Uso di elettroforesi del Gel di agarosio detergente semi-denaturante dimensionale due per confermare dimensioni eterogeneità delle fibre amiloidi o amiloide-come
26 aprile 2018
Qui usiamo l'elettroforesi del gel dell'agarosi semi-denaturante bidimensionale per confermare la presenza di amiloide-come le fibre di dimensioni eterogenee ed escludere la possibilità che l'eterogeneità di dimensioni è dovuto dissociazione delle fibre amiloidi durante il gel processo in esecuzione.
L'obiettivo generale di questa elettroforesi su gel di agarosio detergente semi-denaturante bidimensionale è confermare l'eterogeneità delle dimensioni delle fibre amiloidi o simili all'amiloide osservate durante l'SDD-AGE tradizionale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'amiloide o dell'aggregazione proteica, ad esempio se l'eterogeneità dimensionale osservata durante l'SDD-AGE tradizionale sia lo stato nativo delle fibre in vivo o il risultato della degradazione o della dissociazione delle proteine durante l'elettroforesi su gel. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere eseguita facilmente in laboratorio senza attrezzature specializzate.
Non sono necessarie apparecchiature aggiuntive oltre a quelle utilizzate nell'SDD-AGE tradizionale. Innanzitutto, semina le cellule tumorali del colon HT-29 produttrici di amiloide in un piatto di coltura tissutale di 10 centimetri. Quindi, incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza, utilizzare soluzione salina tamponata con fosfato per lavare le cellule. Quindi, aggiungere tre millilitri di tripsina alle cellule e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti. Dopo che le cellule si sono staccate dal piatto di coltura, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura alla piastra.
Quindi, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a 1.000 volte g per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aspirare il terreno e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di terreno di coltura.
Contare le celle utilizzando un contatore di celle. Quindi, lasciare due piastre di coltura a 37 gradi Celsius durante la notte. Quindi, aggiungere i reagenti TSZ a una delle piastre di coltura come trattamento.
Dopo circa sei ore, raccogli le cellule usando un raschietto di plastica. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare a 1.000 volte g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, lavare due volte il pellet cellulare con 10 millilitri di soluzione salina ghiacciata tamponata con fosfato e ripetere il processo di centrifugazione.
Quindi, aspirare la soluzione PBS e trasferire il pellet cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 0,3 millilitri di tampone di lisi al pellet cellulare e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Anche in questo caso, centrifugare a 20.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Il surnatante ottenuto è il lisato cellulare intero. Al surnatante, aggiungere il tampone SDD-AGE 4X per preparare 20 microlitri da tre microgrammi per microlitro di campione. Incubare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti.
Per preparare il gel, aggiungere due grammi di polvere di agarosio a 200 millilitri di tampone TAE in un becher di vetro. Quindi, scaldare il becher in un forno a microonde per sciogliere l'agarosio. Quindi, aggiungere un millilitro di SDS al 20% a una concentrazione finale dello 0,1%Agitare delicatamente il becher.
Successivamente, versare l'agarosio liquido su una lastra di gel di 15 x 14 centimetri. Per rimuovere eventuali bolle d'aria, utilizzare una pipetta da un millilitro. Quindi, posiziona un pettine da 20 pozzetti sopra il gel.
Quindi, aggiungi circa 60 microgrammi di lisato di cellule intere nella corsia all'estrema destra del gel. Far funzionare il gel a 60 volt per circa quattro ore utilizzando il tampone TAE contenente lo 0,1% di SDS come tampone di corsa. Per far scorrere il gel nella seconda dimensione, ruotare con cautela il gel di 90 gradi in senso antiorario.
Quindi, far funzionare il gel a 60 volt per circa quattro ore. In un contenitore di 20 x 20 centimetri, aggiungere 500 millilitri di tampone di trasferimento. Proprio accanto al contenitore, prepara una pila di tovaglioli di carta alta cinque centimetri.
Quindi, immergere due carte da filtro, ciascuna delle dimensioni di 14 x 15 centimetri, nel tampone di trasferimento e posizionarle sopra la pila di carta assorbente. Attivare una membrana PVDF di 14 x 15 centimetri in metanolo per 30 secondi. Dopo l'attivazione, posizionare la membrana sopra la carta da filtro e utilizzare un rullo per rimuovere tutte le bolle.
La parte più importante del trasferimento è assicurarsi che non si formino bolle d'aria tra il gel e la membrana. Sciacquare il gel con il tampone di trasferimento e sovrapporlo sopra la membrana. Stendere le bolle formate.
Quindi, utilizzare un involucro di plastica per coprire il bordo dei tovaglioli di carta più vicini al contenitore del buffer di trasferimento. Quindi, immergere un pezzo di carta da filtro con dimensioni di 15 x 35 centimetri nel tampone di trasferimento. Posizionare la carta da filtro in modo che un'estremità copra la parte superiore del gel e l'altra estremità si trovi nel contenitore del tampone di trasferimento.
Coprite il contenitore con pellicola trasparente e lasciate riposare per una notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, sciacquare la membrana con 50 millilitri di PBST in un contenitore di 20 x 20 centimetri. Successivamente, aggiungere 20 millilitri di latte al 5% in PBST sulla membrana.
Quindi, lasciare la membrana sul bilanciere a temperatura ambiente per 30 minuti per bloccarla. Pipettare 10 microlitri di anticorpo anti-MLKL di coniglio in 20 millilitri di latte al 5% in PBST. Quindi, aggiungere la miscela di anticorpi sulla membrana.
Incubare la membrana su un bilanciere durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi, lavare la membrana con 20 millilitri di PBST per cinque minuti. Questo lavaggio viene ripetuto cinque volte.
Successivamente, pipettare quattro microlitri di anticorpi anti-coniglio-HRP in 20 millilitri di latte al 5% in PBST. Aggiungere l'anticorpo sulla membrana. Lasciare il contenitore con la membrana sul bilanciere a temperatura ambiente per due ore.
Dopo due ore, lavare la membrana cinque volte in 20 millilitri di PBST per cinque minuti ciascuna. Infine, aggiungere un substrato di chemiluminescenza potenziato sulla membrana. Quindi, esporre la membrana alla pellicola radiografica secondo le istruzioni del produttore.
Questo studio è stato condotto per dimostrare la presenza di fibre simili all'amiloide resistenti alla SDS nei lisati di cellule intere ottenute da cellule trattate con fattore di necrosi tumorale alfa. Mostra qui che RIPK1 e RIPK3 mostrano modelli simili identici all'amiloide. È interessante notare che le fibre MLKL sembrano eterogenee con un modello di migrazione diverso rispetto alle altre.
Questa immagine mostra il possibile modello di migrazione delle fibre amiloidi o simili all'amiloide. Nella SDD-AGE di prima dimensione, le fibre amiloidi o amiloidi mostrano un caratteristico striscio. In questa immagine, le fibre migrano in modo identico nella seconda corsa e mostrano un modello diagonale di migrazione sulla membrana a 45 gradi.
Ciò dimostra che le fibre non subiscono degradazione o dissociazione durante il processo di esecuzione del gel. Al contrario, se le fibre si dissociano, c'è una striatura verticale al di sotto della linea diagonale, che indica una migrazione più rapida delle fibre più piccole durante la seconda elettroforesi. Sia queste SDD-AGE di prima che di seconda dimensione mostrano che le fibre MLKL non si dissociano durante il processo SDD-AGE e sono infatti distinte dalle fibre RIPK1 e RIPK3.
In questa immagine, le fibre MLKL mostrano una caratteristica macchia durante la prima dimensione. Tuttavia, le stesse fibre mostrano una linea diagonale netta senza striature verticali nella seconda dimensione SDD-AGE. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che tutte le condizioni, come la tensione e la lunghezza della corsa, rimangono le stesse tra la prima e la seconda dimensione per garantire una linea netta con un angolo di 45 gradi.
Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come lo stripping della membrana e il risondaggio con altri anticorpi, per rispondere a ulteriori domande, ad esempio se la fibra contiene altre proteine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come confermare che non si verifica alcuna degradazione o dissociazione di fibre amiloidi o simili all'amiloide durante l'SDD-AGE tradizionale.
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Panoramica
Questo studio utilizza l'elettroforesi in gel di agarosio semi-denaturante bidimensionale per analizzare l'eterogeneità dimensionale delle fibre di tipo amiloidogeno. Il metodo mira a determinare se le variazioni dimensionali osservate siano intrinseche alle fibre o costituiscano il risultato di una dissociazione durante il processo elettroforetico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Aggregazione proteica
Sfondo
- Le fibre di tipo amiloide sono associate a varie malattie neurodegenerative.
- Comprendere le loro dimensioni e stabilità è fondamentale per chiarire il loro ruolo nei meccanismi delle malattie.
- I metodi tradizionali potrebbero non riflettere con precisione lo stato nativo di queste fibre.
- L'eterogeneità dimensionale può complicare l'interpretazione dei risultati sperimentali.
Scopo dello studio
- Verificare la presenza di fibre di tipo amiloloide di dimensioni eterogenee.
- Stabilire se l'eterogeneità dimensionale sia dovuta a caratteristiche native o ad artefatti sperimentali.
- Fornire un metodo affidabile per lo studio delle fibre amiloidi in laboratorio.
Metodi Utilizzati
- Elettroforesi su gel agarosio semidenaturante bidimensionale.
- Seeding di cellule tumorali del colon HT-29 produttrici di amiloide.
- Incubazione delle cellule a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.
- Analisi dei risultati ottenuti con il gel per valutare dimensione e stabilità delle fibre.
Risultati principali
- Conferma dell'eterogeneità dimensionale nelle fibre di tipo amiloide.
- Esclusione della dissociazione come causa delle variazioni dimensionali osservate.
- Validazione del metodo come approccio affidabile per lo studio delle fibre amiloidi.
- Informazioni sullo stato nativo delle fibre amiloidi in vivo.
Conclusioni
- L'elettroforesi in gel di agarosio semidenaturante bidimensionale è efficace per lo studio delle fibre di tipo amiloide.
- L'eterogeneità dimensionale è una caratteristica intrinseca delle fibre e non un artefatto del metodo.
- Questa tecnica può favorire i progressi nella ricerca nei campi dell'amiloide e dell'aggregazione proteica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La conferma dello stato nativo delle fibre di tipo amiloide è fondamentale per la validazione degli obiettivi nella ricerca sulle malattie neurodegenerative, in cui le proteine soggette ad aggregazione rappresentano target di alto valore ma ad alto rischio. Questo metodo SDD-AGE bidimensionale riduce i rischi meccanicistici distinguendo l'eterogeneità reale delle fibre dagli artefatti indotti dall'elettroforesi, aumentando così la fiducia predittiva nei saggi di interazione con il target. Consentendo una valutazione diretta e qualitativa della stabilità delle fibre nei lisati cellulari senza necessità di purificazione, l'approccio supporta i flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta e riduce la dipendenza da tecniche specializzate a bassa produttività come la microscopia elettronica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche accertando se le distribuzioni osservate delle dimensioni delle fibre rispecchino effettivamente le strutture amiloidi native in vivo.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale del bersaglio senza la necessità di purificare le proteine, accelerando i tempi di transizione da "hit" a "lead" nei programmi che coinvolgono bersagli con tendenza all'aggregazione.
- Affidabilità predittiva: Supporta la selezione del portafoglio identificando e riducendo i rischi associati a bersagli la cui tendenza all'aggregazione potrebbe essere interpretata erroneamente a causa di artefatti metodologici.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening successivo confermando l'integrità delle fibre in condizioni denaturanti.
- Output quantitativo: Genera dati sui modelli di migrazione che possono essere correlati a variazioni indotte da composti nella stabilità o nelle dimensioni delle fibre.
- Riutilizzo della piattaforma: Sfrutta l'infrastruttura SDD-AGE esistente, senza richiedere attrezzature specializzate oltre agli strumenti standard per elettroforesi su gel e trasferimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Si applica a vie associate all'amiloide in oncologia e neurodegenerazione, dove l'eterogeneità delle fibre può influenzare il segnale o la tossicità.
- Continuità traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro alla conferma dello stato nativo, supportando l'allineamento dei biomarcatori nei modelli preclinici.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Chiarisce se la variabilità delle fibre derivi da complessità biologica o da artefatti sperimentali, fornendo indicazioni per decisioni di prosecuzione o interruzione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione di composti promettenti, in particolare per programmi rivolti a percorsi proteici legati all'aggregazione in cui la stabilità delle fibre influisce sul meccanismo d'azione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi distinguendo l'eterogeneità nativa delle fibre dagli artefatti di dissociazione durante l'analisi elettroforetica.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi confermando che i modelli di fibre osservati siano riproducibili e non dovuti a dissociazione indotta dal gel.
- Analisi: Fornisce risultati qualitativi di migrazione (ad esempio, modelli di striature diagonali) che aiutano a confrontare la stabilità delle fibre in diverse condizioni o in seguito a perturbazioni genetiche.
- Ricerca traslazionale: Collega i fenotipi di aggregazione cellulare alla validazione dello stato nativo, favorendo un avanzamento nei modelli preclinici adeguato al rischio.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità piattaforma riutilizzabile su diversi bersagli suscettibili di amiloidogenesi, riducendo lo sviluppo metodologico ridondante.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi confermando che l'eterogeneità della dimensione delle fibre ha un significato biologico.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra laboratori eliminando una fonte chiave di variabilità nell'analisi delle fibre.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale riducendo i falsi allarmi derivanti da artefatti metodologici nei saggi di aggregazione.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei target aggiustata per il rischio, basata su dati affidabili sulla stabilità delle fibre.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biochimica delle proteine e tecniche di elettroforesi su gel.
- Si basa su attrezzature standard per elettroforesi, agarosio, SDS, tampone TAE e materiali per il trasferimento.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda tensione, tempo di corsa e manipolazione dei gel, al fine di garantire schemi di migrazione diagonale riproducibili.
- L'adattamento ad aggregati non amiloidi può richiedere un'ottimizzazione delle condizioni di lisi e di elettroforesi.
- Limitato alla valutazione qualitativa; non sostituisce metodi di determinazione quantitativa delle dimensioni quando è necessaria una precisa determinazione della massa.
