Summary
在这里, 我们提出一个协议, 以描述细胞外囊泡 (电动车) 隔离在体外培养培养基从成年日本血吸虫。
Abstract
胞外囊泡 (EVs) 是由多种细胞释放到胞外微环境中的膜状囊泡。EVs 代表了异质泡的种群, 其大小范围介于40和 1000 nm 之间。积累的证据表明, 电动车在病原宿主相互作用中起着重要的调控作用。对血吸虫电动车的深入了解, 应能洞察血吸虫与宿主相互作用的机制, 从而有助于制定防治血吸虫病的新策略。在这里, 我们的目的是进一步研究电动车在血吸虫的功能, 提出了一个协议, 以隔离和特征的电动车从成年的日本血吸虫(S. 血吸虫)。使用离心结合商用外切隔离套件, 从体外培养基中分离出电动汽车。隔离的日本血吸虫EVs (SjEVs) 通常具有 100-400 nm 的直径, 其特征是透射电镜和西方印迹。PKH67 染料标记 SjEVs 的使用表明, SjEVs 是由受体细胞内部化的。总的来说, 我们的协议提供了一种从成人血吸虫隔离电动车的替代方法;隔离 SjEVs 可适用于功能分析。
Introduction
胞外囊泡 (EVs) 是一种含有多种蛋白质、脂质和核酸的小膜状囊泡的种群。最近的研究表明, 电动车在细胞通讯中起着至关重要的作用, 并参与了许多生理过程的调节, 包括细胞发育、免疫调节、血管生成和细胞迁移2, 3,4,5。累积证据表明, 电动车、循环外来体及其 miRNA 货物代表某些疾病的潜在生物标志物 6.
一些原生动物如阴道毛滴虫、锥虫和利什曼原虫, 已被证明能够分泌电动车;此外, 还发现蠕虫将 EVs 分泌到活主机7中。寄生电动车已被证明涉及感染的维护, 致病性8和免疫调节9。最近在血吸虫的研究中,日本曼氏(曼氏) 10,11和日本血吸虫12已经表明, 成年血吸虫分泌外切样的水泡, 可能是参与特定生物过程的功能规范。
迄今为止, 已有几种方法用于分离胞外囊泡, 如离心、超滤13、聚合物基试剂的使用、大小排除色谱和免疫亲和层析隔离。这些不同的方法具有各自的优点和局限性14。一般认为, 离心是囊泡分离的金标准方法。但是, 此方法受到可能的 EV 聚合14的限制。
在血吸虫中, 已报告了两种 EV 隔离的方法: 包括离心11、12、10和使用商用 EV 隔离套件16等几个阶段 (鸡蛋16,血吸虫童虫11, 成人血吸虫10, 12, 17).鉴于微泡的尺寸范围从数以千纳米到上千奈米, 我们开发了一种替代方法, 结合使用台式离心机, 超滤, 和商用 EV 隔离套件, 以隔离电动车从成年的日本血吸虫。隔离的电动车通常拥有直径 100-400 nm, 并成功地内化的接收细胞。
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Protocol
所有动物实验均获中国科学院上海兽医研究所地方伦理委员会批准 (许可证编号: SHVRIAU-14-0101)。
1.血吸虫的体外区域性
注意:血吸虫表示生物危害。在处理蠕虫、血吸虫悬浮液或其他相关生物材料时, 工人应始终佩戴乳胶手套。新西兰兔感染了2000尾蚴通过腹部暴露。血吸虫在肝脏阶段从感染了日本血吸虫尾蚴的家兔身上采集肝脏和肠系膜静脉, 感染后28天。在以前发布的18小鼠报告研究中引用了蠕虫收集过程。
- 在500毫升的烧杯中收集寄生虫。用200毫升预热 (37 °c) PBS (pH 7.4) 将其彻底洗净并轻轻地3x。
- 分别为每90毫米培养皿200个蠕虫对。然后用50毫升预热的 (37 °c) 的 RPMI-1640 培养基, 用 100 U 的青霉素和100毫克/毫升的链霉素, 彻底和温和地洗涤寄生虫2x。
- 在40毫升的预热 RPMI-1640 培养基中保持寄生虫, 37 摄氏度以下 5% CO2在5毫米培养皿 2 h 的密度为 ~ 90 蠕虫对/毫升。
备注:RPMI 1640 培养基不应含有血清, 否则将引入外源性胞外囊。
2. 预处理的条件介质
- 收集培养基, 然后离心培养基在4°c 在 2000 x g 30 分钟, 以消除鸡蛋和蠕虫盖碎片。
- 将上清液转移到新鲜的管子上, 然后用0.22 µm 注射器过滤器过滤溶液。
- 收集过滤后的解决方案在一个透析袋 (分子量切断: 3.5kD), 然后透析解决方案使用 8% PEG8000 溶液在4摄氏度过夜。
备注:这一步对丰富 SjEVs 提高 SjEVs 分离率具有重要意义。
3. SjEVs 的分离
- 将透析溶液转移到新管, 然后添加0.5 卷的总外切隔离试剂。
- 通过涡流或吹打向上和向下混合解决方案, 以确保解决方案的均匀性。
- 孵化混合物在2°c 到8°c 过夜。
- 离心机混合物在 1.5万 x g 为1小时在2°c 到8°c。
- 吸入并丢弃上清。
备注:电动车包含在管底部的颗粒中 (在大多数情况下不可见)。 - 并用重悬2毫升 PBS 中的电动车颗粒, 然后将 evs 解决方案存储在-80 摄氏度, 直到进一步分析。
4. 西方印迹对电动汽车的表征
- 测定 SjEVs 样品的蛋白质浓度,例如,通过鉴定分析。
- 在22.5 µL 马国贤缓冲区中准备 10-20 µg 的 EVs。然后增加7.5 µL 4x 装载缓冲和热量5分钟在95°c。
- 用12% 页凝胶分离 SjEVs 蛋白。
- 将蛋白质转移到 PVDF 膜, 然后用 anti-CD63 抗体 (1:1, 000 稀释) 探针, 然后用抗兔 IgG (1:5, 000 稀释) 进行探测。
- 利用 ECL 检测试剂进行膜开发, 通过化学发光成像系统检测信号。
5. 电动汽车的透射电镜表征
- 添加2µL 的隔离 SjEVs 到200网格 formvar 涂层网格, 然后允许它在室温下干燥。
- 用2% 磷钨酸染色1分钟, 然后使其在室温下干燥。
- 将网格加载到透射电子显微镜的样品架上, 并暴露在 80 kV 电子束上以进行图像捕捉。
6. SjEVs 标签与 PKH67 和细胞吸收试验
备注:所有后续步骤都是在室温下 (20-25 °c) 进行的, 除非另有说明。
- 将5µg SjEVs 溶液转化为锥形底聚丙烯管, 并通过添加 RPMI 1640 培养基将体积调整到12毫升。
- 离心机 SjEVs 在 11万 x g 为90分钟在4°c 到颗粒 SjEVs。
- 离心后, 小心地吸入上清液。
注意:PKH67 乙醇染料不应直接添加到 SjEV 颗粒, 因为这将导致异质染色和降低细胞活力。 - 在 SjEV 颗粒中加入1毫升稀释剂 C, 制备 2x EV 悬浮液;为了确保完全分散, 并用重悬与温和的吹打。
- 在稀释剂 c 染色前, 在聚丙烯离心管中加入2µL 的 PKH67 乙醇染料溶液, 将1毫升的稀释剂 c 添加到分散的混合井中, 制备出一种新鲜的2x 染料溶液。
- 快速添加1毫升 2x EV 悬浮 (步骤 6.4) 到1毫升2x 染料溶液 (步骤 6.5), 并立即混合样品的吹打。
- 室温下将混合物孵化4分钟。
- 通过添加4毫升的血清, 然后孵育1分钟, 停止染色。
- 添加 RPMI1640 介质, 以调整体积为12毫升, 然后离心机在 11万 x 克4°c 90 分钟。
- 取出上清液并添加 RPMI1640 培养基并用重悬 PKH67 标记 SjEV 丸。
- 离心机在 11万 x g 在4°c 90 分钟清洗一次, 然后添加 PBS 并用重悬 SjEVs 丸。
7. SjEVs 细胞吸收试验
- 种子哺乳动物细胞, 如国家反恐中心克隆1469细胞或 HEK293T 细胞在6井板 (2×10 5 细胞每井) 和培养细胞过夜。
- 添加5µg PKH67-labelled SjEVs, 然后培养细胞在37°c 为 2-4 h。
- 孵化后, 取出培养基, 用 PBS 清洗细胞两次。
- 用4% 甲醛溶液固定细胞15分钟, 再用 PBS 清洗两次。
- 染色细胞细胞核与 4′-, 6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI)。
- 用荧光显微镜观察细胞。
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Representative Results
为了用所描述的协议来量化孤立 SjEVs 的产量, 我们利用 SjEVs 蛋白质检测方法, 从28天成年血吸虫中获取分离的蛋白质浓度。如表 1所示, SjEV 蛋白浓度从208µg 到250µg 每100毫升培养基 (表 1) 不等。由马尔文纳米粒子分析确定的粒子大小表明, 隔离的 SjEVs 从 100 nm 到 400 nm 不等, 在大小上大约 220 nm (图 1)。通过透射电镜对 SjEVs 的进一步表征表明, 电动车的直径约为 100-200 nm 的圆形囊泡 (图 2)。西方印迹分析表明, 孤立 SjEVs 是公认的使用 CD63 抗体, 这是一个典型的 EV 标记 (图 3)。荧光显微观察表明, PKH67-labeled SjEVs 由国家反恐中心克隆1469细胞内化, SjEVs 主要分布在受体细胞的细胞质中(图 4)。
| 样品 | EVs/100ml 培养基 |
| #1 | 250µg |
| #2 | 208µg |
| #3 | 220µg |
表 1:从培养基中获得的 SjEVs 蛋白; 显示了每100毫升培养基中的 SjEVs 的数量, 其中含有 ~ 500 条蠕虫对.
图 1: 从培养培养基中分离出的 SjEVs 的大小分布.20µL SjEVs 溶液稀释1000µL PBS;然后用高性能的二角粒子和分子量分析仪对该混合物进行了分析。所显示的结果是三独立隔离数据的代表。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 透射电镜对 SjEVs 的表征.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 对 CD63 抗体的孤立 SjEVs 的西方印迹分析.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 哺乳动物细胞摄取 SjEVs.标记为 SjEVs 的 PKH 显示为绿色, 而细胞核则以蓝色显示。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
最近对电动汽车的研究表明, 血吸虫电动车在宿主病原体相互作用中起着重要作用3,9,12,16。为了进一步解决它们的管理功能, 必须将 EVs 与血吸虫隔离开来。在这里, 我们描述了一种 SjEV 隔离的替代方法。此方法从 100 nm 到 400 nm, 在成年的日本血吸虫中产生 SjEVs 的宽范围大小。下面的细胞摄取检测表明, 被描述的协议下的 EVs 被接收单元成功地内化, 并且它们的关联 miRNAs 可能发挥管理角色17。
电动车, 可能由许多不同类型的细胞分泌, 也存在于各种体液19。因此, 在 SjEV 隔离过程中, 避免人为地引入外源电动汽车是很重要的。例如, 培养基不应含有血清。体外区域性中的蠕虫密度应合理, 以最小化潜在的应力响应, 并降低蠕虫的死亡率。此外, 应该指出, 不同主机血吸虫或蠕虫的不同阶段可能呈现不同的电动车。因此, 必须在与宿主环境非常相似的体外环境中维护寄生虫, 并且执行 SjEV 隔离的条件必须是一致的。此外, 我们无法排除与文化压力引起的 SjEVs 相关的方差的可能性。
在这里, 我们提出了一个协议, 以隔离 SjEVs 从 2 h体外培养基的成人血吸虫。这个协议的好处是短的培养时间减少寄生虫暴露的压力, 可能导致非生理的 EV 分泌。此外, 我们发现, 该协议中描述的 SjEVs 被接收细胞内部化, 这表明这些 SjEVs 可能是生物活性的17。总的来说, 本议定书允许使用标准实验室设备有效地将 SjEVs 从成人蠕虫中分离出来, 并利用西方的印迹和细胞摄取方法来进行鉴定。隔离的电动车可用于进一步表征寄主-病原体的相互作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究部分或全部由中国国家自然科学基金 (31472187 和 31672550) 和中国科学院农业科技创新项目资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
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