Summary
Qui, presentiamo un protocollo per descrivere isolamento di vescicole extracellulari (SVE) nel mezzo di coltura in vitro da adulto Schistosoma japonicum.
Abstract
Vescicole extracellulari (EVs) sono membranose vescicole rilasciate da una varietà di cellule nel microambiente extracellulare. SVE rappresentano una popolazione di vescicole eterogenee, cui intervallo di grandezza tra 40 e 1.000 nm. Prove accumulate indicavano che EVs svolgere ruoli importanti regolatori in interazioni ospite-patogeno. Una profonda comprensione di schistosome EVs dovrebbe fornire i meccanismi alla base di interazioni di schistosome-ospite, che permette lo sviluppo di nuove strategie contro la schistosomiasi: intuizioni. Qui, ci proponiamo di studiare ulteriormente funzioni di EVs in schistosomes presentando un protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione del SVE da adulto Schistosoma japonicum (S. japonicum). SVE sono state isolate da in vitro mezzo di coltura mediante centrifugazione combinato con un kit di isolamento commerciale esosomi. L' isolato S. japonicum EVs (SjEVs) in genere possiedono un diametro di 100-400 nm e sono caratterizzate da microscopia elettronica di trasmissione e western blotting. L'utilizzo di PKH67 tingere-contrassegnati SjEVs ha dimostrato che SjEVs sono interiorizzati dalle cellule del destinatario. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce un metodo alternativo per isolare SVE da adulto schistosomes; il SjEVs isolato può essere adatto per l'analisi funzionale.
Introduction
Vescicole extracellulari (EVs) sono una popolazione di piccole vescicole di membrana-limitano incapsulato con varie proteine, lipidi e acidi nucleici. Studi recenti hanno dimostrato che EVs svolgono un ruolo cruciale nella comunicazione cellula-cellula e sono coinvolti nella regolazione di numerosi processi fisiologici, tra cui lo sviluppo delle cellule, regolazione immunitaria, angiogenesi e cella migrazione2, 3,4,5. Raccogliendo la prova indica che EVs, circolazione esosomi e loro carico di miRNA rappresenta potenziali biomarcatori di determinate malattie6.
Alcuni protozoi quali Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzie Leishmania spp., hanno dimostrato di essere in grado di secernere EVs; elminti inoltre sono stati trovati per secernere EVs in vita ospita7. EVs parassita sono stati indicati per essere coinvolti nel mantenimento dell'infezione, patogenicità8e9di regolazione immunitaria. Recenti studi in schistosomes entrambi Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 e S. japonicum12 hanno indicato che adulti schistosomes secernono esosomi-come vescicole che possono essere coinvolto nei regolamenti funzionali di specifici processi biologici.
Ad oggi, sono stati utilizzati diversi metodi per isolare le vescicole extracellulari, quali ultracentrifugazione, ultrafiltrazione13, l'uso di reagenti a base di polimeri, cromatografia di esclusione dimensionale e l'isolamento di immunoaffinità. Questi metodi differenti possiedono i propri vantaggi e limitazioni14. Generalmente, ultracentrifugazione è considerato il metodo gold standard per l'isolamento delle vescicole. Tuttavia, questo metodo soffre dalla limitazione del potenziale di aggregazione EV14.
In schistosomes, sono stati segnalati un paio di metodi per l'isolamento di EV: questi includono ultracentrifugazione11,12,10 e l'uso di kit commerciali isolamento di EV16 per diverse fasi (uova16, schistosomula11, schistosomes adulto10,12,17). Dato che microvescicole sono di una vasta gamma di dimensioni da diverse centinaia di nanometri a mille nanometri, abbiamo sviluppato un metodo alternativo che si combina con l'uso della centrifuga di panca, ultrafiltrazione e un kit di isolamento commerciale EV per isolare lo SVE da adulto Schistosoma japonicum. Lo SVE isolato in genere ha posseduto un diametro di 100-400 nm e con successo sono stato interiorizzato dalle cellule del destinatario.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico locale dell'Istituto di ricerca veterinaria di Shanghai, Accademia cinese delle scienze agricole (permesso numero: SHVRIAU-14-0101).
1. cultura in Vitro di Schistosomes
Nota: Schistosomes rappresentano un rischio biologico. I lavoratori devono indossare guanti in lattice a tutti volte quando correlate a handling vermi, sospensioni schistosomal o altri materiali biologici. Nuova Zelanda conigli sono stati infettati con ~ 2.000 cercarie via addominale dell'esposizione. Schistosomes nella fase del fegato sono stati raccolti da conigli infettati con S. japonicum cercarie a 28 giorni post-infezione di aspersione del fegato e vene mesenteriche. Le procedure di raccolta di vite senza fine sono stato fatto riferimento in precedenti pubblicazioni che riportano studi in topi18.
- Raccogliere i parassiti in un becher da 500 mL. Lavarli accuratamente e delicatamente 3 x 200 ml di preriscaldato (37 ° C) PBS (pH 7.4).
- Separare le coppie di verme di ~ 200 per ogni piatto di Petri di 90 mm. Quindi lavare i parassiti accuratamente e delicatamente 2 x 50 ml di preriscaldato (37 ° C) terreno di coltura RPMI-1640 che contiene 100 U di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina.
- Mantenere i parassiti in 40 mL di terreno di coltura RPMI-1640 preriscaldato senza antibiotici a 37 ° C, inferiore al 5% CO2 ad una densità di verme ~ 5 coppie/ml per 2 h a 90 millimetri Petri dish.
Note: Il medium RPMI 1640 non deve contenere siero, altrimenti saranno introdotte delle vescicole extracellulari esogena.
2. pre-trattati condizione Media
- Raccogliere il terreno di coltura e poi Centrifugare il mezzo a 4 ° C a 2.000 × g per 30 min rimuovere uova e detriti tegmentale a vite senza fine.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta e quindi filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,22 µm.
- Raccogliere la soluzione filtrata in un sacchetto di dializzato (cut-off peso molecolare: 3.5kD) e poi Dializzare la soluzione utilizzando 8% PEG8000 soluzione a 4 ° C durante la notte.
Note: Questo passaggio è importante per arricchire SjEVs per aumentare il rendimento di isolamento SjEVs.
3. isolamento di SjEVs
- Trasferire la soluzione dializzata ad un nuovo tubo e quindi aggiungere 0,5 volumi del reagente esosomi totale isolamento.
- Miscelare la soluzione bene da Vortex o su e giù il pipettaggio per garantire l'omogeneità della soluzione.
- Incubare la miscela a 2 ° C-8 ° C per una notte.
- Centrifugare la miscela a 15.000 × g per 1 h a 2 ° C – 8 ° C.
- Aspirare e scartare il surnatante.
Note: SVE sono contenute nel pellet nella parte inferiore del tubo (non visibile nella maggior parte dei casi). - Risospendere il pellet di EVs in 2 mL di PBS e quindi conservare la soluzione di EVs a-80 ° C fino a ulteriore analisi.
4. caratterizzazione del SVE mediante Western Blotting
- Determinare la concentrazione nella proteina del campione SjEVs, per esempio, dall'analisi di BCA.
- Preparare 10-20 µ g di SVE in 22,5 µ l di tampone RIPA. Quindi aggiungere 7,5 µ l di 4 x caricamento buffer e calore per 5 min a 95 ° C.
- Separare le proteine SjEVs di gel di SDS-PAGE 12%.
- Trasferire le proteine alla membrana PVDF e quindi sonda con anticorpi anti-CD63 (1:1, 000 diluizione), seguiti da sondare con anti-coniglio IgG-HRP (1:5, 000 diluizione).
- Utilizzare il reagente di rivelazione ECL per lo sviluppo della membrana e rilevare i segnali da una sistema di imaging di chemiluminescenza.
5. caratterizzazione del SVE da microscopia elettronica di trasmissione
- Aggiungere 2 µ l di SjEVs isolato a 200 mesh rivestite con formvar griglie e quindi lasciare asciugare a temperatura ambiente.
- Macchia con 2% acido fosfotungstico per 1 min e poi lasciare asciugare a temperatura ambiente.
- Caricare le griglie sul supporto del campione del microscopio elettronico a trasmissione ed esposto ad un fascio di elettroni kV 80 per l'acquisizione immagine.
6. SjEVs etichetta con PKH67 e analisi di assorbimento cellulare
Note: Tutti i passaggi successivi sono stati effettuati a temperatura ambiente (20-25 ° C), se non diversamente indicato.
- Trasferire 5 µ g SjEVs soluzione in una provetta di polipropilene fondo conico e regolare il volume di 12 mL aggiungendo medium RPMI 1640.
- Centrifugare il SjEVs a 110.000 × g per 90 min a 4 ° C per pellet SjEVs.
- Dopo la centrifugazione, aspirare accuratamente il supernatante.
Nota: Il colorante etanolico di PKH67 non deve essere aggiunte direttamente per il pellet SjEV, quanto ne risulterebbe in colorazione eterogenea e vitalità cellulare ridotto. - Preparare una soluzione di sospensione EV 2x aggiungendo 1 mL di diluente C al pellet di SjEV; per garantire la completa dispersione, risospendere con delicata pipettaggio.
- Appena prima della colorazione in diluente C, preparare un fresco 2 x soluzione colorante aggiungendo 2 µ l della soluzione etanolica tintura PKH67 a 1 mL di diluente C in una provetta da centrifuga in polipropilene e mescolando bene per disperdere.
- Consente di aggiungere rapidamente il 1 mL di 2 x EV sospensione (punto 6.4) a 1 mL di 2 x soluzione colorante (passo 6,5) e immediatamente mescolare il campione di pipettaggio.
- Incubare la miscela a temperatura ambiente per 4 min.
- Interrompere la colorazione con l'aggiunta di 4 mL di FBS e poi incubare per 1 min.
- Aggiungere il terreno RPMI1640 per regolare il volume di 12 mL e poi Centrifugare a 110.000 × g a 4 ° C per 90 min.
- Rimuovere il supernatante e aggiungere mezzo RPMI1640 per risospendere il PKH67 con l'etichetta SjEV pellet.
- Centrifugare a 110.000 × g a 4 ° C per 90 min lavare una volta e quindi aggiungere PBS per risospendere il pellet di SjEVs.
7. SjEVs cella analisi di assorbimento
- Le cellule di mammiferi di seme come NCTC clonare cellule 1469 o HEK293T cellule in piastre da 6 pozzetti (2 × 105 cellule per pozzetto) e le cellule della coltura durante la notte.
- Aggiungere 5 µ g SjEVs PKH67-etichettati e quindi della coltura le cellule a 37 ° C per 2-4 h.
- Dopo l'incubazione, rimuovere il supporto e lavare le cellule con PBS due volte.
- Fissare le cellule con soluzione di formaldeide 4% per 15 min e lavato due volte con PBS.
- Macchia i nuclei delle cellule con 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Osservare le cellule mediante microscopia a fluorescenza.
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Representative Results
Per quantificare il rendimento di SjEVs isolato utilizzando il protocollo descritto, abbiamo usato l'analisi della proteina di BCA per accedere la concentrazione nella proteina del SjEVs isolato da schistosomes adulto 28 giorni. Come illustrato nella tabella 1, la concentrazione di proteina SjEV ha variata da 208 µ g a 250 µ g / 100 mL di terreno (tabella 1). La dimensione delle particelle, come determinato mediante analisi di nanoparticelle di Malvern, indicato che il SjEVs isolato hanno variato da 100 nm a 400 nm, con la più alta popolazione circa 220 nm in dimensione (Figura 1). Ulteriore caratterizzazione di SjEVs da microscopia elettronica di trasmissione ha rivelato EVs per essere rotonde vescicole di circa 100-200 nanometro di diametro (Figura 2). Western blot analisi hanno indicato che l'isolato SjEVs sono stati riconosciuti utilizzando anticorpi CD63, che è un tipico indicatore EV (Figura 3). Osservazione di microscopia di fluorescenza ha indicato che il SjEVs PKH67-labeled erano interiorizzato dalle 1.469 cellule NCTC clone e che il SjEVs sono stati distribuiti principalmente nel citoplasma delle cellule recettive (Figura 4).
| Campioni | SVE / 100ml terreno di coltura |
| #1 | 250 µ g |
| #2 | µ g 208 |
| #3 | µ g 220 |
Tabella 1: SjEVs proteina ottenuta da terreno di coltura; è visualizzata la quantità di SjEVs letta dall'analisi di BCA per 100 mL di terreno di coltura, che contiene ~ 500 coppie vite senza fine,.
Figura 1 : Distribuzione di SjEVs isolato dal medium coltivato dimensione. 20 µ l di soluzione di SjEVs è stato diluito con 1000 µ l PBS; quindi, la miscela è stata analizzata utilizzando una particella due angolo ad alte prestazioni e analizzatore di dimensione molecolare. Il risultato mostrato è rappresentante dei dati da tre isolamenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Caratterizzazione di SjEVs da microscopia elettronica di trasmissione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Western blotting analisi del SjEVs isolato contro gli anticorpi CD63. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : L'assorbimento di SjEVs di cellule di mammifero. PKH etichettato SjEVs sono mostrati in verde, mentre i nuclei cellulari sono mostrati in blu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Studi recenti su EVs hanno dimostrato quel schistosome che EVS svolgono un ruolo importante nelle interazioni ospite-patogeno3,9,12,16. Per affrontare altre loro funzioni di regolamentazione, è essenziale per isolare SVE da schistosomes. Qui, descriviamo un metodo alternativo per l'isolamento di SjEV. Questo metodo restituisce una dimensione vasta gamma di SjEVs, da 100 nm a 400 nm, in adulto S. japonicum. La seguente analisi di assorbimento cellulare indicato che EVs isolati sotto il protocollo descritto con successo sono stati interiorizzati dalle cellule del destinatario e che loro Mirna associati potenzialmente svolgano ruoli regolatori17.
SVE, che possono essere secernuti da diversi tipi di cellule, sono anche presenti in vari tipi di fluidi corporei19. Di conseguenza, è importante evitare di introdurre artificialmente EVs esogeni durante il processo di isolamento SjEV. Ad esempio, il terreno di coltura non deve contenere del siero. La densità di verme nella cultura in vitro dovrebbe essere ragionevole per minimizzare la potenziale risposta allo stress e abbassare i tassi di mortalità di vermi. Inoltre, si deve osservare che diverse fasi di schistosomes o vermi da diversi host possono presentare diversi EVs. Di conseguenza, è indispensabile per mantenere i parassiti in ambienti in vitro che ricordano da vicino l'ambiente host, e le condizioni sotto cui SjEV isolamento viene eseguita devono essere coerente. Inoltre, siamo in grado di escludere la possibilità della varianza legata alla SjEVs causato dallo sforzo di cultura.
Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento di SjEVs da 2h in vitro mezzi di coltura per adulto schistosomes. Un vantaggio di questo protocollo è che cultura breve tempo riduce al minimo lo stress a cui sono esposti i parassiti, che può provocare la secrezione EV non-fisiologica. Inoltre, abbiamo trovato che il SjEVs isolato come descritto in questo protocollo sono stato interiorizzato dalle cellule del destinatario, suggerendo che queste SjEVs possono essere biologicamente attivo17. Nel complesso, il presente protocollo consente l'isolamento efficiente di SjEVs da adulto worm utilizzando la normale attrezzatura da laboratorio e consente loro caratterizzazione mediante western blot e analisi di assorbimento delle cellule. Lo SVE isolato possono essere utilizzato per più ulteriormente caratterizzare le interazioni ospite-patogeno.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato, in parte o in toto, supportati da National Natural Science Foundation of China (31472187 e 31672550) e The Agricultural Science e Technology Innovation Program dell'Accademia cinese delle scienze agrarie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
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