗头发去除膏, 然后用棉签刷掉任何剩余的奶油或头发, 并轻拍皮肤干燥。
3. 去除皮肤暴露提耳肌
- 在立体解剖显微镜下, 在肩胛的水平上做一个小切口 (只是深到足以穿透皮肤)。按照图 1A-b中显示的路径, 使用微解剖剪刀切割皮肤。
- 使用精钳 (如5号), 拉起皮肤沿切口附近的肩胛。使用弹簧剪刀, 切断结缔组织, 使皮肤与底层肌肉组织在接近耳朵时分开。重要的是, 切断结缔组织与刀片指向皮肤, 以避免意外切割裸露的肌肉组织。
- 定期灌注暴露的肌肉与生理盐水的解决方案, 如下面的 Na+外部缓冲区, 包括 (毫米): 144 氯化钠, 4 氯化钾, 1.2 CaCl2, 0.6 氯化镁2, 5 葡萄糖, 1 NaH2PO4, pH 7。4与氢氧化钠, 并有300的渗透压5毫摩尔/千克。一旦结缔组织被切断到左耳朵, 切断皮肤周围的耳朵, 以消除皮肤完全从鼠标和丢弃它。
注: 拉尔附着在耳朵的底座上, 在去除皮肤时容易受损。在耳底周围留下1毫米的皮肤是很好的, 以避免切割拉尔。
4. 切除提耳肌和周围组织
- 使用弹簧剪刀, 首先切下的肌肉是低于拉尔, 它连接到脊柱之间的肩胛。从右肩胛骨开始, 就在中线的右侧, 并切向延髓端的鼠标, 同时保持在中线的右侧。继续切割所有的方式到年底的肌肉组织在头骨上。
注: 拉尔是连接到耳朵内侧和中线的最浅肌, 如图 2所示。对于其他图像, 由乳油格林17提供的一本书显示了拉尔的优秀手绘图像。 - 使用镊子立即抓住切割组织在中线右侧, 然后轻轻地抬起, 并开始切割的组织向左耳朵与刀片的剪刀压在头骨上, 以消除几层肌肉, 低于左拉尔。暂时保留所附的所有层, 以避免在拆卸过程中意外地切割拉尔。
- 切割与刀片平行, 并按对头骨, 以避免削减的神经, 支配的拉尔, 环绕耳道, 并进入肌肉的内侧一侧的耳朵。继续切割耳道, 保持尽可能多的神经连接。
注: 从脸部神经提供的拉尔分支的神经, 应保留, 因为它将在稍后的过程中使用。 - 在耳朵的延髓部分的图 1B中显示的同一路径上, 切开刚刚穿过耳道的脂肪组织。另外, 沿着左肩胛骨切开, 就像在右侧一样, 完全从老鼠身上取出肌肉。
5. 提肛耳肌分离
- 把拉尔和周围的组织放进一个容器里。使用可将解剖组织固定在底部的容器, 如带有硅胶弹性体底部的培养皿。沐浴并经常在生理盐水溶液中清洗组织。
- 将耳朵的耳廓沿耳的底部切断, 使耳软骨部分附着在拉尔上。翻转肌肉, 使下等面朝上 (在盘子底部的拉尔)。
- 放置一个针, 如昆虫别针, 通过耳道, 以保持准备到位。然后使用较小的针脚, 将其余的组织固定在拉尔中线的另一侧。使用镊子, 轻轻拉在耳朵的侧面部分的皮肤伸展肌肉, 并放置一个小针通过皮肤。重复此步骤, 直到将组织安全地放到菜上, 如图 3所示。
注意: 小解剖针可以通过切割针刺针的提示, 以达到预期的长度。这些小别针减少对组织的损伤, 并且可以使用与水浸泡显微镜目标以长的工作距离。 - 开始移除肌肉 (如图 4所示), 它覆盖着拉尔 (耳针上级、外展人耳、和interscutularis), 以及那些通过结缔组织连接到拉尔, 在靠近中线, 使用5号钳和弹簧剪刀。
- 使用镊子拉上上覆的肌肉层, 切断结缔组织与叶片定向到肌肉层被拉, 并注意避免切割或偷的拉尔。切向中线, 停止切割约三的道路中线。然后, 切割平行的中线, 以消除每个肌肉层。继续去除肌肉层直到只有拉尔留下。
- 移除那些覆盖着拉尔的部分剩余的结缔组织, 这有助于电极的掷镖师掷。轻轻地使用5号钳把结缔组织从拉尔拉出来, 用弹簧剪刀把它剪掉。只有删除的组织, 可以这么容易地做到不损害的过程中的拉尔的危险。去除任何大的神经, 支配的下层肌肉层留在拉拉的下表面, 可能会阻碍神经肌肉结的可视化。
6. 神经的分离
- 用神经刺激器识别支配的神经 (例如, 两条连接到脉冲发生器的白金导线);从耳道到肌肉会有好几个神经。用神经刺激器来接触神经, 提供一些电流 (电流将变化大约 5 V)。当肌肉收缩时, 正确的神经被识别出来。
- 小心地抓住神经附近的组织, 用弹簧剪刀把神经从耳朵周围的组织中分离出来。为了最大限度地减少损伤, 把大部分的神经埋在一些周围的组织中, 这将被用来确保神经的记录碟。
注: 支配的运动神经位于耳道开口的内侧。 - 如果使用双极刺激电极, 只需将周围的组织移除神经区域, 远离肌肉。如果使用吸入电极, 去除周围组织在神经的切口末端。
注意: 这是一个很好的停止点。这是一个很好的停车点。如果需要休息, 解剖的拉尔准备可以保持在一个生理的解决方案或持续灌注几个小时, 以确保有害的代谢物不积累。使用大量的溶液或恒定的灌注, 以确保有害的代谢物不会积聚。 - 接下来, 脱离和转移肌肉到一个灌注室的电生理学实验下直立复合显微镜。
注: 使用可安全固定组织的软底灌注室 (图 5A)。 - 将肌肉固定在末端 (耳朵和中线) 和沿肌肉的边缘。将神经垂直于肌肉纤维, 并将其钉在盘子的底部, 通过一些多余的组织在神经末端保持完好。在任何时候保持组织沐浴在一个生理生理盐水溶液中。
注: 直接在拉拉肌纤维下有圆形、高架材料也有帮助。这种额外的支持帮助在电极掷镖师掷, 可以由一个小段的硅胶弹性体铸造在50毫升圆锥管躺在它的一侧。弹性体的圆形截面可以用少量的新鲜硅胶固定在灌注室的底部。在图 5B-c中显示了灌注腔的示意图。肌肉纤维可以紧紧地粘在新铸造的硅橡胶 (这是非常疏水性) 和可能会损坏。这是有益的涂层或阻止新的铸造硅胶与蛋白质, 类似于阻止步骤在应用免疫印迹。为了阻止这种情况, 我们在一夜之间在牛血清白蛋白的浓缩溶液中孵化出新的硅胶。
7. 电生理设备设置
- 准备或解冻整除数的染料, 以帮助可视化神经肌肉连接, 如线粒体染料 4-(4-diethylaminostyryl)-1-吡啶 18, 这是轻敏感, 应储存远离光.同时, 解冻电极溶液。涡旋所有整除数, 以确保所有溶质都在溶液中。准备一个含有1µM µ-芋螺毒素 GIIIB (µ CTX) 和80µM 基 (可选) 的生理盐水溶液。
- 将带拉尔的灌注室固定在显微镜阶段。将参考电极放入装满3米氯化钾的杯中, 通过琼脂桥连接到记录室。根据制造商的指示将参考电极连接到放大器。
- 此时, 将神经刺激电极放置在神经上。使用吸入电极或小两极电极, 因为它们能很好地用于神经刺激。
- 将刺激电极放在远离肌肉的位置, 尽量减少录音中刺激工件的数量。
注: 刺激电极应控制与刺激隔离单元, 可以控制电压振幅必要的。
- 将刺激电极放在远离肌肉的位置, 尽量减少录音中刺激工件的数量。
- 通过打开刺激隔离装置上的电压旋钮, 慢慢提高电压, 直到观察到收缩。首先观察到收缩的点是阈值。确定阈值后, 将刺激隔离单元的电压设置为 1.5 * 阈值 (或由实验定义)。
注意:图 6显示了在直立显微镜下设置的肌肉准备, 以及使用球关节机械手在神经上定位的小两极电极。它是有利的为刺激有可能的最低的电压, 当仍然是充足地在门限之上。较低的刺激电压减少了录音过程中刺激工件的数量。另外, 将刺激电极放在远离肌肉的情况下, 会减少刺激工件的大小。有时神经的末端会从解剖中受损, 因此有必要在神经刺激器放置的地方进行实验。 - 去除沐浴盐水溶液, 用5µM 4-二 2-Asp 替换。将拉尔准备的 4-2-Asp 为10分钟, 以获得足够的荧光神经肌肉连接可视化 (图 7)。
- 准备两个电极溶液, 3 米氯化钾和 K+内部解决方案, 包括 (毫米) 75 天冬氨酸, 5 氯化镁2, 15 Ca (OH)2, 5 ATP 钠, 5 磷酸肌酸二钠, 5 谷胱甘肽, 20 拖把, 30 EGTA, pH 7.2 与 KOH。
注: 解决方案应事先准备好;K+内部解决方案可以存储在整除数-20 摄氏度。 - 用3米氯化钾填充压敏电极的拉玻毛细管. 使用 K+内部解决方案 (在步骤7.6 中为当前通过的电极编写);使用一个狭窄的非金属针 (34 口径) 连接到1毫升注射器, 以方便地填补玻璃毛细血管。轻轻敲击毛细血管以除去气泡;确保每个填充电极的电阻为 10-15 MΩ。
注: 使用数据采集软件检查并注意两个电极的电阻。 - 10分钟后, 使用常规 Ca2 +解决方案交换 4 Di Asp 解决方案。
8. 用荧光识别神经肌肉结点
- 使用标准亮场和荧光照明的直立显微镜, 寻找沿准备方向垂直于肌肉纤维的荧光绿色神经肌肉连接的明亮带, 如图 7A所示。使用低放大水浸泡目标 (~ 10 x) 识别神经肌肉连接
注: 显微镜应配备 FITC 立方体 (前: 480/40, 分色: 505LP, Em: 535/50), 和 LED, 激光, 卤素灯, 或汞灯荧光。为了尽量减少照片漂白, 在明亮场和荧光照明之间交替。
注意: 这个波段通常是在耳朵的底部比中线更近。该波段是神经肌肉结最集中的区域。 - 切换到更高的放大水浸泡目标 (~ 40 x), 并确定一个神经肌肉连接在顶层的肌肉检查与电生理学 (图 7B)。
- 根据制造商的指示, 在适当的 headstages 上确保填充的吸管进入吸管持有者。使用并联在确定的神经肌肉连接的100µm 内将电极放置在肌肉膜上方 (图 7C)。使用主要的光明场显微镜定位电极;使用荧光来确认电极相对于神经肌肉连接的位置。
- 首先, 使用低放大倍数 (~ 10 x) 目标定位电极, 然后切换到更高的放大倍数 (~ 40 x) 目标, 最终定位电极。此时不要将电极刺穿到肌肉中, 首先调整电极。
9. 调谐和刺穿电极
- 一旦电极定位在所需光纤之上, 零点, 并通过桥平衡 (或类似的方法) 调整电压传感电极, 并将电极电容按制造商的说明中和。此外, 零电流通过电极。
- 把两个电极都放到纤维表面。将电极的位置慢慢地调整到纤维上, 使电极保持与神经肌肉连接的方向, 如步骤8.3 和8.4 所述。
- 两个电极接触到肌纤维的表面后, 先刺穿钝电流通过电极。使用诸如嗡嗡声 (超电容补偿的短暂脉冲)、短暂的电流脉冲或轻轻敲击桌子以方便电极掷镖师掷的技术。
- 在数据采集软件中使用示波器或示波器协议监视信号, 直到识别出负膜电位, 这表明电极已被刺穿。
- 将更锋利的电压感应电极压低到肌肉上, 直至刺穿电流通过电极的水平。一旦两个电极彼此一致, 刺穿的电压感应电极使用相同的技术应用与电流通过电极。
- 在成功的掷镖师掷, 使用控制器为放大器, 应用一个恒定的负持有电流与电流通过电极, 以弥补任何膜损害, 由于电极掷镖师掷。当细胞开始慢慢向-80 mV 充电时, 根据需要增加保持电流, 使细胞达到预期的静止电位 (即,-80 到-85 mV)。
注意: 避免从纤维中记录在野生类型肌肉中需要比-25 nA 更大的保持电流, 以减少从不健康的纤维中记录的几率。 - 一旦纤维稳定了几分钟的预期休息电位, 继续记录肌肉膜的性质或神经肌肉传播。
10. 记录突触后膜特性和突触传输
- 从电流钳记录开始, 通过应用相等数量的正负电流步骤来测量相应的膜电压响应, 用于确定马达终板 R in 和τ m。要确保无源属性, 请使用达到稳定状态的小电压响应, 并具有线性电压电流关系16,19,20。避免从纤维上记录受损或不健康的神经, 这样的纤维有一个 mEPP 频率 > 3 赫兹。
- 接下来, 根据制造商的说明输入双电极电压钳。压钳纤维在膜电位为-85 mV。电压钳设置应实现信噪比, 使检测 mEPCs。
注意: 保持适当的电压控制可能是一个问题。我们使用两种方法来最小化这些问题。首先, 纤维被刺穿在马达终板的100µm 之内如前面描述, 在这些纤维的长度常数之内21。其次, 我们使用放大器的 DC 恢复功能。此功能设置了非常高的电压钳增益。我们以前的工作详细描述了此方法, 并概述了一种评估电压箝位板的方法16。 - 一旦在电压钳, 记录突触电流 (mEPCs 和 eEPCs) 使用各种神经刺激协议, 根据实验的要求。
- 记录自发 mEPCs 和 EPCs 使用低频神经刺激协议 (≤0.5 Hz), 使一个记录 EPCs 没有突触调制 (促进或调制), 以评估量子内容。为了评估突触促进或抑郁症, 使用高频神经刺激协议 (10 脉冲在50赫兹)。
- 通过一个刺激隔离单元刺激神经在期望的频率, 这可以被触发使用的脉冲发生器控制使用的数据采集软件。
- 一旦电压钳录音完成, 返回放大器的电流钳设置, 关闭所有电流, 并从纤维中取出电极。检查在录音过程中电极没有在基线电压中堵塞或漂移。
注: 关于漂移, 电极电压应为0伏特的胞外溶液, 因为它们是在纤维掷镖师掷之前设置的。例如, 如果电压在实验过程中漂移, 则记录的电压是不确定的。
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Representative Results
图 8显示了当前的脉冲 (图 8A) 和电压响应 (图 8B) 的一个例子, 从一个拉尔纤维下的电流钳, 从一个12周大的野生类型 R6/2 鼠标。mEPPs 的存在表明这些记录是从马达终板中取出的。这些记录是在正常的生理盐水溶液中获得的。可以分析这些当前钳位记录, 以确定该光纤16、19、20的 R in 和τm 。
图 9A显示了在电压钳条件下获得的 EPC 和两个 mEPCs 的代表性记录。消失模前的短暂电流偏转是神经刺激引起的伪影。通过事件检测软件可以更快地对 mEPCs 和 EPCs 进行分析。此工具允许研究员制作一个模板, 然后可以自动检测记录中的事件。这些事件可以叠加并导出到任何数据分析软件中。图 9B显示了具有代表性的光纤中的叠加 EPCs 和 mEPCs (嵌入)。
图 1: 的常规位置提耳伸肌肌肉
拉尔的肌肉位于头部的背表面。红色虚线突出显示用于在背上 (A) 和侧面 (B) 表面上去除皮肤的路径。拉尔附着在耳底, 因此大约1毫米的皮肤周围的耳朵应该保持完好, 以避免切割拉尔。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 已公开提耳伸肌肌肉
拉尔 (黄色和绿色) 位于皮肤下方, 是突出区域内最浅的肌肉。有两个部分的肌肉, 头骨 (黄色) 和尾鳍 (绿色) 地区。颅内区域出现于前四颈椎中线, 向耳廓基底前部延伸。为参考, 中线是一个结缔组织, 从肩胛 (白色箭头) 向鼻子运行。右, 左拉拉肌连接在颅中线。拉尔的颅骨部分比尾侧大得多。尾部部分附着在第四和第五颈椎中线附近, 连接到耳廓基底的后部。在解剖过程中, 在软骨耳周围保留几毫米的皮肤, 以防止切割的拉尔, 这是一个括号内虚线标记的数字。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 粗解剖提耳伸肌和周围的肌肉
一旦从动物身上移除, 组织被固定, 背侧向下 (拉尔在底部), 进入一个硅胶弹性体衬里菜使用细针做了如第5.3 节所述。一旦固定到底部的菜, 上覆的肌肉层可以被删除。通过耳道的昆虫别针用白色虚线箭头表示。黄色箭头显示理想的针脚放置, 以去除不需要的肌肉。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 肌肉层直接低于提耳伸肌
以蓝色突出显示的是 "外展耳" (AAL), 红色是耳针 scupularis (AS), 黄色是interscutularis (是)。拉尔是这个图像中的主要肌肉。为参考, 耳朵和周围的皮肤被一条实心黑线勾勒出来。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 硅胶-弹性体衬里, 自定义灌注室
显示的是自定义的35毫米灌注盘, 用于确保拉尔的电生理记录(A)。硅胶弹性体被用来制造一种适合于组织的表面。在房间的中心是一个圆形平台, 这是有益的, 当刺穿纤维。该平台支持肌肉纤维从下面当应用向下的力量与电极在掷镖师掷过程中。这个平台是通过允许有机硅弹性体形成到50毫升圆锥管的曲线形状。这种圆形硅弹性体的切片可以用更多的硅胶弹性体粘在房间的底部。在B和C中显示了菜式和侧面视图的轮廓表示形式, 在那里可以更清楚地看到灌注室。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 电生理学实验设置
一个小的两极电极是与磁性球关节机械手保持到位, 以刺激拉尔的神经。显微镜阶段可以方便地持有一个磁性平台使用的粘合剂磁性材料 (如可以发现在工艺或硬件商店制作冰箱磁铁)。还显示了 headstages 和电极放置在一个拉尔样品之上。一个重要的仪器是水浸泡, 斜面目标与陶瓷浸渍锥, 如图所示。斜面末端允许更容易的电极放置和陶瓷材料最小化电噪声。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 神经肌肉连接标识
所有的图像显示的拉尔染色5µM 4-2-Asp (绿色), 以允许可视化神经肌肉结。(A) 通过10X 目标查看肌肉时, 可以看到一个明亮的神经肌肉结带 (黄色箭头)。分支轴突也可以被视为由白色虚线箭头指示。(B) 小型共焦栈 (5 x 1 µm) 三神经肌肉结 (黄色箭头)。健康的肌肉纤维有清晰的条纹和多个 myonuclei, 出现在肌膜包裹的纤维 (白色箭头) 的黑点。通常支配神经肌肉结的轴突也可以观察到。(C) 带有染色神经肌肉连接的纤维, 它被玻璃电极刺穿。电极已经增强了一个白色的亮点, 使他们可以看到更容易。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: 膜性能的电流钳位记录
注入的电流脉冲 (A) 和由此产生的膜电位响应 (B) 记录在一个沐浴在生理盐水溶液中的拉尔纤维上。请单击此处查看此图的较大版本.
图 9: 双电极电压钳记录
在两电极电压钳 (A) 中记录的 EPC 和两个 mEPCs 的原始痕迹。从单个光纤 (B) 中叠加 EPCs 和 mEPCs (嵌入)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
这里描述的是制备和使用的小鼠拉尔肌肉测量神经肌肉传输在电流或电压钳条件下。解剖拉尔有几个重要的要点要考虑。在电极掷镖师掷中清除肌肉辅助组织中多余的结缔组织, 因为电极在定位掷镖师掷时可能会感染结缔组织。然而, 只有去除结缔组织, 可以很容易地被带走, 以限制伤害的机会, 肌肉。神经的隔离应该小心地进行, 因为它非常微妙。为了避免神经损伤, 将一些周围的组织连接到神经的末端是很有帮助的, 通过它可以放置一个别针来保证这个盘子的神经。同时, 注意不要在定位神经刺激器时粉碎神经。最后, 电极被刺穿纤维的顺序是重要的。钝电极不易刺穿, 应先刺穿。如果锋利的电极首先被刺穿, 钝电极可能推挤肌肉纤维在它刺穿膜之前, 可能导致锋利的电极从纤维出来。这将使得有必要刺穿纤维第二次与锋利的电极, 这将导致不必要的膜损害。使用的放大器也可以同时测量电流通过电极的电流和电压, 从而可以观察到膜电位中的负偏转, 表明电极已被刺穿。
拉尔的一个特点是有益的是能够同时移除两个肌肉。这对于在同一动物身上进行电生理学和分子生物学实验是很有效果的。这可以通过如下所述的基本协议来完成, 并进行细微的更改。按照标题1-3 中的所有步骤执行右侧和左侧所述的所有操作。在步骤 4, 最好是开始切割在延髓一侧的右耳朵, 以消除肌肉。如前所述, 始终保持叶片压在头骨上, 以尽可能深的削减, 使较低的肌肉附加到拉尔。继续切向右耳朵穿过中线, 保持刀片尽可能深。此时, 该过程的其余部分如本协议所述, 只对两个肌肉执行其余步骤。一旦肌肉被清洗, 一个拉尔可以被切断和冷冻后的分子分析, 另一个可以用于电生理学。这将是很难进行电生理学研究与两个肌肉的同一动物。要做到这一点, 必须切断中线, 以分离肌肉, 这样做可能会损害一些肌肉纤维。
由于其稀薄的性质使得终板和优秀的前体灌注1、3、4、5 ,6,7,8。除了使用 4-2-asp, 其他组已使用罗丹明 b-共轭 bungarotoxin 在低浓度 22.我们使用的拉尔的电生理检查, 嘌呤信号和缺陷亨廷顿氏病16,20。拉尔也很适合活体细胞成像研究。例如, 一些研究使用了拉尔测量突触囊泡释放和吸收23,24。这可以用染料来做, 比如 FM 1-43。
由于终板可以很容易地观察与荧光染色, 电极可以被放置在接近接近电机终板内的长度常数的肌肉纤维。电极放置在终板和使用高遵从性的双电极电压钳系统, 使调查人员能够完全控制的终板电位小于1% 错误16。这一点很重要, 因为在电流钳条件下记录的突触电位的非线性求和的常用校正方法10不考虑由实验条件引起的突触后膜的变化和/或疾病状态。例如, 减少休息终板电导将放大突触后电位19, 甚至那些修正的非线性求和。与此相反, 电压箝位突触电流不受非线性求和误差的作用, 与突触后膜性能无关。证明这一点, 我们最近显示了对比结果, 从终板电位比较的电流记录从超兴奋亨廷顿氏病骨骼肌肉16。
使用拉尔研究神经肌肉传输的最后一个关键优点是录音是从一个突触中记录出来的。神经肌肉的传输记录从一个单一的, 完全电压钳位板提供了一些最详细和准确的数据, 突触传输目前可用的, 这是理想的建模和解开突触的复杂性生理。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢马克 m. 富先生和丹尼尔. 米兰达的社论评论, 艾哈迈德. Khedraki 帮助建立了这项技术, 莱特州立大学提供财政支持 (启动基金到 A.A.V.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
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