Summary
Протокол, описанных в данном документе использует мыши поднимающей auris Лонг (Лал) мышц для записи Спонтанная и вызывали нерва постсинаптических потенциалов (ток зажим) и токов (мембраной) на стыке нервно. Использование этой техники может обеспечить понимание ключевых механизмы синаптической передачи в условиях нормальных и болезни.
Abstract
Этот протокол описывает метод для записи синаптической передачи от перекрестка нервно условиях ток зажим и напряжения зажим. Ex vivo подготовка поднимающей auris Лонг (Лал) используется, потому что это тонкая мышца, которая обеспечивает простой визуализации перекрестка нервно шампур микроэлектродные на мотор концевую. Этот метод позволяет для записи спонтанное миниатюрный концевой потенциалов и токов (mEPPs и mEPCs), вызывали нерва концевую потенциалов и токов (ЭПТ и ПЭК), а также свойства мембраны мотор концевую. Результаты, полученные из этого метода включают квантовый контент (QC), количество пузырьков релиз сайтов (n), вероятность везикул релиз (prel), синаптического облегчения и депрессии, а также постоянная времени мышечные мембраны (τ m) и входное сопротивление. Применение этого метода для мыши модели болезней человека можно выделить основных патологий в положениях заболеванием и помочь определить стратегии Роман лечения. От полного напряжения зажима один СИНАПС, этот метод обеспечивает один из наиболее подробный анализ синаптической передачи имеющихся в настоящее время.
Introduction
Изучая синаптической передачи на стыке нервно обеспечивает понимание динамической взаимосвязи между нервной и скелетной мышечной систем и является прекрасной моделью для изучения синаптических физиологии. Поднимающей auris Лонг (Лал) является тонкой мышцы, позволяя для нервно соединения легко визуализировать. Предыдущие доклады описал удобство использования Лал для изучения синаптических наркотиков и токсинов и характеризуются скелетных мышечных волокон типа характеристики Лал1,2. Многочисленные исследования использовали Лал для изучения нервно-мышечной физиологии3,4,5,6,,78. Электрофизиологии способность легко наблюдать Лал нервно развязок позволяет для точного размещения микроэлектродов на мотор концевую и значительно уменьшает проблемы зажим пространство в записи синаптической передачи. Ток зажим записи мышечные мембраны свойств, таких как постоянная времени мембраны (τм) и входное сопротивление (Rв) легко получаются. Кроме того эти свойства могут быть измерены от же мышечных волокон, используемых для записи нервно-мышечной передачи, что позволяет для прямого сравнения синаптических функции для свойства мембраны мышц. Анализ этих данных может обеспечить понимание ключевых физические механизмы многих государств изменения активности и нервно-мышечных заболеваний.
Ключевым аспектом метода, описанного здесь является использование напряжения зажим для синаптических записей, которые не подлежат нелинейностей, встречающихся в ток зажим и не зависят от свойств мембраны мышц. Преимущества использования напряжения зажим в отличие от тока зажим для изучения нервно-мышечной передачи были созданы новаторские усилия в 1950-х9. Под ток зажим ЭПТ, которые превышают 10-15 МВ в амплитуде являются не линейный продукт МОСТП амплитуды9. Например, если средняя МОСТП 1 МВ, EPP 5 МВ может считаться продукта 5 mEPPs (КК 5); тогда, как EPP 40 мВ будет продуктом более чем 40 mEPPs. Это нелинейность в больших ЭПТ происходит потому, что движущей силой для Европейской народной партии, которая является разница между мембранный потенциал и потенциал равновесия для ацетилхолиновый рецептор (~ -10 МВ), существенно уменьшается во время больших ЭПТ. Эта проблема избегается в экспериментах мембраной потому, что мышцы мембранный потенциал не меняется во время экспериментов мембраной. Недостатком является, что напряжения зажим эксперименты технически сложнее, чем ток зажим записи. Имея это в виду McLachlan и Мартин разработал простой математической исправление, которое приходится нелинейностей в ток зажим записи ЭПТ10. Исправления хорошо работают11,12,13, но главное, предположим, что свойства мембраны мышцы не нарушена.
Свойства мембраны мышцы особенно важно учитывать при изучении условий или заболеваний государств, которые нарушают мышцы. Например скелетных мышц от R6/2 трансгенные модели болезнь Хантингтона является hyperexcitable из-за постепенного сокращения в отдыхая хлорид и калия токи14,15. Как следствие mEPPs и ЭПТ усиливаются в скелетных мышцах R6/2. Конечно можно изменить дополнительные факторы mEPPs и ЭПТ. Работа с другой модели мышей болезни Гентингтона (R6/1) обнаружил изменения в ЭПТ, которые, казалось, быть связаны с ЛОВУШКОЙ белки8. Для оценки механизмов, вызывающих измененное нейромышечную передачу, было бы полезным для ликвидации последствий свойства мембраны измененных мышц с помощью мембраной. В недавнем исследовании нервно-мышечной передачи R6/2 было исследовано обоих условиях ток и напряжение зажим, используя метод, описанный здесь. Совокупность мотор endplates были напряжения зажимается с менее чем 1% ошибок, поставив два микроэлектродов в рамках постоянной длины концевую16. Это было показано что мембраной и исправления записи ток зажим, приносят контрастные измерения нервно-мышечной передачи в R6/2 мышц. Это подчеркивает, что это может быть трудно исправить ЭПТ для нелинейностей, если были изменены свойства мембраны мышц и показывает преимущества получения мембраной записей, которые не зависят от свойств мембраны мышц. Протокол, представленные здесь идеально подходит для изучения условий или болезненных состояний, которые влияют на свойства постсинаптической мембраны и синаптической передачи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные процедуры выполнялись в соответствии с животное уход и использование Комитета Райт государственный университет.
1. мышь эвтаназии
- В Зонта поместите курсор мыши в герметичном стекла, обезболивающим камеры.
- Разоблачить мыши через вдыхание к смертельной дозы изофлюрановая (насыщения, или ~ 25%). Оставьте мышь в камере до тех пор, пока нет дыхания можно наблюдать.
- Удаление мыши из камеры и выполнять шейки матки дислокации как дополнительный метод эвтаназии.
2. Удаление волос от дорсальной поверхности головы, шеи и спины
- Чтобы удалить часть волос на дорсальной поверхности головы, шеи и задней части мыши используйте электробритвы. Кроме того удаление волос вокруг и на левом ухе.
Примечание: Будьте внимательны, когда бритья кожу вокруг ушей, кожа может получить уловленным в лезвия бритвы и могут повредить базовый мышечной ткани. - Применять крем для удаления волос с ватным тампоном бритая области, чтобы удалить оставшиеся волосы. Подождите примерно 1 мин и промыть крем удаления волос с водой, с использованием вымойте бутыль, затем отчищать любые оставшиеся крем или волос, используя ватный тампон и погладить кожу сухой.
3. Удалите кожу подвергать мышца поднимающая Auris
- Под микроскопом стерео рассечения Сделайте небольшой надрез (просто достаточно глубоко проникнуть в кожу) на задней части мыши на уровне лопатку. Вырежьте кожу микро Рассечение ножницами, следуя по пути, показано на рисунке 1A-B.
- С помощью тонкой щипцы (например, № 5), подтяните кожу вдоль разреза вблизи лопатку. Весной ножницами, вырежьте соединительной ткани, чтобы отделить кожу от основной мышечной ткани при подходе к уха. Главное вырежьте соединительной ткани с лезвиями, указал в кожу, чтобы избежать случайного резки подвергаются мышечной ткани.
- Периодически perfuse подвергаются мышцы раствором физиологического раствора, например следующих Na+ внешний буфер, который состоит из (в мм): 144 NaCl, 4 KCl, 1.2 CaCl2, 0.6 MgCl2, 5 глюкозы, 1 NaH2PO4, рН 7,4 с NaOH и имеет осмотического давления 300 ± 5 ммоль/кг. Как только соединительной ткани было сокращено до левого уха, вырежьте кожу вокруг уха, чтобы полностью удалить кожу от мыши и выбросьте его.
Примечание: Лал прикрепляется к основанию уха и легко могут быть повреждены при удалении кожи. Это хорошо оставить около 1 мм кожи вокруг основания ухо, чтобы избежать резки Лал.
4. Удаление мышца поднимающая Auris и окружающие ткани
- С помощью ножниц весной, начните с резки мышцы, которые уступают Лал, которые подключаются к позвоночника между лопатку. Начало в правой лопатки, только справа от средней линии и вырезать ростральной конце мыши, оставаясь на правой стороне от средней линии. Продолжать резка вплоть до конца мышечной ткани на черепной коробки.
Примечание: Лал является наиболее поверхностные мышцы, соединен с медиальной стороны уха и средней линии, как показано на рисунке 2. Для дополнительных изображений книга ЕС Грин17 показывает отличные, рисованной изображения Лал. - Используйте корнцанг захватить резки ткани сразу справа от средней линии, а затем аккуратно поднять и начать резки ткани на левом ухе с лезвиями ножниц, прижавшись черепной коробки, чтобы удалить несколько слоев мышц, которые уступают левой Лал. Оставьте все слои придают временно избежать случайного резки Лал во время удаления.
- Вырезать с лопастями параллельно и прижимается черепной коробки, чтобы избежать Резка нерв, который иннервирует Лал, которая оборачивает вокруг слухового прохода и вводит мышцы на медиальной стороне уха. Далее, проходящем через канал уха, сохраняя столько нерва, придает как можно скорее.
Примечание: Нерв, который поставляет Лал ветви офф лицевого нерва и должны быть сохранены, как он будет использоваться позже в процедуре. - Вырежьте жировой ткани, это просто мимо ушного канала вдоль по тому же пути, показано на рисунке 1B на вентролатеральные части уха. Кроме того разрезать вдоль левой лопаточной кости, как это было сделано на правой стороне, чтобы полностью удалить мышцы от мыши.
5. Лонг Auris поднимающей мышцы изоляции
- Поместите Лал и окружающие ткани, в контейнер. Используйте контейнер, в котором Иссеченную ткань может быть закреплен на дно, например Петри с дном из эластомера силикона. Купаться и часто мыть ткань в растворе физиологического раствора.
- Отрезать Пинна ухо вдоль основания уха, оставляя хрящевой части уха придает Лал. Флип мышцы, таким образом, чтобы нижняя сторона вверх (Лал в нижней части блюдо).
- Установите PIN-код, таких как насекомых pin, через канал уха держать prep на месте. Затем с помощью меньших булавки, контактный оставшиеся ткани на противоположной стороне срединной Лал. С помощью щипцов, осторожно потяните кожу на боковой части уха растянуть мышцы и место небольшой штырь через кожу. Повторите этот шаг до тех пор, пока ткань хорошо обеспеченных на блюдо, как показано на рисунке 3.
Примечание: Небольшой рассечение булавки могут быть сделаны резка кончики акупунктуры иглами до нужной длины. Эти небольшие контакты к минимуму повреждение тканей и может использоваться с целями Микроскоп погружения в воду с длиной рабочего расстояния. - Начать удаление мышц (показано на рис. 4), которые охватывают Лал (auricularis Улучшенный, похититель auris Лонг и interscutularis), и тех, кто обязан Лал через соединительной ткани и особенно жесткой вблизи Срединная, используя ножницы пинцет и весной № 5.
- С помощью щипцов подтянуть на слое покрывающей мышц, вырезать соединительной ткани с лезвиями, ориентированный на будучи вытягиванным слой мышц и заботиться, чтобы избежать резки или уменьшение поперечного сечения Лал. Cut к срединной и остановить резки примерно три четверти пути к средней линии. Затем вырежьте параллельные срединной линии, чтобы удалить каждый слой мышц. Держать Удаление слоев мышц, пока остается только Лал.
- Удалите некоторые из оставшихся соединительной ткани, которая покрывает Лал, которая помогает в шампур электродов. Осторожно используйте пинцет № 5 тянуть соединительной ткани от Лал и резать прочь используя ножницы весной. Удалите только ткани, что может быть сделано так легко без риска повреждения Лал в процессе. Удалите любые большие нервы, которые иннервируют слоев уступает мышц, оставшиеся на нижней поверхности Лал, которые могут препятствовать визуализации нервно развязок.
6. изоляция нерва
- Идентифицировать нерв, который иннервирует Лал, используя нейростимулятор (например, два платинового провода подключены к генератор импульсов); Там будет несколько нервов, работает из ушного канала к мышцам. Touch нервы с нейростимулятор поставки некоторых текущих (ток будет отличаться около 5 V). Когда мышцы контрактов, было определено правильное нерва.
- Тщательно захватить ткань возле нерва и использовать ножницы весной отделить от тканей, окружающих ушной нерв. Чтобы свести к минимуму ущерб, сохранить большую часть нерва, встроенные в некоторые окружающие ткани, который будет использоваться позднее для обеспечения нерва на запись блюдо.
Примечание: Двигательного нерва, который иннервирует Лал расположен на медиальной стороне открытия канала уха. - Если с помощью биполярного электрода стимулирования, удалите окружающие ткани только вокруг региона нерва, дистальная от мышц. Если с помощью всасывания электрода, удалите окружающие ткани в конце разреза нерва.
Примечание: Это хорошая остановочный пункт. Это хороший остановочный пункт. Если перерыв требуется расчлененных Лал prep может быть поддерживается в физиологическом растворе или постоянной перфузии на пару часов, чтобы обеспечить, что вредные метаболиты не накапливаются. Используйте большой объем раствора или константа перфузии чтобы убедиться, что вредные метаболиты не накапливаются. - Далее открепить и передать перфузии камеру для экспериментов электрофизиологии под вертикальный составной микроскоп мышцы.
Примечание: Использование перфузионного камеры с мягким дном какой ткани может быть надежно закреплен (Рисунок 5A). - PIN-код мышц на концах (уха и срединной линии) и вдоль края мышцы. Позиция перпендикулярной мышечных волокон нерва и закрепите его на дно тарелки через некоторые избыточной ткани, который остался неизменным в конце нерва. Держите ткани, купались в растворе физиологического раствора на все времена.
Примечание: Это также полезно округлые, повышенных материала непосредственно под Лал мышечных волокон. Эта дополнительная поддержка помогает в электрод шампур и могут быть сделаны из небольшой участок силиконового эластомера бросили в 50 мл Конические трубки, лежа на боку. Округлые секции эластомер может быть обеспечено в нижней части камеры перфузии, используя небольшое количество свежего силикона. Схема палаты перфузии показано на Рисунок 5B-C. Мышечные волокна могут очень жестко придерживаться недавно литой силиконового эластомера (который очень гидрофобные) и может стать повреждены. Это полезно для пальто или блок недавно бросили силикона с белком, похож на блокирование шаг в immunoblot. Чтобы заблокировать его, мы инкубировали недавно Литой силиконовая в концентрированный раствор альбумина bovine сыворотки на ночь.
7. электрофизиологии Настройка оборудования
- Подготовка или разморозить аликвоты краска для оказания помощи в визуализации нервно-Джанкшн, например митохондриальной краситель 4-(4-diethylaminostyryl)-1-метилпиридиния18, который светочувствительных и следует хранить вдали от света. Кроме того оттепель электрода решения. Вихревой все аликвоты для обеспечения того, чтобы все растворенных веществ в растворе. Приготовляют раствор физиологического раствора, содержащего 1 мкм µ-Conotoxin GIIIB (μ-CTX) и 80 мкм BTS (необязательно).
- Безопасность камеры перфузии с Лал для микроскопа. Положите электрод сравнения в Кубок, наполненный 3 M KCl, который подключен к записи камеру через мост агар. Подключите электрод сравнения к усилителю на инструкции производителя.
- На данный момент позиция нерв стимулирующего электрода на нерв. Используйте всасывания электрода или небольшой биполярного электрода, как они работают хорошо для стимуляции нерва.
- Расположите стимулирующих электродов как далеко от мышц как можно свести к минимуму количество артефактов стимуляции в записи.
Примечание: Стимулирующие электроды должны контролироваться с единицей изоляции стимул, который может контролировать амплитуды напряжения при необходимости.
- Расположите стимулирующих электродов как далеко от мышц как можно свести к минимуму количество артефактов стимуляции в записи.
- Медленно поднимите напряжение, повернув регулятор напряжения на блоке стимул изоляции до тех пор, пока схватки наблюдаются. Точка, в которой впервые было отмечено сокращение является порог. После того, как был определен порог, установите напряжение на стимул изолятор на 1,5 * порог (или как это определено эксперимент).
Примечание: На рисунке 6 показан prep мышц при вертикальном положении микроскопа и небольшой биполярный электрод располагается на нерв, с помощью манипулятора шарик совместное. Это выгодно иметь низкое напряжение для стимуляции можно еще будучи достаточно выше порога. Меньшее напряжение стимул снижает количество артефактов стимуляции во время записи. Кроме того размещение стимулирующих электродов от мышцы будет уменьшить размер стимуляции артефакт. Иногда в конце нерва будет поврежден от вскрытия, так что это может быть необходимо экспериментировать с по нерву стимулятор должны быть помещены. - Удаление купания физиологический раствор и замените 5 мкм 4-ди-2-Asp. Разоблачить Лал prep в 4-ди-2-ASP для 10 мин для достижения адекватного флуоресценции для визуализации нервно-Джанкшен (рис. 7).
- Подготовьте два электрода решения, 3 M KCl и K+ внутреннего раствор, состоящий из (в мм) 75 аспартат, 5 MgCl2, 15 Ca(OH)2, 5 СПС динатриевой, динатриевой 5 фосфокреатина, 5 глутатион, 20 MOPS, 30 EGTA, рН 7,2 с Кох.
Примечание: Решения должны быть подготовлены заранее; K+ внутренние раствор может храниться в аликвоты при-20 ° C. - Заполните вытащил стеклянный капилляр для зондирования напряжения электрод с 3 M KCl. Используйте K+ внутренние решение (подготовленные в шаг 7.6) для электрода ток передача; Используйте узкие неметаллических иглы (~ 34) прилагается к 1 мл шприц легко заполнить стеклянные капилляры. Аккуратно нажмите капилляров для удаления пузырьков воздуха; Убедитесь, что каждый заполненный электрод имеет сопротивление 10-15 MΩ.
Примечание: Проверить и отметить сопротивления обоих электродов, используя программное обеспечение получения данных. - После 10 минут обмен решение 4-ди-Asp с нормальной Ca2 + решение.
8. Идентификация нервно-Джанкшн, используя флуоресцирования
- Используя прямо микроскопом с стандарта ярко поле и флуоресцентной подсветки, посмотрите на полосу Яркий флуоресцентный зеленый нервно развязок, работает перпендикулярно мышечных волокон вдоль prep, как показано на рис. 7A. Используйте малое увеличение цель погружения в воду (~ 10 X) для идентификации нервно-перекрестки
Примечание: Микроскоп должна быть оснащена FITC куб (Ex: 480/40, Дихроичные: 505LP, Em: 535/50) и светодиод, лазер, галогеновая лампа или ртутная лампа для флуоресценции. Чтобы свести к минимуму фото отбеливание, поочередно ярко поле и флуоресценции освещения.
Примечание: Эта группа обычно более проксимальном к основанию уха чем от средней линии. Группа-это регион, где наиболее сосредоточены нервно развязок. - Перейти к более высокой цели увеличения погружения в воду (~ 40 X) и определить нервно-Джанкшн на верхний слой мышц для изучения с электрофизиологии (рис. 7B).
- Закрепите заполненные пипетки в пипетку держатели на соответствующей headstages, в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте микроманипуляторы для расположения электродов выше мышечные мембраны в пределах 100 мкм выявленных нервно соединения (рис. 7 c). Положение электродов, используя прежде всего светлые области микроскопии; Используйте флуоресценции для подтверждения расположения электродов по отношению к нервно-Джанкшен.
- Во-первых используйте низкий масштаб (~ 10 X) цель найти электродов и затем перейти к более высокой цели увеличения (~ 40 X) для окончательного расположения электродов. Не сажать электродов в мышцу на данный момент, первый мотив электродов.
9. тюнинг и Пронзающий электродов
- После того, как электроды расположены выше желаемого волокна, ноль и настраивать напряжение зондирования электрода балансировки моста (или аналогичный подход) и нейтрализации электрода емкости в соответствии с инструкциями изготовителя. Кроме того нулевой ток прохождение электрода.
- Принесите обе электродов до поверхности волокна. Медленно отрегулируйте положение электродов на пути вниз волокна, таким образом, чтобы электроды остаются ориентированной отношении нервно-Джанкшн, как описано в шагах 8.3 и 8.4.
- После того, как оба электроды связались с поверхности мышечных волокон, прокалывать тупым электрода ток прохождение сначала. Используйте методы, такие как шум (краткий импульсов избыток емкости компенсации), краткий импульсов тока или нежно выстукивать в таблице для облегчения электрода шампур.
- Мониторинг сигнала, с помощью осциллографа или осциллограф протокол сбора данных, пока не выявлены негативные мембранного потенциала, который указывает, что электрод был приколот.
- Отожмите острее напряжение зондирования электрода на мышцы до уровня приколот электрода ток передачи. После того как оба электроды соответствуют друг другу, прокалывать напряжение зондирования электрода, используя те же приемы, применяется с электрода ток передачи.
- После успешного шампур, с помощью контроллера для усилителя примените постоянной отрицательной, проведение текущих с текущей передачи электродом для компенсации любой мембраны повреждения электрода шампур. Как клетка начинает медленно поручить к -80 МВ, увеличение тока как проведение необходимо принести желаемый отдых потенциальных клетки (то есть, -80 в -85 МВ).
Примечание: Избегайте записи из волокон, которые требуют проведения ток в абсолютном значении больше nA-25 в дикого типа мышц к минимуму вероятность записи от нездоровой волокон. - После того, как волокно является стабильным за пару минут на желаемый отдых потенциал, приступить к записи свойства мембраны мышц или нервно-мышечной передачи.
10. запись свойства постсинаптической мембраны и синаптической передачи
- Начните с записи ток зажим, применяя равное количество положительных и отрицательных текущих шагов для измерения соответствующие ответы напряжение мембраны, которые будут использоваться для определения мотор концевую Rв и τм. Для обеспечения пассивной свойства, используйте небольшое напряжение ответы, которые достичь стабильного состояния и линейной зависимости вольт амперной16,19,20. Избегайте записи из волокон с поврежденной или нездоровый нерва, такие волокна имеют частоту МОСТП > 3 Гц.
- Далее введите две электрод мембраной в инструкции производителя. Напряжение зажим волокон на потенциал мембраны -85 МВ. Параметры напряжения зажим следует достичь соотношения сигнал шум, которые позволяют выявлять mEPCs.
Примечание: Поддержание адекватного напряжения управления может быть проблемой. Мы используем два метода для минимизации этих проблем. Во-первых волокна пронзил в пределах 100 мкм мотор концевую как описано ранее, который находится в постоянной длины этих волокон21. Во-вторых мы используем функцию восстановления DC усилителя. Эта функция устанавливает очень высокого напряжения зажим выгоды. Наши предыдущие работы описал этот метод в деталях и изложил метод оценки напряжения зажат концевую16. - Однажды в напряжения зажим, запись синаптических токов (mEPCs и eEPCs) с использованием различных протоколов стимуляции нерва, на основе требований эксперимента.
- Запись спонтанное mEPCs и Пэк, с использованием протокола стимуляции нерва низкой частоты (норме Гц), который позволяет запись Пэк без синаптических модуляции (содействие или модуляции) для оценки квантильного содержание. Чтобы оценить синаптического облегчения или депрессии, используйте протокол стимуляции нерва высокой частоты (10 импульсов частотой 50 Гц).
- Стимулирование нерва на желаемой частоты через изолятор стимул, которые могут быть вызваны с помощью генератора импульсов, который управляется с помощью программного обеспечения сбора данных.
- Как только сделаны записи мембраной, вернуть значение тока зажим усилителя, выключить все течения и снимите электроды из волокна. Проверьте, что сделал не засоряются электродов или дрейфа в базовых напряжения во время записи.
Примечание: Относительно дрейф, электродом напряжения должно быть 0 вольт в внеклеточной решения, как они были установлены перед волокна шампур. Например записанные напряжения будет неопределенной, если напряжение дрейфовал в ходе эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 8 показан пример импульсов тока (рис. 8A) и напряжения ответов (Рисунок 8B) от одного волокна Лал под ток зажим от 12-недельных дикого типа R6/2 мыши. Наличие mEPPs указывает, что эти записи были взяты из мотора концевую. Записи были получены в растворе нормального физиологического раствора. Эти записи ток клещи могут быть проанализированы для определения Rв и τm 19,, волокна в16,20.
Представитель запись EPC и два mEPCs, полученные в условиях мембраной, показан на рис. 9A. Краткий текущий прогиб, предшествующих EPC является артефактов, вызванных стимуляции нерва. Анализ mEPCs и Пэк могут производиться быстрее с событий обнаружения программного обеспечения. Этот инструмент позволяет исследователю сделать шаблон, который затем может автоматически обнаруживать события в записи. События могут быть накладывается и экспортированы в любое программное обеспечение для анализа данных. Рисунок 9B показывает накладывается Пэк и mEPCs (вставка) от представителя волокна.
Рисунок 1 : Общее расположение поднимающей auris Лонг мышца
Лал мышцы расположен на дорсальной поверхности головы. Красной пунктирной линией освещает путь для резки кожи для удаления на спинной (A) и (B) боковой поверхности. Лал придает основанию уха, таким образом около 1 мм кожи вокруг основания ушей должны оставаться нетронутыми во избежание резки Лал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Подвергаются поднимающей auris Лонг мышца
Лал (желтый и зеленый) расположен под кожу и является наиболее поверхностные мышцы в выделенной области. Есть две части мышцы, черепных (желтый) и каудальные (зелёный) регионах. Черепной региона возникает от средней линии на первых четырех шейных позвонков и бежит к передней части основания ушной раковины. Для справки средней — это полоса соединительной ткани, которая проходит от лопатку (белая стрелка) к носу. Лал мышц справа и слева подключиться на средней линии через череп. Черепной частью Лал гораздо шире, чем хвостовой части. Хвостовая часть придает рядом срединной линии на четвертого и пятого шейного позвонка и подключается к задней части основания ушной раковины. Во время вскрытия держите пару миллиметров кожи вокруг хряща уха для предотвращения резки Лал, которая характеризуется скобки пунктирной линией на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Сырой рассечение поднимающей auris Лонг и окружающих мышц
После удаления из животного, ткани является закрепленного, спинной стороне вниз (Лал на дно), в силиконовые эластомера выстроились блюдо с помощью тонкой булавки, как описано в разделе 5.3. Закрепив в нижней части блюдо, вышележащих слоев мышц может быть удален. С белой пунктирной стрелкой указывается насекомых ПИН через канал уха. Желтые стрелки показывают размещение идеально ПИН для удаления нежелательных мышц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Мышцы слой непосредственно уступает поднимающей auris Лонг
Выделены в синий похититель auris Лонг (AAL), в красной auricularis scupularis (AS), и в желтом является interscutularis (IS). Лал является основным, лежащие в основе мышцы в этот образ. Для справки уха и кожу вокруг изложена сплошной черной линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Силиконовые эластомера подкладке, пользовательские перфузии камеры
Показано блюдо перфузии пользовательских 35 мм используется для обеспечения Лал для электрофизиологических записи (A). Силиконового эластомера был использован для создания поверхности подходит для тоскует ткани. В центре камеры — это округлые платформа, которая полезна при Пронзающий волокна. Платформа поддерживает мышечных волокон из под когда применение вниз сила с электродами во время шампур процесс. Эта платформа сформировалась, позволяя силиконового эластомера в форме кривой 50 мл Конические трубки. Кусочек это округлые силиконового эластомера может затем быть приклеены к нижней части камеры с более силиконового эластомера. Изложено представление блюдо, а также представление на стороне показаны в B и C , где перфузии камеры можно увидеть более четко. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Электрофизиологии эксперимент set-up
Небольшой биполярный электрод проводится на месте с магнитным манипулятором запахозапирающим стимулировать нервные Лал. Этап микроскопа можно сделать легко провести магнитные платформы с использованием клея магнитного материала, (как можно найти на судно или магазине для изготовления магниты на холодильник). Также изображены headstages и электроды расположены выше пример Лал. Важным инструментом является погружения в воду, скошенный цель с керамической погружения конуса, как показано. Срезанный конец позволяет облегчает электрод размещения и керамический материал минимизирует электрических шумов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Нервно-Джанкшен идентификации
Все изображения показывают Лал, окрашенных с 5 мкм 4-ди-2-Asp (зеленый) для визуализации нервно развязок. (A) A яркие группы нервно узлов может быть увидено (Желтые стрелки) при просмотре через 10 X цели мышцы. Ветвление аксоны может также рассматриваться как белой пунктирной стрелкой. (B) малых конфокальный стеков (5 x 1 мкм) три нервно развязок (Желтые стрелки). Здоровые волокна мышцы имеют четкие страт, а также несколько myonuclei, которые появляются как темные пятна вдоль сарколеммы волокна (белые стрелки). Часто также может наблюдаться аксонов, иннервирующих нервно развязок. (C) A волокно с окрашенных нервно-Джанкшн, который пронзил с стеклянных электродов. Электроды были расширены белым цветом так, что они могут рассматриваться более легко. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8 : Тока зажим запись свойств мембраны
Вводят импульсов тока (A) и результате мембраны, потенциальной реакции (B) записана из одного волокна Лал купались в физиологической физиологический раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9 : Два электрод мембраной записи
Сырые след EPC и два mEPCs записаны в двух электродом напряжения зажим (A). Накладывается Пэк и mEPCs (вставка) от одного волокна (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные здесь является подготовка и использование мыши Лал мышц для измерения нервно-мышечной передачи зажим тока или напряжения условиях. Есть несколько важных моментов, чтобы рассмотреть для рассечения, Лал. Очистки излишки соединительной ткани от СПИДа мышц в электрод шампур, как электроды можно загвоздка соединительной ткани, когда их позиционирование на шампур. Однако, только удалить соединительной ткани, которые могут быть приняты прочь легко, чтобы ограничить вероятность повреждения мышц. Изоляции нерва должны выполняться с осторожностью, потому что это очень деликатный. Чтобы избежать повреждения нерва, целесообразно оставить некоторые из окружающих тканей, прилагается к концу нерва, через который могут быть размещены PIN-код для обеспечения нерва на блюдо. Кроме того заботиться, чтобы не раздавить нерва при позиционировании нейростимулятор. Наконец важен порядок, в котором электроды пронзил в волокна. Тупой электрода не так просто сажать и должно быть приколот сначала. Если резкое электрода были пронзил во-первых, тупым электрода может подтолкнуть мышечные волокна, прежде чем он пробивает мембрану, возможно, причиной резкого электрода из волокна. Это сделало бы его необходимо сажать волокна во второй раз с острыми электродом, который бы повредить ненужные мембраны. Это также полезно, что усилитель используется одновременно можно измерить тока и напряжения токовый электрод ближнего так, что может наблюдаться отрицательное отклонение в мембранного потенциала, указав, что электрод был приколот.
Одной из особенностей Лал, которая может быть полезной является возможность удалять обе мышцы одновременно. Это может быть большим для выполнения экспериментов электрофизиологии и молекулярной биологии в то же самое животное. Это может быть достигнуто, следуя по сути тот же протокол, описанные здесь, с незначительными изменениями. Выполните все шаги по статьям 1-3, делает все, что описано на правой стороне, так и слева. На шаге 4 то лучше для начала резки на стороне вентролатеральные правого уха для удаления мышц. Как описано ранее, всегда держите лезвия, прижавшись черепа сократить как можно, оставив нижней мышцы придают Лал глубже. Продолжать вырезать направлении правого уха мимо средней линии, сохраняя лезвие так глубоко, как это возможно. На данный момент, остальная часть процедуры как описано в настоящем Протоколе, только выполнять оставшиеся шаги на обоих мышцы. После того, как мышцы были очищены, один Лал можно резать прочь и замороженных позднее молекулярного анализа, и другие могут быть использованы для электрофизиологии. Было бы трудно выполнить исследования электрофизиологии с обеих мышцы же животного. Чтобы сделать это, должны быть срезаны midline отделить мышцы и делать так скорее всего повредит некоторых мышечных волокон.
Лал уже давно используется для изучения нейромышечную передачу, потому что его тонкий характер позволяет легко идентифицировать мотор endplates и отличные ex vivo перфузии1,3,4,5 ,6,,78. Помимо использования 4-ди-2-asp другие группы использовали конъюгированных rhodamin bungarotoxin в низких концентрациях22. Мы использовали Лал электрофизиологических исследований, purinergic сигнализации и дефекты в болезни Гентингтона16,20. Лал идеально подходит для изображений исследования клеток. Например некоторые исследования использовали Лал для измерения синаптических пузырьков выпуска и поглощение23,24. Это может быть сделано с помощью красителей, таких как FM 1-43.
Потому что endplates может быть легко наблюдается с флуоресцентные пятна, электроды могут быть размещены в непосредственной близости от двигателя концевую в рамках постоянной длины волокна мышцы. Размещения электрода на концевую и использование системы высокой соблюдения двух электродом напряжения зажим позволяет следователям полностью контролировать потенциальные с менее чем 1% ошибок16концевую. Это может быть важно, потому что часто используемых исправлений для нелинейных суммирование синаптических потенциалов, записанный под условия ток зажим10 не учитывает изменения в постсинаптической мембраны, вызванные экспериментальных условий и/или болезненное состояние. Например сокращение отдыха концевую барорефлекторного усилится постсинаптических потенциалов19, даже те, исправления для нелинейных суммирования. В отличие от напряжения зажат постсинаптических токов не подвергаются нелинейной суммирования ошибок и не зависят от свойств постсинаптической мембраны. Продемонстрировать это, мы недавно показали, сравнивая результаты от концевую потенциалов по сравнению с токами, записанная с гипер возбудимых болезни Гентингтона скелетных мышц16.
Окончательный ключевым преимуществом использования Лал для изучения нервно-мышечной передачи являются записи от одного синапса. Нейромышечную передачу, записанная из одного, полностью зажимается напряжения концевую предоставляет некоторые из самых подробных и точных данных о синаптической передачи имеющихся в настоящее время, который идеально подходит для моделирования и распутывая сложности синаптической Физиология.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Марк м. богатые и Даниэль Миранда за редакционные комментарии, Ахмад Khedraki за помощь в создании этой техники и Райт государственный университет для финансовой поддержки (запуска фонд A.A.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. The anatomy of the rat. , Hafner Pub. (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. Electric current flow in excitable cells. , Clarendon Press. (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
