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Neuroscience

उंनमनी Auris लंग्स वोल्टेज क्लैंप शर्तों के तहत स्तनधारी Neuromuscular ट्रांसमिशन की परीक्षा के लिए तैयारी

Published: May 5, 2018 doi: 10.3791/57482
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Wright State University

Summary

इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल माउस का उपयोग करता है उंनमनी auris लंग्स (लाल) मांसपेशी को रिकॉर्ड करने के लिए सहज और तंत्रिका पैदा की postsynaptic क्षमता (वर्तमान दबाना) और धाराओं (वोल्टेज-दबाना) neuromuscular जंक्शन पर. इस तकनीक का उपयोग सामांय और रोग की स्थिति के तहत synaptic संचरण के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल के लिए एक तकनीक का वर्णन के तहत neuromuscular जंक्शन से synaptic संचरण रिकॉर्ड वर्तमान दबाना और वोल्टेज-क्लैंप शर्तों । उंनमनी auris लंग्स (लाल) की एक पूर्व vivo तैयारी का प्रयोग किया जाता है, क्योंकि यह एक पतली मांसपेशी कि मोटर microelectrode में endplate के लिए neuromuscular जंक्शन के आसान दृश्य प्रदान करता है । इस विधि सहज लघु endplate क्षमता और धाराओं की रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है (mEPPs और mEPCs), तंत्रिका पैदा की endplate क्षमता और धाराओं (EPPs और ईपीसी), साथ ही मोटर endplate के झिल्ली गुण. इस विधि से प्राप्त परिणाम quantal सामग्री (QC), पुटिका रिलीज साइटों की संख्या (n), पुटिका रिहाई (पीरिलायंस एनर्जी), synaptic सुविधा और अवसाद की संभावना, साथ ही मांसपेशी झिल्ली समय लगातार (τ शामिल m) और इनपुट प्रतिरोध । मानव रोग के माउस मॉडल के लिए इस तकनीक के आवेदन रोग राज्यों में प्रमुख विकृतियों को उजागर कर सकते हैं और उपंयास उपचार रणनीतियों की पहचान में मदद । पूरी तरह से वोल्टेज-एक एकल synapse clamping द्वारा, इस विधि वर्तमान में उपलब्ध synaptic संचरण का सबसे विस्तृत विश्लेषण में से एक प्रदान करता है ।

Introduction

neuromuscular जंक्शन पर synaptic ट्रांसमिशन का अध्ययन तंत्रिका और कंकाल पेशी प्रणालियों के बीच गतिशील रिश्ते में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और synaptic फिजियोलॉजी की जांच के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । उंनमनी auris लंग्स (लाल) एक पतली मांसपेशी है, neuromuscular जंक्शनों के लिए अनुमति देता है आसानी से visualized । पिछले रिपोर्टों synaptic दवाओं और विषाक्त पदार्थों की जांच करने के लिए लाल का उपयोग करने की सुविधा का वर्णन किया है और लाल1,2के कंकाल मांसपेशी फाइबर प्रकार विशेषताओं की विशेषता है । कई अध्ययनों से लाल neuromuscular फिजियोलॉजी3,4,5,6,7,8की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया है । इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए, आसानी से लाल neuromuscular जंक्शनों का निरीक्षण करने की क्षमता मोटर endplate में microelectrodes के सटीक स्थान के लिए अनुमति देता है और बहुत synaptic संचरण रिकॉर्डिंग में अंतरिक्ष दबाना मुद्दों को कम कर देती है । मांसपेशी झिल्ली गुण की वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग, जैसे झिल्ली समय स्थिरांक (τm) और इनपुट प्रतिरोध (Rin) आसानी से प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा, इन संपत्तियों एक ही मांसपेशी neuromuscular संचरण रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया फाइबर से मापा जा सकता है, synaptic समारोह की मांसपेशी झिल्ली संपत्तियों के लिए एक सीधी तुलना के लिए अनुमति देता है । इन आंकड़ों का विश्लेषण कई neuromuscular रोगों और बदल गतिविधि के राज्यों के भौतिक तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।

तकनीक का एक महत्वपूर्ण पहलू यहां वर्णित वोल्टेज का उपयोग है-synaptic रिकॉर्डिंग के लिए दबाना, जो गैर के अधीन नहीं है रैखिकता वर्तमान दबाना में सामना करना पड़ा और मांसपेशियों की झिल्ली गुणों से स्वतंत्र हैं । वोल्टेज का उपयोग करने के लाभ के रूप में वर्तमान-दबाना neuromuscular संचरण की जांच के लिए विरोध दबाना 1950 के दशक में अग्रणी प्रयासों द्वारा स्थापित किया गया था9। के तहत वर्तमान दबाना, EPPs कि 10-15 से अधिक है एमवी आयाम में mEPP आयाम के एक रैखिक उत्पाद नहीं है9। उदाहरण के लिए, यदि औसत mEPP है 1 mv, 5 mv की एक EPP के उत्पाद के लिए माना जा सकता 5 mEPPs (QC of 5); जबकि, ४० एमवी का एक EPP ४० से अधिक mEPPs का उत्पाद होगा । इस गैर बड़ा EPPs में रैखिकता होता है क्योंकि EPP, जो acetylcholine रिसेप्टर (~-10 एमवी) के लिए झिल्ली की क्षमता और संतुलन क्षमता के बीच अंतर है के लिए ड्राइविंग बल, काफी बड़ी EPPs के दौरान कम हो जाती है । स्नायु झिल्ली क्षमता वोल्टेज दबाना प्रयोगों के दौरान परिवर्तन नहीं करता है, क्योंकि यह समस्या वोल्टेज दबाना प्रयोगों में बचा है । एक खामी यह है कि वोल्टेज दबाना प्रयोगों तकनीकी रूप से और अधिक मुश्किल वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग से पूरा करने के लिए कर रहे हैं । मन में इस के साथ, McLachlan और मार्टिन एक सीधा गणितीय सुधार है कि गैर के लिए खातों में वर्तमान में रैखिकता-EPPs10की रिकॉर्डिंग दबाना विकसित । सुधार अच्छी तरह से काम11,12,13, लेकिन महत्वपूर्ण बात यह है कि मांसपेशी झिल्ली गुण बाधित नहीं किया गया है मान ।

मांसपेशी झिल्ली गुण विशेष रूप से अगर स्थितियों या रोग राज्यों है कि मांसपेशियों को बाधित अध्ययन पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । उदाहरण के लिए, Huntington रोग के R6/2 ट्रांसजेनिक मॉडल से कंकाल की मांसपेशी आराम क्लोराइड और पोटेशियम धाराओं में एक प्रगतिशील कमी के कारण hyperexcitable है14,15. एक परिणाम के रूप में, mEPPs और EPPs R6/2 कंकाल की मांसपेशी में परिलक्षित कर रहे हैं । निश्चित रूप से, अतिरिक्त कारकों mEPPs और EPPs बदल सकते हैं । Huntington की बीमारी चूहों के एक अलग मॉडल के साथ काम (R6/EPPs में परिवर्तन पाया गया है कि जाल प्रोटीन से संबंधित लग रहा था8। बदल neuromuscular संचरण के कारण तंत्र का आकलन करने के लिए, यह एक वोल्टेज-दबाना का उपयोग करके बदल मांसपेशी झिल्ली संपत्तियों के प्रभाव को खत्म करने के लिए फायदेमंद होगा । हाल के एक अध्ययन में, R6/2 neuromuscular संचरण दोनों वर्तमान और वोल्टेज-क्लैंप शर्तों के तहत अध्ययन किया गया था यहां वर्णित तकनीक का उपयोग कर । मोटर endplates की पूरी तरह वोल्टेज थे-से कम 1% त्रुटि के साथ clamped endplate की लंबाई स्थिरांक के भीतर दो microelectrodes रखकर16। यह दिखाया गया है कि वोल्टेज-दबाना और सही वर्तमान दबाना रिकॉर्ड R6 में neuromuscular संचरण के विषम माप उपज/ यह प्रकाश डाला गया कि यह गैर के लिए EPPs सही करने के लिए मुश्किल हो सकता है रैखिकता अगर मांसपेशी झिल्ली गुण बदल दिया गया है और वोल्टेज दबाना रिकॉर्ड है कि मांसपेशियों की झिल्ली गुणों से स्वतंत्र हैं प्राप्त करने के लाभों से पता चलता है. यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल की स्थिति या रोग राज्यों है कि synaptic संचरण और postsynaptic झिल्ली संपत्तियों को प्रभावित की जांच के लिए आदर्श है ।

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Protocol

राइट स्टेट यूनिवर्सिटी की एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी के अनुसार सभी पशु प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया ।

1. माउस इच्छामृत्यु

  1. एक धुएं के हुड में, एक हवा बद गिलास anesthetizing चैंबर में माउस जगह है ।
  2. isoflurane की एक घातक खुराक के लिए साँस लेना के माध्यम से माउस बेनकाब (संतृप्त, या ~ 25%). चैंबर में माउस छोड़ जब तक कोई श्वास नहीं मनाया जा सकता है ।
  3. चैंबर से माउस निकालें और इच्छामृत्यु का एक द्वितीयक विधि के रूप में एक गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन करते हैं ।

2. सिर, गर्दन के पृष्ठीय सतह से बालों को हटाने, और वापस

  1. सिर, गर्दन, और माउस के पीछे की पृष्ठीय सतह पर बालों के बहुमत को दूर करने के लिए एक इलेक्ट्रिक शेविंग का प्रयोग करें । इसके अलावा, बालों को चारों ओर और बाएं कान पर निकालें ।
    नोट: ध्यान रखना जब कान के आसपास त्वचा शेविंग, त्वचा मुंडा के ब्लेड में पकड़ा जा सकता है और अंतर्निहित मांसपेशी ऊतक नुकसान हो सकता है ।
  2. बालों को हटाने के लिए एक कपास झाड़ू के साथ बाल निकालना क्रीम लागू करने के लिए बचे हुए बालों को हटाने के क्षेत्र । लगभग 1 मिनट रुको और एक निचोड़ धोने की बोतल का उपयोग कर पानी के साथ बालों को हटाने क्रीम कुल्ला, तो दूर किसी भी शेष क्रीम या बाल एक कपास झाड़ू का उपयोग कर ब्रश और त्वचा सूखी पॅट ।

3. त्वचा को हटाने के लिए उंनमनी Auris लंग्स मांसपेशी बेनकाब

  1. एक स्टीरियो विदारक खुर्दबीन के नीचे, एक छोटा सा चीरा (बस गहरी करने के लिए पर्याप्त त्वचा घुसना) scapulae के स्तर पर माउस की पीठ पर । माइक्रो विच्छेदन कैंची का उपयोग कर त्वचा में कटौती, चित्र 1aबीमें दिखाया पथ के बाद.
  2. (जैसे No .5 के रूप में) ठीक संदंश का उपयोग करना, scapulae के पास कटौती के साथ त्वचा खींचो । वसंत कैंची का प्रयोग, संयोजी ऊतक काट करने के लिए अंतर्निहित मांसपेशी ऊतक से त्वचा अलग जबकि कान आ । महत्वपूर्ण बात, ब्लेड के साथ संयोजी ऊतक में कटौती करने के लिए उजागर मांसपेशी ऊतक के आकस्मिक काटने से बचने के त्वचा में बताया ।
  3. आवधिक perfuse एक शारीरिक खारा समाधान के साथ उजागर मांसपेशी, जैसे निम्न Na+ बाहरी बफ़र (में मिमी): १४४ NaCl, 4 KCl, १.२ CaCl2, ०.६ MgCl2, 5 ग्लूकोज, 1 णः2पीओ4, पीएच ७.४ NaOH के साथ, और ३०० ± 5 mmol/किग्रा की एक परासरणीयता है । एक बार संयोजी ऊतक को बाईं कान तक काट दिया गया है, कान के आसपास की त्वचा को काटने के लिए पूरी तरह से माउस से त्वचा को हटाने और इसे त्यागें ।
    नोट: लाल कान के आधार को देते हैं और त्वचा को निकालते समय आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकते हैं । यह लाल काटने से बचने के लिए कान के आधार के आसपास त्वचा के 1 मिमी के आसपास छोड़ करने के लिए अच्छा है ।

4. उंनमनी Auris लंग्स मांसपेशी और आसपास के ऊतकों को हटाने

  1. वसंत कैंची का प्रयोग, मांसपेशियों कि लाल, जो scapulae के बीच रीढ़ की हड्डी के स्तंभ से कनेक्ट करने के लिए हीन हैं काटने से शुरू करते हैं । सही ब्लेड पर शुरू, बस midline के अधिकार के लिए, और माउस के rostral अंत की ओर कटौती, जबकि midline के दाईं ओर शेष । cranium पर मांसपेशियों के ऊतकों के अंत तक सभी तरह से काटना जारी रखें ।
    नोट: लाल कान और midline के औसत दर्जे का पक्ष से जुड़ा सबसे सतही मांसपेशी है, जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है । अतिरिक्त छवियों के लिए, ईसी ग्रीन द्वारा एक किताब17 उत्कृष्ट, हाथ से लाल की छवियों को तैयार दिखाता है ।
  2. संदंश का प्रयोग करें काट ऊतक तुरंत midline के अधिकार को हड़पने के लिए, तो धीरे से उठा और cranium के खिलाफ दबाया कैंची के ब्लेड के साथ बाएं कान की ओर ऊतक काटने शुरू करने के लिए मांसपेशियों की कई परतों है कि छोड़ दिया लाल को दूर कर रहे हैं । हटाने के दौरान गलती से लाल काटने से बचने के लिए अस्थाई रूप से संलग्न सभी परतों को छोड़ दें ।
  3. के समानांतर ब्लेड के साथ कट और cranium के खिलाफ दबाया तंत्रिका कि लाल है, जो कान नहर के आसपास wraps innervates काटने से बचने के लिए, और कान के औसत दर्जे का पक्ष पर मांसपेशियों में प्रवेश करती है । कान नहर के माध्यम से काटने जारी रखें, संभव के रूप में संलग्न तंत्रिका के रूप में ज्यादा रखते हुए ।
    नोट: तंत्रिका कि लाल शाखाओं चेहरे तंत्रिका के बंद की आपूर्ति और संरक्षित किया जाना चाहिए के रूप में यह प्रक्रिया में बाद में उपयोग किया जाएगा ।
  4. फैटी ऊतक है कि सिर्फ एक ही कान के ventrolateral हिस्से पर चित्र 1b में दिखाया रास्ते के साथ कान नहर पिछले कट । इसके अलावा, बाईं कंधे ब्लेड के साथ काट के रूप में सही पक्ष पर किया गया था करने के लिए पूरी तरह से माउस से पेशी हटा दें ।

५. उंनमनी Auris लंग्स स्नायु अलगाव

  1. लाल, और आसपास के ऊतकों को एक कंटेनर में रखें । एक कंटेनर जिसमें विच्छेदित ऊतक नीचे पिन किया जा सकता है का उपयोग करें, एक सिलिकॉन elastomer नीचे के साथ एक पेट्री डिश के रूप में । स्नान और अक्सर एक शारीरिक खारा समाधान में ऊतक धोने ।
  2. कान के आधार के साथ-साथ कान के pinna को काट कर, लाल से जुड़े कान के उपास्थि भाग को छोड़ना । बलवान को पलटें जिससे कि हीन पक्ष (डिश के नीचे की ओर लाल) पड़ जाए ।
  3. एक कीट पिन के रूप में एक पिन, जगह में प्रस्तुत करने के लिए कान नहर के माध्यम से, रखें । फिर छोटे पिन का उपयोग कर, शेष ऊतक लाल के midline के विपरीत ओर पिन. संदंश का प्रयोग, धीरे कान के पार्श्व भाग पर त्वचा खींचने के लिए मांसपेशियों को बाहर खिंचाव और त्वचा के माध्यम से एक छोटा सा पिन जगह है । इस चरण को दोहराएँ जब तक कि ऊतक डिश के लिए अच्छी तरह से सुरक्षित है, के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है ।
    नोट: छोटे विच्छेदन पिन वांछित लंबाई करने के लिए एक्यूपंक्चर सुइयों के सुझावों को काटने के द्वारा किया जा सकता है । इन छोटे पिंस ऊतक को नुकसान को कम करने और लंबे समय से काम कर दूरी के साथ जल विसर्जन माइक्रोस्कोप उद्देश्यों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. मांसपेशियों को हटाने शुरू ( चित्रा 4में दिखाया गया है), कि लाल कवर कर रहे हैं (auricularis सुपीरियर, अपहर्ताओं auris लंग्स, और interscutularis), और संयोजी ऊतक के माध्यम से लाल करने के लिए बाध्य और विशेष रूप से तंग कर रहे हैं के पास midline, No .5 संदंश और स्प्रिंग कैंची का उपयोग कर ।
  5. संदंश का उपयोग करने के लिए ऊपर की मांसपेशी परत पर खींचने के लिए, मांसपेशियों की परत की ओर उंमुख ब्लेड के साथ संयोजी ऊतक काट लिया जा रहा है और ध्यान काटने या लाल निक से बचने के लिए ले जा रहा है । midline की ओर कट और midline के रास्ते के बारे में तीन चौथाई काटने बंद करो । फिर, प्रत्येक मांसपेशी परत को दूर करने के लिए midline के समानांतर कटौती । केवल लाल रहता है जब तक मांसपेशियों की परतों को हटाने रखें ।
  6. लाल, जो इलेक्ट्रोड की पीली में एड्स को कवर है शेष संयोजी ऊतक से कुछ को हटा दें । धीरे लाल से संयोजी ऊतक खींचने के लिए और इसे काट वसंत कैंची का उपयोग कर दूर करने के लिए No .5 संदंश का उपयोग करें । केवल ऊतक है कि इतनी आसानी से प्रक्रिया में लाल नुकसान के जोखिम के बिना किया जा सकता है हटा दें । ऐसे किन्हीं बड़ी नसों को निकाल दें जो हीन मांसपेशी परतों को अंदर आना हुए लाल की हीन सतह पर शेष हों जो neuromuscular जंक्शनों के दृश्य को बाधा कर सकें.

6. तंत्रिका का अलगाव

  1. तंत्रिका उत्तेजित करता है कि लाल innervates (उदाहरण के लिए, एक पल्स जनरेटर से जुड़े दो प्लैटिनम तारों) का उपयोग कर की पहचान करें; कान के नहर से मांसपेशियों तक चलने वाली कई नसों होंगे । तंत्रिका उत्तेजित करने के साथ नसों टच कुछ वर्तमान की आपूर्ति (वर्तमान 5 वी के आसपास भिंन हो जाएगा) । जब मांसपेशियों के ठेके, सही तंत्रिका पहचान की गई है ।
  2. ध्यान से तंत्रिका के पास ऊतक हड़पने के लिए और वसंत कैंची का उपयोग करने के लिए कान के आसपास के ऊतकों से तंत्रिका अलग. नुकसान को कम करने के लिए, कुछ आसपास के ऊतकों, जो बाद में इस्तेमाल किया जाएगा में एंबेडेड तंत्रिका के सबसे रखने के लिए रिकॉर्डिंग पकवान को तंत्रिका सुरक्षित ।
    नोट: मोटर तंत्रिका कि लाल innervates कान नहर खोलने के औसत दर्जे की ओर स्थित है ।
  3. यदि एक द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड का उपयोग कर, आसपास के ऊतकों को दूर केवल तंत्रिका के एक क्षेत्र के आसपास, मांसपेशी से बाहर । एक चूषण इलेक्ट्रोड का उपयोग करते हैं, तो तंत्रिका के कट अंत में आसपास के ऊतकों को हटा दें ।
    नोट: यह एक अच्छा रोक बिंदु है । यह एक अच्छा रोक बिंदु है । यदि एक तोड़ जरूरत है विच्छेदित लाल तैयारी एक शारीरिक समाधान या घंटे के एक जोड़े के लिए निरंतर छिड़काव में बनाए रखा जा सकता है सुनिश्चित करने के लिए कि हानिकारक चयापचयों जमा नहीं है । हानिकारक चयापचयों जमा न हो यह सुनिश्चित करने के लिए समाधान या निरंतर छिड़काव की एक बड़ी मात्रा का उपयोग करें ।
  4. अगला, अनपिन करें और एक छिड़काव चैंबर में एक ईमानदार यौगिक माइक्रोस्कोप के तहत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के लिए पेशी हस्तांतरण.
    नोट: एक नरम नीचे जो ऊतक सुरक्षित रूप से पिन किया जा सकता है के साथ एक छिड़काव चैंबर का प्रयोग करें (चित्र 5) ।
  5. समाप्त होता है (कान और midline) और मांसपेशी के किनारे के साथ में पेशी पिन । मांसपेशी फाइबर के लिए सीधा तंत्रिका स्थिति और कुछ अतिरिक्त ऊतक कि तंत्रिका के अंत में बरकरार रह गया था के माध्यम से पकवान के नीचे करने के लिए पिन । ऊतक को हर समय एक शारीरिक खारा समाधान में नहाया रखें ।
    नोट: यह भी लाल मांसपेशी तंतुओं के तहत सीधे गोल, ऊंचा सामग्री के लिए उपयोगी है । यह अतिरिक्त समर्थन इलेक्ट्रोड में एड्स और सिलिकॉन elastomer के एक छोटे से अनुभाग से बनाया जा सकता है एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में अपनी तरफ झूठ बोल रही है । elastomer के गोल अनुभाग ताजा सिलिकॉन की एक छोटी राशि का उपयोग कर छिड़काव चैंबर के नीचे करने के लिए सुरक्षित किया जा सकता है । छिड़काव कक्ष का एक आरेख चित्रा 5B-सीमें दिखाया गया है । मांसपेशी फाइबर नव कास्ट सिलिकॉन elastomer करने के लिए बहुत कसकर पालन कर सकते हैं (जो बहुत hydrophobic है) और क्षतिग्रस्त हो सकता है. यह कोट या प्रोटीन, एक immunoblot में अवरुद्ध कदम के समान के साथ नव कास्ट सिलिकॉन ब्लॉक करने के लिए उपयोगी है । इसे ब्लॉक करने के लिए, हम रात भर गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के एक केंद्रित समाधान में नव कास्ट सिलिकॉन की मशीन है ।

7. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरण सेटअप

  1. तैयार या गल एक डाई की aliquots neuromuscular जंक्शन visualizing में सहायता करने के लिए, जैसे mitochondrial डाई 4-(4-diethylaminostyryl) -1-methylpyridinium18, जो प्रकाश संवेदनशील है और प्रकाश से दूर संग्रहित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, गल इलेक्ट्रोड समाधान । भंवर सभी aliquots सुनिश्चित करने के लिए कि सभी solutes समाधान में हैं । 1 µ m µ-Conotoxin GIIIB (µ-CTX) और ८० µ m बीटीएस (ऐच्छिक) युक्त एक शारीरिक खारा समाधान तैयार करें ।
  2. लाल के साथ छिड़काव चैंबर को माइक्रोस्कोप की अवस्था में सुरक्षित करें । एक 3 मीटर KCl, जो एक आगर पुल के माध्यम से रिकॉर्डिंग चैंबर से जुड़ा है से भरे कप में संदर्भ इलेक्ट्रोड प्लेस । संदर्भ इलेक्ट्रोड के प्रति निर्माता निर्देश एम्पलीफायर से कनेक्ट करें ।
  3. इस बिंदु पर, तंत्रिका पर तंत्रिका उत्तेजक इलेक्ट्रोड स्थिति । या तो एक चूषण इलेक्ट्रोड या एक छोटे से द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड का उपयोग करें, के रूप में वे तंत्रिका उत्तेजना के लिए अच्छी तरह से काम.
    1. रिकॉर्डिंग में उत्तेजना कलाकृतियों की संख्या को कम करने के लिए संभव के रूप में मांसपेशी से दूर के रूप में उत्तेजक इलेक्ट्रोड की स्थिति.
      नोट: उत्तेजक इलेक्ट्रोड एक उत्तेजना अलगाव इकाई है कि वोल्टेज आयाम के रूप में आवश्यक नियंत्रण कर सकते हैं के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए.
  4. धीरे वोल्टेज उत्तेजना अलगाव इकाई पर वोल्टेज घुंडी मोड़ जब तक संकुचन मनाया जाता है द्वारा बढ़ा । जिस बिंदु पर पहली बार यह संकुचन मनाया गया था वह दहलीज है । एक बार सीमा की पहचान की गई है, वोल्टेज उत्तेजना अलगाव इकाई पर 1.5 * दहलीज पर सेट (या के रूप में प्रयोग द्वारा परिभाषित) ।
    नोट: चित्रा 6 एक ईमानदार खुर्दबीन और छोटे द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड एक गेंद-संयुक्त जोड़तोड़ का उपयोग कर तंत्रिका पर तैनात के तहत स्थापित मांसपेशियों को प्रस्तुत करने की तैयारी से पता चलता है । यह संभव उत्तेजना के लिए सबसे कम वोल्टेज के लिए अनुकूल है, जबकि अभी भी पर्याप्त सीमा से ऊपर जा रहा है । एक कम उत्तेजना वोल्टेज रिकॉर्डिंग के दौरान उत्तेजना कलाकृतियों की संख्या कम कर देता है । इसके अलावा, उत्तेजक इलेक्ट्रोड मांसपेशी से दूर रखने उत्तेजना विरूपण साक्ष्य के आकार में कमी होगी. कई बार तंत्रिका के अंत में विच्छेदन से क्षतिग्रस्त हो जाएगा, तो यह साथ प्रयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है, जहां तंत्रिका उत्तेजक साथ रखा जाना चाहिए ।
  5. स्नान खारा समाधान निकालें और 5 µ m 4-Di-2-Asp के साथ प्रतिस्थापित करें । neuromuscular जंक्शन दृश्य (चित्रा 7) के लिए पर्याप्त प्रतिदीप्ति को प्राप्त करने के लिए 10 मिनट के लिए 4-Di-2-Asp करने के लिए लाल प्रस्तुत करने का पर्दाफाश.
  6. दो इलेक्ट्रोड समाधान तैयार करें, 3 मीटर KCl और एक K+ आंतरिक समाधान से मिलकर (मिमी में) ७५ aspartate, 5 MgCl2, 15 सीए (OH)2, 5 एटीपी disodium, 5 phosphocreatine disodium, 5 glutathione, 20 MOPS, 30 EGTA, पीएच ७.२ KOH के साथ ।
    नोट: समाधान पहले से तैयार किया जाना चाहिए; K+ आंतरिक समाधान aliquots में-20 ° c में संग्रहित किया जा सकता है ।
  7. 3 एम KCl के साथ वोल्टेज सेंसिंग इलेक्ट्रोड के लिए खींचा कांच केशिका भरें. वर्तमान पासिंग इलेक्ट्रोड के लिए K+ आंतरिक समाधान (चरण ७.६ में तैयार) का उपयोग करें; एक संकीर्ण धातु सुई (~ ३४ गेज) एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी आसानी से कांच केशिकाओं को भरने के लिए उपयोग करें । धीरे हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए केशिकाओं नल; प्रत्येक भरा इलेक्ट्रोड 10-15 MΩ का एक प्रतिरोध है कि सुनिश्चित करें.
    नोट: जाँच करें और डेटा प्राप्ति सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर दोनों इलेक्ट्रोड के प्रतिरोध को ध्यान दें ।
  8. 10 मिनट के बाद, 4-Di-Asp समाधान सामांय Ca2 + समाधान के साथ exchange ।

8. प्रतिदीप्ति का उपयोग कर Neuromuscular जंक्शन की पहचान

  1. मानक उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति रोशनी के साथ एक ईमानदार खुर्दबीन का प्रयोग, फ्लोरोसेंट हरी neuromuscular की तैयारी के साथ मांसपेशी फाइबर के लिए सीधा चल रहे जंक्शनों के एक उज्ज्वल बैंड के लिए देखो के रूप में चित्रा 7Aमें दिखाया गया है । neuromuscular जंक्शनों की पहचान करने के लिए कम आवर्धन जल-विसर्जन उद्देश्य (~ 10x) का उपयोग करें
    नोट: माइक्रोस्कोप एक FITC घन के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए (उदा: 480/40, Dichroic: 505LP, Em: 535/50), और एक एलईडी, लेजर, हैलोजन दीपक, या पारा दीपक प्रतिदीप्ति के लिए. फोटो ब्लीचिंग को कम करने के लिए, उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति रोशनी के बीच वैकल्पिक ।
    नोट: इस बैंड आमतौर पर अधिक midline से कान के आधार के लिए समीपस्थ है । बैंड neuromuscular जंक्शनों सबसे केंद्रित कर रहे हैं, जहां क्षेत्र है ।
  2. स्विच करने के लिए एक उच्च आवर्धन जल-विसर्जन उद्देश्य (~ 40X) और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ की जांच करने के लिए मांसपेशी के शीर्ष परत पर एक neuromuscular जंक्शन की पहचान (चित्रा 7B) ।
  3. प्रति निर्माता के निर्देशों के अनुसार उपयुक्त headstages पर पिपेट धारकों में भरे पिपेट को सुरक्षित करें । neuromuscular जंक्शन (चित्रा 7C) की पहचान की १०० µm के भीतर स्नायु झिल्ली के ऊपर इलेक्ट्रोड की स्थिति के लिए micromanipulators का उपयोग करें । स्थिति इलेक्ट्रोड मुख्य रूप से उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग; neuromuscular जंक्शन के सापेक्ष इलेक्ट्रोड के स्थान की पुष्टि करने के लिए प्रतिदीप्ति का उपयोग करें.
  4. पहले, इलेक्ट्रोड का पता लगाने के लिए एक कम आवर्धन (~ 10x) उद्देश्य का उपयोग करें और फिर इलेक्ट्रोड की अंतिम स्थिति के लिए एक उच्च आवर्धन (~ 40X) उद्देश्य के लिए स्विच । इस बिंदु पर मांसपेशी में इलेक्ट्रोड को नहीं पीला, पहले इलेक्ट्रोड ट्यून.

9. ट्यूनिंग और इलेक्ट्रोड Impaling

  1. एक बार इलेक्ट्रोड वांछित फाइबर के ऊपर तैनात कर रहे हैं, शून्य और ट्यून वोल्टेज सेंसिंग इलेक्ट्रोड द्वारा पुल संतुलन (या एक अनुरूप दृष्टिकोण) और निर्माता के निर्देशों के अनुसार इलेक्ट्रोड समाई बेअसर. इसके अलावा, वर्तमान गुजर इलेक्ट्रोड शून्य.
  2. दोनों इलेक्ट्रोड फाइबर की सतह के लिए नीचे लाने के लिए । neuromuscular जंक्शन, चरणों में वर्णित के रूप में ८.३ और ८.४ के लिए संबंध के साथ उंमुख रहना ताकि इलेक्ट्रोड के लिए नीचे के रास्ते पर इलेक्ट्रोड की स्थिति को धीरे से समायोजित करें ।
  3. दोनों इलेक्ट्रोड मांसपेशी फाइबर की सतह से संपर्क किया है के बाद, कुंद वर्तमान गुजर इलेक्ट्रोड पहले मद्धिम. इस तरह के बज़ के रूप में तकनीक का उपयोग करें (अतिरिक्त समाई क्षतिपूर्ति की संक्षिप्त दालों), संक्षिप्त वर्तमान दालों, या धीरे तालिका दोहन इलेक्ट्रोड के लिए मदद करने के लिए ।
    1. संकेत मॉनिटर, डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में एक आस्टसीलस्कप या आस्टसीलस्कप प्रोटोकॉल का उपयोग कर, जब तक एक नकारात्मक झिल्ली की क्षमता की पहचान की है, जो इंगित करता है कि इलेक्ट्रोड है ।
  4. दबाना तीव्र वोल्टेज-संवेदन इलेक्ट्रोड के स्तर को मांसपेशी पर पीला वर्तमान गुजर इलेक्ट्रोड के लिए. एक बार दोनों इलेक्ट्रोड एक दूसरे के साथ लाइन में हैं, एक ही वर्तमान-पासिंग इलेक्ट्रोड के साथ लागू तकनीक का उपयोग वोल्टेज सेंसिंग इलेक्ट्रोड.
  5. सफल न होने पर, एम्पलीफायर के लिए नियंत्रक का उपयोग कर, एक निरंतर नकारात्मक वर्तमान गुजर इलेक्ट्रोड के साथ वर्तमान पकड़े इलेक्ट्रोड के कारण किसी भी झिल्ली क्षति के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए लागू. के रूप में सेल धीरे-८० एमवी की ओर चार्ज करने के लिए शुरू होता है, होल्डिंग वर्तमान वृद्धि के रूप में वांछित आराम करने के लिए सेल लाने की जरूरत है (यानी,-८०-८५ एमवी) ।
    नोट: अस्वास्थ्यकर फाइबर से रिकॉर्डिंग की संभावना को कम करने के लिए जंगली प्रकार की मांसपेशी में-25 ना से निरपेक्ष मूल्य में एक होल्डिंग वर्तमान बड़ा की आवश्यकता है कि फाइबर से रिकॉर्डिंग से बचें.
  6. फाइबर वांछित आराम क्षमता पर कुछ मिनट के लिए स्थिर है एक बार, मांसपेशी झिल्ली गुण या neuromuscular संचरण रिकॉर्डिंग के लिए आगे बढ़ें ।

10. रिकॉर्डिंग Postsynaptic झिल्ली गुण और Synaptic संचरण

  1. इसी झिल्ली वोल्टेज प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए सकारात्मक और नकारात्मक वर्तमान चरणों की एक समान संख्या लागू करने के द्वारा वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग के साथ शुरू करें, जो मोटर endplate आरमें और τएमका निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । निष्क्रिय संपत्तियों को सुनिश्चित करने के लिए, एक स्थिर स्थिति तक पहुंचने और एक रैखिक वोल्टेज वर्तमान संबंध16,19,20है कि छोटे वोल्टेज प्रतिक्रियाओं का उपयोग करें । एक क्षतिग्रस्त या अस्वस्थ तंत्रिका के साथ फाइबर से रिकॉर्डिंग से बचें, इस तरह के तंतुओं > 3 हर्ट्ज के एक mEPP आवृत्ति है ।
  2. इसके बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार दो-इलेक्ट्रोड वोल्टेज-दबाना दर्ज करें । -८५ एमवी की एक झिल्ली क्षमता पर वोल्टेज दबाना फाइबर । वोल्टेज दबाना सेटिंग्स संकेत करने वाली शोर अनुपात है कि mEPCs का पता लगाने की अनुमति प्राप्त करना चाहिए ।
    नोट: पर्याप्त वोल्टेज नियंत्रण बनाए रखने के एक मुद्दा हो सकता है । हम इन समस्याओं को कम करने के लिए दो विधियों का उपयोग करें । सबसे पहले, तंतुओं मोटर endplate के १०० µm के भीतर दब रहे है के रूप में पहले वर्णित है, जो इन तंतुओं की लंबाई लगातार के भीतर है21। दूसरा, हम एम्पलीफायर के डीसी बहाल सुविधा का उपयोग करें. यह सुविधा एक बहुत ही उच्च वोल्टेज-क्लैंप लाभ सेट करता है । हमारे पिछले काम विस्तार में इस विधि का वर्णन किया है और वोल्टेज का आकलन करने के लिए एक विधि रेखांकित-endplate16clamped ।
  3. एक बार वोल्टेज में दबाना, रिकॉर्ड synaptic धाराओं (mEPCs और eEPCs) प्रयोग की आवश्यकताओं के आधार पर विभिंन तंत्रिका उत्तेजना प्रोटोकॉल, का उपयोग कर ।
    1. रिकॉर्ड सहज mEPCs और ईपीसी एक कम आवृत्ति तंत्रिका उत्तेजना प्रोटोकॉल का उपयोग (≤ ०.५ हर्ट्ज) जो synaptic मॉडुलन के बिना ईपीसी रिकॉर्ड करने के लिए एक सक्षम बनाता है (सुविधा या मॉडुलन) quantal सामग्री का आकलन करने के लिए. synaptic सुविधा या अवसाद का आकलन करने के लिए, एक उच्च आवृत्ति तंत्रिका उत्तेजना प्रोटोकॉल का उपयोग करें (५० हर्ट्ज पर 10 दालें).
    2. एक प्रेरणा अलगाव इकाई है, जो एक पल्स जनरेटर है कि डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग नियंत्रित है का उपयोग कर ट्रिगर किया जा सकता है के माध्यम से वांछित आवृत्ति पर तंत्रिका उत्तेजित ।
  4. एक बार वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग किया जाता है, एक वर्तमान दबाना सेटिंग करने के लिए एम्पलीफायर वापस, सभी धाराओं को बंद करने और फाइबर से इलेक्ट्रोड को दूर. इलेक्ट्रोड भरा हुआ नहीं हो या रिकॉर्डिंग के दौरान आधारभूत वोल्टेज में बहाव की जाँच करें ।
    नोट: बहाव के बारे में, इलेक्ट्रोड वोल्टेज होना चाहिए 0 extracellular समाधान में वोल्ट, के रूप में वे फाइबर से पहले सेट किए गए थे. उदाहरण के लिए, दर्ज वोल्टेज अनिश्चित होगा यदि प्रयोग के दौरान वोल्टेज बहाव ।

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Representative Results

चित्रा 8 वर्तमान दालों का एक उदाहरण से पता चलता है (चित्रा 8A) और वोल्टेज प्रतिक्रियाओं (चित्रा 8B) एक लाल फाइबर से वर्तमान के तहत-क्लैंप एक 12 सप्ताह पुराने जंगली प्रकार R6/ mEPPs की मौजूदगी बताती है कि ये रिकॉर्ड मोटर endplate से लिया गया था । रिकॉर्ड सामांय शारीरिक खारा समाधान में प्राप्त किया गया । इन वर्तमान क्लैंप रिकॉर्ड Rमें और τ कि फाइबर16,19,20केएम निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है ।

एक ईपीसी और दो mEPCs, वोल्टेज दबाना शर्तों के तहत प्राप्त की एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग, चित्रा 9Aमें दिखाया गया है । ईपीसी पूर्ववर्ती संक्षिप्त वर्तमान विक्षेपन तंत्रिका उत्तेजना की वजह से विरूपण साक्ष्य है । mEPCs और ईपीसी के विश्लेषण घटना का पता लगाने सॉफ्टवेयर के साथ जल्दी किया जा सकता है । इस उपकरण के शोधकर्ता एक टेंपलेट है कि फिर स्वचालित रूप से रिकॉर्डिंग के भीतर की घटनाओं का पता लगा सकते है बनाने के लिए अनुमति देता है । घटनाओं आरोपित और किसी भी डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में निर्यात किया जा सकता है । चित्रा 9B एक प्रतिनिधि फाइबर से आरोपित ईपीसी और mEPCs (इनसेट) से पता चलता है.

Figure 1
चित्र 1 : के सामान्य स्थान उंनमनी auris लंग्स स्नायु
लाल मांसपेशी सिर के पृष्ठीय सतह पर स्थित है । लाल बिंदीदार रेखा पृष्ठीय (एक) और पार्श्व (ख) सतह पर हटाने के लिए त्वचा को काटने के लिए पथ पर प्रकाश डाला गया । लाल कान के आधार के लिए देते हैं, इस प्रकार कान के आधार के आसपास त्वचा के लगभग 1 मिमी लाल काटने से बचने के लिए बरकरार रहना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : उजागर उंनमनी auris लंग्स स्नायु
लाल (पीला और हरा) सिर्फ त्वचा के नीचे स्थित है और प्रकाश डाला क्षेत्र में सबसे सतही मांसपेशी है । मांसपेशी के दो भाग होते हैं, कपाल (yellow) और caudal (हरा) क्षेत्र. कपाल क्षेत्र पहले चार ग्रीवा कशेरुकाओं पर midline से उभर रहा है और auricle के आधार के पूर्वकाल भाग की ओर चलाता है । संदर्भ के लिए, midline संयोजी ऊतक कि नाक की ओर scapulae (सफेद तीर) से चलाता है की एक बैंड है । दाईं और बाईं लाल मांसपेशी cranium के ऊपर midline पर कनेक्ट करें । लाल के कपाल भाग caudal भाग की तुलना में अधिक व्यापक है । caudal भाग चौथे और पांचवें ग्रीवा कशेरुकाओं पर midline के पास देता है और auricle के आधार के पीछे भाग को जोड़ता है । विच्छेदन के दौरान, लाल काटने को रोकने के लिए उपास्थि कान के आसपास एक दो मिलीमीटर त्वचा रखें, जो एक कोष्ठक के रूप में धराशायी लाइन द्वारा चित्रा में चिह्नित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : क्रूड का विच्छेद न उंनमनी auris लंग्स और आसपास की मांसपेशी
एक बार जानवर से हटा दिया, ऊतक पर टिकी है, नीचे पृष्ठीय पक्ष नीचे (लाल नीचे), एक सिलिकॉन elastomer लाइन में ठीक पिन का उपयोग कर के रूप में ५.३ धारा में वर्णित पकवान । एक बार पकवान के नीचे करने के लिए सुरक्षित, झूठ बोल मांसपेशी परतों को हटाया जा सकता है । कान नहर के माध्यम से एक कीट पिन एक सफेद धराशायी तीर के साथ संकेत दिया है । पीले तीर अवांछित मांसपेशियों को हटाने के लिए आदर्श पिन प्लेसमेंट दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : मांसपेशी परत सीधे अवर उंनमनी auris लंग्स
नीले रंग में प्रकाश डाला अपहरण auris लंग्स (AAL) है, लाल रंग में है auricularis scupularis (के रूप में), और पीले रंग में interscutularis है (है) । लाल इस छवि में मुख्य, अंतर्निहित मांसपेशी है । संदर्भ के लिए, कान और आसपास की त्वचा एक ठोस काली रेखा द्वारा उल्लिखित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : सिलिकॉन elastomer-लाइन, कस्टम छिड़काव चैंबर
दिखाया गया है कस्टम ३५ mm छिड़काव डिश electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए लाल सुरक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया (A)। सिलिकॉन elastomer ऊतक pining के लिए उपयुक्त सतह बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । चैंबर के केंद्र में एक गोल मंच है कि उपयोगी है जब फाइबर impaling है । मंच के नीचे से मांसपेशी फाइबर का समर्थन करता है जब दबाव की प्रक्रिया के दौरान इलेक्ट्रोड के साथ एक नीचे बल लागू । इस मंच सिलिकॉन elastomer एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब की वक्र करने के लिए फार्म की अनुमति देने के द्वारा आकार का था । इस गोल सिलिकॉन elastomer का एक टुकड़ा तो और अधिक सिलिकॉन elastomer के साथ चैंबर के नीचे से चिपके जा सकते हैं । डिश के एक रेखांकित प्रतिनिधित्व के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक पक्ष को देखने पर बी और सी में दिखाया गया है जहां छिड़काव चैंबर और अधिक स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोग सेट अप
एक छोटे से द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड एक चुंबकीय गेंद के साथ जगह में आयोजित किया जाता है-संयुक्त जोड़तोड़ लाल की तंत्रिका को उत्तेजित करने के लिए । माइक्रोस्कोप चरण आसानी से एक चिपकने वाला चुंबकीय सामग्री के उपयोग के साथ एक चुंबकीय मंच पकड़ करने के लिए बनाया जा सकता है (के रूप में फ्रिज मैग्नेट बनाने के लिए एक शिल्प या हार्डवेयर की दुकान पर पाया जा सकता है) । यह भी दिखाया headstages और इलेक्ट्रोड एक लाल नमूना ऊपर तैनात हैं । एक महत्वपूर्ण साधन जल-विसर्जन, एक सिरेमिक सूई शंकु के साथ बेवल उद्देश्य, के रूप में दिखाया गया है । बेवल्ड अंत आसान इलेक्ट्रोड स्थान के लिए अनुमति देता है और चीनी मिट्टी सामग्री बिजली के शोर को कम करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : Neuromuscular जंक्शन की पहचान
सभी छवियों neuromuscular जंक्शनों के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए लाल दाग 5 µ एम 4-Di-2-एएसपी (हरा) के साथ दिखा । (क) neuromuscular जंक्शनों के एक चमकदार बैंड (पीले तीर) देखा जा सकता है जब एक 10x उद्देश्य के माध्यम से मांसपेशियों को देखने । बंटी axons भी सफेद धराशायी तीर से संकेत के रूप में देखा जा सकता है । (B) तीन neuromuscular जंक्शनों (पीले तीरों) के छोटे फोकल स्टैक्स (5 x 1 µm) । स्वस्थ मांसपेशी फाइबर स्पष्ट striations के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई myonuclei कि फाइबर (सफेद तीर) के sarcolemma साथ काले धब्बे के रूप में दिखाई देते हैं । अक्सर neuromuscular जंक्शनों innervating axons के रूप में अच्छी तरह से मनाया जा सकता है । (ग) एक फाइबर के साथ एक दाग neuromuscular जंक्शन है कि कांच इलेक्ट्रोड के साथ पीला है । इलेक्ट्रोड एक सफेद प्रकाश के साथ बढ़ाया गया है ताकि वे और अधिक आसानी से देखा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : झिल्ली गुण की वर्तमान-दबाना रिकॉर्डिंग
इंजेक्शन वर्तमान दालों (ए) और जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली संभावित प्रतिक्रियाओं (ख) शारीरिक खारा समाधान में नहाया लाल के एक फाइबर से दर्ज की गई. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9 : दो-इलेक्ट्रोड वोल्टेज-दबाना रिकॉर्डिंग
दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज-क्लैंप (A) में दर्ज एक ईपीसी और दो mEPCs का एक कच्चा निशान । आरोपित ईपीसी और mEPCs (इनसेट) से एक भी फाइबर (B) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां वर्णित है तैयारी और वर्तमान या वोल्टेज-दबाना शर्तों के तहत neuromuscular संचरण की माप के लिए माउस लाल मांसपेशी का उपयोग करें । लाल को बाहर निकालने के लिए विचार करने के लिए कई महत्वपूर्ण बिंदु हैं । इलेक्ट्रोड में मांसपेशी एड्स से अतिरिक्त संयोजी ऊतक सफाई, के रूप में इलेक्ट्रोड संयोजी ऊतक रोड़ा कर सकते हैं जब उन्हें के लिए स्थिति । हालांकि, केवल संयोजी ऊतक दूर ले जाया जा सकता है कि आसानी से मांसपेशियों को नुकसान की संभावना को सीमित करने के लिए निकालें । तंत्रिका के अलगाव की देखभाल के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए, क्योंकि यह बहुत नाजुक है । तंत्रिका क्षति से बचने के लिए, यह चारों ओर तंत्रिका के अंत से जुड़ी ऊतक के कुछ छोड़ने के लिए उपयोगी है जिसके माध्यम से एक पिन पकवान को तंत्रिका सुरक्षित रखा जा सकता है । इसके अलावा, जब तंत्रिका उत्तेजक स्थिति तंत्रिका को कुचलने के लिए ध्यान रखना नहीं । अंत में, जो क्रम में इलेक्ट्रोड फाइबर में दब रहे हैं महत्वपूर्ण है. कुंद इलेक्ट्रोड के रूप में करना आसान नहीं है और पहले से पीला हो जाना चाहिए । यदि तीव्र इलेक्ट्रोड पहले, कुंद इलेक्ट्रोड मांसपेशी फाइबर नीचे धक्का सकता है पहले यह झिल्ली भेदी, संभवतः तेज इलेक्ट्रोड फाइबर से बाहर आने के लिए पैदा कर सकते हैं । यह फाइबर तेज इलेक्ट्रोड जो अनावश्यक झिल्ली नुकसान का कारण होगा के साथ एक दूसरी बार पीला करने के लिए आवश्यक बनाना होगा । यह भी उपयोगी है कि एम्पलीफायर इस्तेमाल किया जा रहा एक साथ वर्तमान और वोल्टेज की मौजूदा गुजर इलेक्ट्रोड को मापने कर सकते हैं ताकि झिल्ली क्षमता में एक नकारात्मक झुकाव देखा जा सकता है, यह दर्शाता है कि इलेक्ट्रोड है ।

लाल जो कि फायदेमंद हो सकता है की एक विशेषता यह है कि दोनों मांसपेशियों को एक साथ निकालने की क्षमता है । यह एक ही जानवर में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और आणविक जीवविज्ञान प्रयोगों प्रदर्शन के लिए महान हो सकता है । यह मूलतः एक ही प्रोटोकॉल का पालन करके पूरा किया जा सकता है यहां मामूली परिवर्तन के साथ वर्णित है । शीर्षकों के तहत सभी चरणों का पालन करें 1-3 सही पक्ष के रूप में अच्छी तरह के रूप में बाईं ओर वर्णित सब कुछ कर रही । 4 कदम पर, यह सही कान की मांसपेशियों को हटाने के लिए ventrolateral पक्ष में काटने शुरू करने के लिए सबसे अच्छा है । जैसा कि पहले वर्णित है, हमेशा खोपड़ी के खिलाफ दबाया ब्लेड लाल से जुड़ी अवर मांसपेशियों छोड़ने के रूप में गहरी कटौती करने के लिए रखें । midline पिछले सही कान की ओर कटौती करने के लिए जारी रखें, ब्लेड के रूप में संभव के रूप में गहरी रखते हुए । इस बिंदु पर, प्रक्रिया के बाकी के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, केवल दोनों मांसपेशियों पर शेष कदम प्रदर्शन । एक बार जब मांसपेशियों को साफ किया गया है, एक लाल दूर काटा जा सकता है और बाद में आणविक विश्लेषण के लिए जमे हुए और दूसरे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह एक ही जानवर के दोनों मांसपेशियों के साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल होगा । ऐसा करने के लिए, midline मांसपेशियों को अलग करने के लिए कटौती की जानी चाहिए और ऐसा करने की संभावना कुछ मांसपेशी फाइबर नुकसान होगा ।

लाल लंबे समय neuromuscular संचरण की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है क्योंकि इसकी पतली प्रकृति मोटर endplates की आसान पहचान के लिए अनुमति देता है और उत्कृष्ट पूर्व vivo छिड़काव1,3,4,5 ,6,7,8. 4-डि-2-asp के उपयोग के अलावा, अंय समूहों ने कम सांद्रता22पर rhodamin-संयुग्मित bungarotoxin का उपयोग किया है । हमने electrophysiological परीक्षाओं, purinergic सिगनलिंग, और Huntington के रोग16,20में दोषों के लिए लाल का प्रयोग किया है । लाल जी सेल इमेजिंग अध्ययन के लिए भी आदर्श है । उदाहरण के लिए, कई अध्ययनों से लाल synaptic पुटिका रिलीज और23,24को मापने के लिए इस्तेमाल किया है । यह ऐसे एफएम 1-43 के रूप में रंगों का उपयोग किया जा सकता है ।

क्योंकि endplates आसानी से एक फ्लोरोसेंट दाग के साथ मनाया जा सकता है, इलेक्ट्रोड मांसपेशियों फाइबर की लंबाई लगातार के भीतर मोटर endplate के करीब निकटता में रखा जा सकता है. endplate पर इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट और एक उच्च अनुपालन दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज-दबाना प्रणाली के उपयोग जांचकर्ताओं को पूरी तरह से कम 1% त्रुटि के साथ endplate क्षमता को नियंत्रित करने के लिए सक्षम बनाता है16. यह महत्वपूर्ण हो सकता है क्योंकि वर्तमान-क्लैंप शर्तों के तहत रिकॉर्ड किए गए synaptic क्षमता के गैर-रेखीय योग के लिए सामान्य रूप से उपयोग किए गए सुधार10 postsynaptic झिल्ली में परिवर्तन के लिए खाता नहीं है और प्रयोगात्मक स्थितियों के कारण/ रोग अवस्था । उदाहरण के लिए, कम आराम endplate conductances postsynaptic क्षमता19बढ़ाना होगा, यहां तक कि उन गैर रेखीय योग के लिए सही है । इसके विपरीत, वोल्टेज-clamped postsynaptic धाराओं गैर रेखीय योग त्रुटियों के अधीन नहीं है और postsynaptic झिल्ली गुणों से स्वतंत्र हैं । इस प्रदर्शन, हम हाल ही में अति उत्तेजित है Huntington रोग कंकाल की मांसपेशी16से दर्ज की धाराओं की तुलना में endplate क्षमता से विषम परिणाम दिखाया है ।

neuromuscular ट्रांसमिशन का अध्ययन करने के लिए लाल का उपयोग करने का एक अंतिम कुंजी लाभ यह है कि रिकॉर्डिंग एक एकल synapse से हैं । Neuromuscular संचरण से दर्ज एक एकल, पूरी तरह से वोल्टेज clamped endplate synaptic संचरण वर्तमान में उपलब्ध है, जो मॉडलिंग और synaptic की जटिलता को जानने के लिए आदर्श है पर सबसे विस्तृत और सटीक डेटा के कुछ प्रदान करता है फिजियोलॉजी.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम संपादकीय टिप्पणी के लिए डॉ मार्क एम रिच और डैनियल मिरांडा धंयवाद, इस तकनीक की स्थापना में मदद करने के लिए अहमद Khedraki, और राइट राज्य विश्वविद्यालय वित्तीय सहायता के लिए (A.A.V. के लिए स्टार्टअप कोष) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus Compound Microscope Olympus BX51WI
10x Objective Olympus UMPLFLN10XW
40x Objective Olympus LUMPLFLN40XW
Borosilicate Glass Sutter Instruments BF150-86-7.5
CCD Camera Santa Barbara Instruments Group ST-7XMEI
Mater-9 Pulse Generator AMPI
Iso-flex Stimulus Isolator AMPI
pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software Molecular Devices 1-2500-0180
Concentric Bipolar Electrode FHC CBDSH75
Ball-joint Manipulator Narishige 
Non-metalic Syringes 34 Gauge World Precision Instruments MF34G-5
Nikon Stereomicroscope Nikon SMZ800N
No. 5 Forceps Fine Science Tools
Spring Scissors Fine Science Tools 15006-09
No. 2 Forceps Roboz RS-5Q41
Microdissecting Scissors Roboz RS-5912SC
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 2404019862
Hair Removal Cream Nair
Grass SD9 Stimulator Grass Medical
Model P-1000 Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000
Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System Molecular Devices
Low Pass Bessell Filter Warner Instrument Corp. LPF-8
Left-handed Micromanipulator Siskiyou Corp. MX1641/45DL
Right-handed Micromanipulator Siskiyou Corp. MX1641/45DR
Single Motion Controler Siskiyou Corp. MC100e
Crossed Roller Micromanipulator Siskiyou Corp. MX1641R This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller
All chemicals were orded from Fisher except,
BTS Toronto Research Chemicals B315190
CTX Alomone Labs C-270
4-Di-2-Asp Molecular Probes Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३५ Neuromuscular जंक्शन Synaptic ट्रांसमिशन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी वोल्टेज दबाना Endplate चालू Endplate संभाव्यता उत्तेजक Postsynaptic चालू उत्तेजक Postsynaptic क्षमता
<em>उंनमनी Auris लंग्स</em> वोल्टेज क्लैंप शर्तों के तहत स्तनधारी Neuromuscular ट्रांसमिशन की परीक्षा के लिए तैयारी
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Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions. J. Vis. Exp. (135), e57482, doi:10.3791/57482 (2018).

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