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Biochemistry

A11-positive β-amyloid Oligomer तयारी आणि असेसमेंट प्रयोग डॉट सोख्ता विश्लेषण

Published: May 22, 2018 doi: 10.3791/57592
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2, 1, 3, 1, 1,2
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Li Dak Sum Yip Yio Chin Kenneth Li Marine Biopharmaceutical Research Center, Ningbo University, 3School of Materials Science and Chemical Engineering, Ningbo University

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक सिंथेटिक पेप्टाइड से Aβ oligomers तैयार करने के लिए विट्रो में और एक डॉट सोख्ता विश्लेषण द्वारा Aβ oligomer के सापेक्ष मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए.

Abstract

β-amyloid (Aβ) स्वयं के लिए एक आंतरिक प्रवृत्ति के साथ एक hydrophobic पेप्टाइड है समुच्चय में इकट्ठा । विभिन्न समुच्चय के बीच, Aβ oligomer को अल्जाइमर रोग (ad) की प्रगति में प्रमुख neurotoxin के रूप में व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है और इसे विज्ञापन के रोगजनन में महत्वपूर्ण घटना माना जाता है । इसलिए, Aβ oligomer अवरोधकों neurodegeneration को रोकने और रोग-विज्ञापन के उपचार को संशोधित करने के रूप में विकसित होने की क्षमता हो सकता है । हालांकि, Aβ oligomer के विभिन्न गठन प्रोटोकॉल विभिन्न विशेषताओं के साथ oligomers करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, वहां नहीं है कई तरीकों को प्रभावी ढंग से स्क्रीन Aβ1-42 oligomer अवरोधकों । एक A11 एंटीबॉडी विरोधी समानांतर β-शीट संरचनाओं के साथ विषाक्त Aβ1-42 oligomer का एक सबसेट के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम इन विट्रो में एक सिंथेटिक Aβ1-42 पेप्टाइड से एक A11-positive Aβ1-42 oligomer-रिच नमूना तैयार करने के लिए और एक डॉट द्वारा नमूनों में A11-धनात्मक Aβ1-42 oligomer की सापेक्ष मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए कैसे का वर्णन करें सोख्ता A11 और Aβ1-42-विशिष्ट 6E10 एंटीबॉडी का उपयोग कर विश्लेषण. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, A11 के अवरोधकों-सकारात्मक Aβ1-42 oligomer भी अर्द्ध मात्रात्मक प्रयोगात्मक परिणामों से दिखलाई जा सकता है ।

Introduction

अल्जाइमर रोग (AD) एक सबसे महत्वपूर्ण neurodegenerative रोगों दुनिया भर में बुजुर्ग लोगों को प्रभावित करने में से एक है1. यह व्यापक रूप से स्वीकार किया है कि β-amyloid (Aβ) के असामान्य एकत्रीकरण विज्ञापन के प्रमुख रोग कारक हो सकता है । Aβ समुच्चय बूढ़ा सजीले टुकड़े, विज्ञापन रोगियों के दिमाग में जैविक मार्करों में से एक के मुख्य घटक हैं । इसके अलावा, Aβ समुच्चय, विशेष रूप से oligomers सहित, शक्तिशाली neurotoxicity, जो ंयूरॉन मौत का कारण हो सकता है के रूप में विज्ञापन की प्रगति का उत्पादन । इसलिए, Aβ oligomer गठन के निषेध neurodegeneration को रोकने सकता है, और Aβ oligomer अवरोधकों के रूप में विकसित किया जा सकता है रोग-विज्ञापन के उपचार को संशोधित करने । कई अध्ययनों से एक सिंथेटिक Aβ पेप्टाइड का इस्तेमाल किया है इन विट्रो मेंoligomers फार्म, morphologies और कृत्रिम Aβ oligomers के संरचनाओं का पता लगाने, और Aβ oligomer के अवरोधकों की जांच इन विट्रो मॉडल2,3 में , 4. हालांकि, इन विट्रो Aβ oligomer के गठन प्रोटोकॉल विभिन्न रूपात्मक विशेषताओं के साथ oligomer करने के लिए नेतृत्व कर सकता है, जो विभिन्न अनुसंधान समूहों के बीच अतुलनीय परिणाम हो सकता है. इसलिए, Aβ oligomer के लिए एक मानक गठन प्रोटोकॉल की तत्काल आवश्यकता है ।

अब तक, नहीं कई तरीकों को सीधे Aβ oligomers का पता लगाने के लिए सूचित किया गया है । ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी (उनि), गैर-denaturing जेल ट्रो, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा), और डॉट सोख्ता विश्लेषण की राशि और/या इन विट्रो5में Aβ oligomer की आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 6. उदाहरण के लिए, Aβ oligomer की आकृति विज्ञान और संरचना को उनि में देखा जा सकता है । Aβ एग्रीगेट के सापेक्ष मात्रा और आणविक आकार गैर-denaturing जेल ट्रो द्वारा मापा जा सकता है । एलिसा सीरम, प्लाज्मा में Aβ oligomer निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और मस्तिष्क के ऊतकों से निष्कर्षों । अंत में, डॉट सोख्ता विश्लेषण, एक तकनीक का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया, विश्लेषण, और प्रोटीन की पहचान, oligomer विशिष्ट और Aβ-विशिष्ट एंटीबॉडी की मदद से विभिन्न नमूनों में Aβ oligomer के सापेक्ष एकाग्रता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, एक डॉट सोख्ता परख महत्वपूर्ण समय बचत प्रदान करता है, जेल ट्रो और जैल के लिए सोख्ता प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं है के रूप में । इसलिए, इस परख सामांय रूप से क्षमता Aβ oligomer अवरोधकों स्क्रीन किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य एक अपेक्षाकृत सरल, विश्वसनीय, और reproducible विधि का वर्णन करने के लिए एक Aβ1-42 oligomer-रिच नमूना तैयार करने के लिए, डॉट oligomer विश्लेषण द्वारा Aβ1-42 सोख्ता की मात्रा का विश्लेषण करने के लिए, और Aβ oligomer स्क्रीन करने के लिए है अर्द्ध मात्रात्मक प्रयोगात्मक परिणामों का उपयोग कर अवरोधकों.

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Protocol

1. समाधान तैयारी

नोट: एजेंट स्रोतों के लिए सामग्री की तालिका देखें ।

  1. एक 5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) BSA के 5 ग्राम डबल आसुत पानी की १०० मिलीलीटर को जोड़कर समाधान तैयार करें । उंहें पूरी तरह से भंवर से मिश्रण । 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान ।
  2. एक एंटी-oligomer एंटीबॉडी A11 समाधान तैयार करें (1:1000) 10 µ l को एंटीबॉडी स्टॉक सॉल्यूशन के 10 मिलीलीटर को जोड़कर 5% BSA समाधान । उंहें पूरी तरह से भंवर से मिश्रण । 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान ।
  3. एक एंटी-Aβ एंटीबॉडी 6E10 समाधान (1:1000) को जोड़कर 10 µ l को एंटीबॉडी स्टॉक सॉल्यूशन की 10 मिलीलीटर की 5% BSA सॉल्यूशन तैयार करें । उंहें पूरी तरह से भंवर द्वारा मिश्रण । 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान ।
  4. एक एंटी-fibrillar oligomer एंटीबॉडी OC समाधान (1:1000) 10 मिलीलीटर के एंटीबॉडी स्टॉक समाधान के १० µ l को जोड़कर 5% BSA समाधान तैयार करें । उंहें पूरी तरह से भंवर द्वारा मिश्रण । 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान ।
  5. Tris बेस के 24 जी और NaCl के ८८ ग्राम को डबल-आसुत जल के १,००० मिलीलीटर से जोड़कर एक Tris-बफर खारा (टीबीएस) स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें । ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें । 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान ।
  6. टीबीएस स्टॉक समाधान और ९०० मिलीलीटर डबल आसुत पानी के बीच-20 से १०० मिलीलीटर की 1 मिलीलीटर जोड़कर एक Tris-बफर खारा और बीच-20 (TBST) समाधान तैयार करें ।
  7. एचआरपी समाधान के 10 मिलीलीटर के लिए सहिजन peroxidase (आईजीजी) बकरी विरोधी खरगोश TBST (एच + एल) के 10 µ एल जोड़कर एक द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें । उंहें पूरी तरह से भंवर से मिश्रण । 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान ।
  8. dimethyl sulfoxide के 1 मिलीलीटर में curcumin के ३.६८ जी भंग (DMSO) एक 10 मिमी curcumin स्टॉक समाधान बनाने के लिए ।
  9. भंग 5 सिंथेटिक Aβ की मिलीग्राम 2 मिलीलीटर में1-42 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) एक 2.5-mg/एमएल Aβ मोनोमर समाधान के लिए फार्म । यह कमरे के तापमान पर प्लेस (25 ° c) के लिए 20 min. Make १०० µ l aliquots और स्टोर पर-20 ° c अप करने के लिए 6 महीने.
    नोट: यह कार्यविधि जितनी जल्दी हो सके चलाया जाना चाहिए । सही pipetting को सुनिश्चित करने के लिए पिपेट टिप्स को काट लेना चाहिए ।
  10. 1:1 की मात्रा अनुपात के साथ ECL द्रव ए और बी मिश्रण से electrochemiluminescence (ECL) द्रव तैयार करें । यह समाधान सिर्फ प्रयोग से पहले तैयार किया जाना चाहिए ।

2. नमूना तैयारी

नोट: डॉट सोख्ता विश्लेषण से 2 दिन पहले नमूना तैयारी निष्पादित करें ।

  1. Aβ1-42 मोनोमर समाधान के एक ट्यूब के लिए डबल आसुत जल के ९०० µ एल जोड़ें; Aβ की एकाग्रता1-42 ०.२५ मिलीग्राम/एमएल होगा । 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण रखें ।
  2. उच्च शुद्धता नाइट्रोजन गैस के साथ समाधान लुप्त हो जाना जब तक इसकी मात्रा के बारे में है ८५० µ l Aβ1-42 समाधान की एकाग्रता के बारे में ०.२९ मिलीग्राम/एमएल होगा ।
    ध्यान दें: समाधान समय समय पर हिल HFIP सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से काफूर हो जाना चाहिए । आम तौर पर, वाष्पीकरण के 30 मिनट के बाद, अवशिष्ट समाधान की मात्रा के बारे में है ८५० µ l
  3. डबल आसुत जल के साथ एक curcumin काम समाधान (०.२ और 2 µ मीटर) के लिए curcumin स्टॉक समाधान पतला । Aβ1-42समाधान और 1:1 की मात्रा अनुपात के साथ काम समाधान curcumin मिश्रण । curcumin की अंतिम सांद्रता ०.१ और 1 µ मीटर होगी ।
    नोट: संभावित oligomer अवरोधकों अगर जरूरत किसी भी अनुपात में Aβ1-42 समाधान के साथ मिलाया जा सकता है ।
  4. एक चुंबकीय आंदोलनकारी में लगातार समाधान हिला ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    1. चुंबकीय आंदोलनकारी के लिए एक प्लास्टिक डिवाइडर बॉक्स को ठीक करें । प्लेस 2 बॉक्स के 2 कोनों पर चुंबकीय हलचल सलाखों और जगह बॉक्स के केंद्र में नमूना ट्यूबों ।
    2. ४८ एच के लिए कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर बॉक्स हिला ।
      नोट: चुंबकीय आंदोलनकारी की गति ६० आरपीएम के आसपास है ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस और १८,००० एक्स जी पर 15 मिनट के लिए ट्यूबों supernatant इकट्ठा ।

3. डॉट सोख्ता विश्लेषण

नोट: सभी मशीन एक क्षैतिज शेखर पर प्रदर्शन कर रहे हैं ।

  1. 1 सेमी चौड़ी स्ट्रिप्स में nitrocellulose झिल्ली में कटौती ।
    नोट: nitrocellulose झिल्ली की चौड़ाई प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है ।
  2. 2 स्ट्रिप्स पर समान रूप से 2-µ एल नमूने प्लेस (1 पट्टी और 2) ०.५ सेमी पर प्रत्येक बिंदु अंतराल के साथ.
  3. जब तक बैंड पर छोटी बूंद सूखी है 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्ट्रिप्स प्लेस ।
  4. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक 5% BSA समाधान के साथ स्ट्रिप्स मशीन ।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक TBST समाधान के साथ स्ट्रिप्स कुल्ला ।
  6. TBST समाधान महाप्राण । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए, एक विरोधी oligomer एंटीबॉडी A11 समाधान और एक विरोधी Aβ एंटीबॉडी 6E10 समाधान के साथ पट्टी 2 के साथ मशीन पट्टी 1 ।
  7. एक TBST समाधान तीन बार के साथ स्ट्रिप्स कुल्ला, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए हर बार ।
  8. TBST समाधान महाप्राण । कमरे के तापमान पर ४० मिनट के लिए एक माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ स्ट्रिप्स मशीन ।
  9. एक TBST समाधान तीन बार के साथ स्ट्रिप्स कुल्ला, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए हर बार ।
  10. समान रूप से स्ट्रिप्स की सतह के लिए मिश्रित ECL द्रव लागू होते हैं । एक स्वत: chemiluminescence इमेजिंग प्रणाली में स्ट्रिप्स बेनकाब ( सामग्री की तालिकादेखें).
    नोट: आम तौर पर, ECL द्रव के ३०० µ एल एक झिल्ली के लिए पर्याप्त है । झिल्ली जोखिम के दौरान नम रखा जाना चाहिए । एक्सपोज़र समय स्वचालित रूप से इमेजिंग सिस्टम द्वारा परिकलित की जाती है ।
  11. ImageJ (स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों) या एक और छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर अर्द्ध मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए का उपयोग कर एक ग्रेस्केल विश्लेषण करो ।

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Representative Results

जांच करने के लिए कि क्या कोई Aβ1-42 मोनोमर तैयार करने के बाद एक Aβ1-42 oligomer प्रपत्र कर सकते हैं, उनि विश्लेषण किया गया था । नहीं दिखाई समुच्चय HFIP में मनाया गया-भंग Aβ1-42 मोनोमर नमूना (चित्रा 1ए) । इसके अलावा, लगभग 10-80 एनएम के व्यासके साथ मुख्य रूप से गोलाकार समुच्चयAβ 1-42 नमूने में मिलाते हुए ४८ एच के बाद मनाया गया, सुझाव है किAβ 1-42 रूपों oligomers तैयारी के बाद(चित्रा 1 बी) ।

Figure 1
चित्र 1 . उनि analysis च्या Aβ1-42 मोनोमर आणि Aβ1-42 oligomer भरपूर नमूने आहेत. इस प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार HFIP-भंग Aβ1-42 मोनोमर नमूना (10 µ मीटर) और Aβ1-42 oligomer युक्त नमूना (10 µ मी) उनि द्वारा जांच की गई । स्केल बार = २०० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

साथ ही, डॉट सोख्ता विश्लेषण नमूने में Aβ1-42 oligomer की सापेक्ष मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया गया था । एक A11 एंटीबॉडी विरोधी समानांतर β-शीट संरचनाओं के साथ विषाक्त Aβ oligomer के एक सबसेट के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है । एक ओसी एंटीबॉडी समानांतर में-रजिस्टर β-शीट संरचनाओं के साथ fibrillar समुच्चय के साथ प्रतिक्रिया करता है । इन एंटीबॉडी का उपयोग करके, हम प्रदर्शन किया है कि A11-positive Aβ1-42 oligomers, लेकिन नहीं ओसी-पॉजिटिव Aβ1-42 fibrillar समुच्चय, मुख्य रूप से Aβ में दिखाई दिया1-42 oligomer-रिच नमूनों कि प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया गया ( चित्र 2) । एंटी-Aβ एंटीबॉडी 6E10 का उपयोग करके, हमने देखा कि Aβ1-42 पेप्टाइड्स की संख्या HFIP-भंग Aβ1-42 मोनोमर नमूना और Aβ1-42 oligomer-रिच नमूना (चित्र 2) में समान था ।

Figure 2
चित्र 2 . डॉट सोख्ता एनालिसिस ऑफ Aβ1-42 मोनोमर और Aβ1-42 oligomer के भरपूर नमूने हैं । (क) HFIP-भंग Aβ1-42 मोनोमर नमूना (१० µ मी) और Aβ1-42 oligomer युक्त नमूना (१० µ मी) इस प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया गया डॉट सोख्ता विश्लेषण द्वारा oligomer एंटीबॉडी A11, विरोधी fibrillar का उपयोग करके जांच की गई oligomer एंटीबॉडी ओसी, व विरोधी Aβ एंटीबॉडी 6E10. (B - D) ग्रेस्केल का अर्द्ध-मात्रात्मक विश्लेषण ImageJ द्वारा किया गया था । डेटा, नियंत्रण के एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त, 3 स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब ± SEM थे; *** p < 0.001 vs the Aβ1-42 मोनोमर समूह (ANOVA और t-test) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

आगे की जांच करने के लिए अगर इस प्रोटोकॉल Aβ1-42 oligomers, curcumin, एक ज्ञात Aβ oligomer अवरोध करनेवाला, इस्तेमाल किया गया था के अवरोधकों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमने पाया है कि एक सह curcumin के साथ मशीन (०.१-1 µ एम) काफी A11 के सापेक्ष मात्रा कम-सकारात्मक Aβ1-42 oligomer, के रूप में A11 सह में curcumin की कमी हुई धुंधला द्वारा सबूत के रूप में Aβ------- सामांय मशीन Aβ1-42 oligomer-रिच नमूना (चित्रा 3) । इसी हालत में, curcumin (०.१-1 µ m) Aβ1-42 पेप्टाइड्स की संख्या में परिवर्तन नहीं किया, 6E10 के दाग के रूप में भी सभी नमूनों में था (चित्रा 3).

Figure 3
चित्र 3 . curcumin की सह-मशीन Aβ1-42 oligomer-रिच नमूनों का डॉट सोख्ता विश्लेषण । (A) HFIP-भंग Aβ1-42 मोनोमर (10 µ m) इस प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया गया था और साथ या बिना curcumin (0, ०.१, 1 µ m) के लिए मिलाते हुए के तहत मशीन ४८ एच. नमूनों की जांच A11 और 6E10 का प्रयोग करते हुए एक डॉट सोख्ता विश्लेषण द्वारा की गई । (B) अर्द्ध-मात्रात्मक ग्रेस्केल विश्लेषण ImageJ द्वारा किया गया था । डेटा, नियंत्रण के एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त, 3 स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब ± SEM थे; *** p < 0.001 vs the Aβ1-42 अलोन समूह (ANOVA and Tukey ' s test). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

oligomer गठन की पुष्टि करने के लिए, हम भी एक गैर denaturing जेल का इस्तेमाल किया है । हमने पाया है कि oligomer (> 4 केडी) Aβ1-42 oligomer-रिच नमूना में मौजूद था, जबकि सबसे मोनोमर (4 केडी) Aβ1-42 मोनोमर नमूना (आंकड़ा एस1) में पाया गया था ।

हम supernatant और Aβ1-42 नमूने की गोली में Aβ समुच्चय की जांच की है । ४८ के बाद मशीन के एच, Aβ1-42 oligomer लेकिन नहीं Aβ1-42 fibrillar समुच्चय के रूप में supernatant, ओसी, और A11 एंटीबॉडी (आंकड़ा S2) द्वारा निर्धारित नमूने के 6E10 में पाए गए. इसी हालत में Aβ1-42 fibrillar समुच्चय लेकिन नहीं Aβ1-42 oligomers नमूना (चित्र S2) की गोली में पाया गया ।

हम भी curcumin-इलाज Aβ1-42 नमूना का उपयोग करके उनि की आकृति विज्ञान की जांच की है । curcumin-इलाज नमूना कुछ गोलाकार धब्बे होते हैं, सुझाव है कि curcumin Aβ1-42 oligomer (चित्रा S3) की मात्रा को कम कर सकता है.

Supplemental Figure 1
चित्र एस एक . नॉन-denaturing जेल ट्रो एनालिसिस ऑफ aβ 1-42 मोनोमर और aβ 1-42 oligomer-रिच सैंपल । इस HFIP-भंग Aβ 1-42 मोनोमर नमूना (10 µ मीटर) और Aβ 1-42 oligomer-रिच नमूना (5 µ मीटर, कम; 10 µ मीटर, उच्च) इस प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार विरोधी denaturing ट्रो Aβ का उपयोग करते हुए गैर-एंटीबॉडी जेल 6E10 द्वारा जांच की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplemental Figure 2
चित्र S2 . aβ 1-42 समाधान के supernatant में मुख्यतः oligomer हैं, लेकिन fibrillar समुच्चय नहीं. एक aβ 1-42 समाधान (५० µ एल), ४८ एच के लिए मिलाते के बाद, 10 मिनट के लिए १८,००० x g पर केंद्रापसारक था । supernatant एकत्र किया गया था और गोली फिर से डबल आसुत जल के ८५० µ एल में भंग किया गया था । supernatant और गोली आगे एक डॉट दाग परख द्वारा जांच की गई OC, A11, और 6E10 एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplemental Figure 3
चित्र S3 . उनि विश्लेषण के curcumin सह-मशीन aβ 1-42 oligomer-रिच नमूनों । HFIP-भंग aβ 1-42 मोनोमर (10 µ एम) इस प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया गया था और ४८ एच के लिए मिलाते हुए के तहत 1 µ मीटर curcumin के साथ मशीन । उनि द्वारा नमूनों की जांच की गई । स्केल बार = १०० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम Aβ1-42 oligomer युक्त नमूने तैयार करने के लिए एक विधि की सूचना दी है, और एक डॉट oligomer विश्लेषण द्वारा A11-सकारात्मक Aβ1-42 सोख्ता की मात्रा का विश्लेषण करने के लिए. हालांकि Aβ1-42 oligomer-रिच नमूनों की तैयारी के लिए हमारे तरीके काफी सरल, विश्वसनीय हैं, और reproducible, अभी भी कुछ बिंदुओं पर गौर किया जा करने के लिए कर रहे हैं । सबसे पहले, HFIP सिंथेटिक Aβ1-42 पेप्टाइड को भंग करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक एग्रीगेट Aβ1-42 पेप्टाइड HFIP समाधान में मोनोमर में जुदा कर सकते हैं । हालांकि, HFIP volatilize करने के लिए आसान है, और HFIP की चिपचिपाहट बहुत कम है । इसलिए, Aβ1-42 पेप्टाइड HFIP में भंग किया जाना चाहिए और HFIP समाधान aliquoted कार्रवाई के दौरान HFIP की संभावित हानि को कम करने के लिए संभव के रूप में तेजी के रूप में होना चाहिए । इसके अलावा, इस प्रक्रिया में सटीक pipetting सुनिश्चित करने के लिए पिपेट टिप्स को काटना चाहिए । दूसरे, उच्च शुद्धता नाइट्रोजन गैस के समाधान से HFIP वाष्पित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस प्रक्रिया के दौरान, Aβ1-42 समाधान समय-समय पर हिल जाना चाहिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि HFIP पूरी तरह काफूर हो सकता है । इस प्रक्रिया के अंत में, HPIF की गंध समाधान में पता नहीं होना चाहिए । आम तौर पर, वाष्पीकरण के 30 मिनट से कम ०.१% करने के लिए HFIP की एकाग्रता कम कर देता है । इस एकाग्रता में, HFIP Aβ1-42के अनुरूप संक्रमण को बदलने के लिए नहीं की सूचना दी है7. तीसरा, जब Aβ1-42 oligomer युक्त नमूनों की तैयारी, तरल की न्यूनतम मात्रा से अधिक होना चाहिए ५० µ l अन्यथा, नमूनों छोटी बूंदों में बिखराव की संभावना है, ट्यूबों की दीवार के लिए संलग्न. इसके अलावा, Aβ1-42 मोनोमर एक पूरी तरह से मिश्रण के बिना oligomer फार्म नहीं कर सकते ।

यहां वर्णित के रूप में एक Aβ1-42 oligomer-रिच नमूना तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल अंय समूहों में प्रयुक्त कुछ प्रोटोकॉल से थोड़ा अलग है । उदाहरण के लिए, कुछ अध्ययनों में, HFIP समाधान8,9में दोहरे आसुत जल जोड़ने से पहले काफूर हो गया था । हालांकि, ऐसी हालत में, Aβ1-42 पेप्टाइड छोटी चादरें, जो समाधान में भंग करने के लिए कड़ी मेहनत कर रहे है फार्म कर सकते हैं । इसलिए, हम डबल आसुत पानी जोड़ने के पहले चुना है, और फिर नाइट्रोजन गैस से HFIP लुप्त हो जाना । सबसे महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल द्वारा तैयार समुच्चय के oligomeric आकार की पुष्टि कर रहे है उनि । इसके अलावा, Aβ1-42 oligomer इस प्रोटोकॉल द्वारा गठित एसएच SY5Y कोशिकाओं और प्राथमिक हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस में neurotoxicity प्रेरित और चूहों के हिप्पोकैम्पस क्षेत्र में इंजेक्शन के बाद संज्ञानात्मक प्रदर्शन को कम कर सकता है, सुझाव है कि Aβ1-42 oligomer तैयार काफी विषाक्त5,10है । इन परिणामों के पिछले अध्ययन के साथ संगत कर रहे हैं11.

एक डॉट सोख्ता विश्लेषण द्वारा A11-positive Aβ1-42 oligomer का मूल्यांकन करने के लिए यह प्रोटोकॉल अभी भी कुछ कमियों है । सबसे पहले, मैनुअल नमूना का उपयोग करके, यह आकार में बूंदों वर्दी रखने के लिए आसान नहीं है । दूसरे, एक डॉट सोख्ता विश्लेषण एक अर्द्ध मात्रात्मक लेकिन नहीं मात्रात्मक विधि है A11 की मात्रा को मापने के सकारात्मक Aβ1-42 oligomer, सुझाव है कि एलिसा जैसे अंय तरीकों, की आवश्यकता है अगर Aβ की मात्रा का सही मूल्यांकन1-42 oligomer आवश्यक आहे. तीसरे, कुछ दवाओं एंटीबॉडी को प्रतिक्रिया, झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए अग्रणी हो सकता है ।

सामांय में, हमने A11-धनात्मक Aβ1-42 oligomer युक्त नमूनों को तैयार करने के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्रदान किया है और एक डॉट Aβ परख का उपयोग करके A11-धनात्मक oligomer1-42 सोख्ता की मात्रा का विश्लेषण करने के लिए । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, संभावित Aβ1-42 विज्ञापन का इलाज करने की क्षमता के साथ oligomer अवरोधकों प्रभावी ढंग से दिखलाई जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (U1503223, ८१६७३४०७, २१४७५१३१), झेजियांग प्रांत (2016C37110), Ningbo अंतर्राष्ट्रीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी के nonprofit प्रौद्योगिकी पर एप्लाइड अनुसंधान परियोजना से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया सहयोग परियोजना (2014D10019), जीवन विज्ञान और स्वास्थ्य के Ningbo नगर नवाचार टीम (2015C110026), Ningbo विज्ञान और तकनीक परियोजना आम धन (2017C50042) के लिए, ली डाक राशि यिप यिो चिन केनेथ ली समुद्री जैव भेषज विकास निधि, और Ningbo विश्वविद्यालय में वोंग Magna कोष के. सी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) Abcam GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) Cell Signalling Technology 2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) Millipore AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)  Beyotime A0208
Aβ1-42 GL Biochem 52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol Aladdin I1523078
Curcumin Sigma C1386
Albumin Bovine V Solarbio A8020
Sodium chloride Sangon Biotech D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate SCR 30166428
TRIS Solarbio T8060
Glycine Solarbio G8200
 Dimethyl sulfoxide Solarbio D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker Beyotime P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE Genshare JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane Pall Corporation T50189
Methanol SCR 10014118
Ethanol SCR 10009218
Super low range protein Marker Solarbio PR1300
Transfer Membranes Immobilon-PSQ ISEQ00010
BeyoECL Star Beyotime P0018A
Commassie Blue Fast staining solution Beyotime P0017
All - automatic chemiluminescence imaging system Tanon Tanon 5200
Image J National Institutes of Health
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References

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जैव रसायन अंक १३५ अल्जाइमर रोग Aβ oligomer डॉट सोख्ता विश्लेषण पारेषण इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी curcumin
A11-positive β-amyloid Oligomer तयारी आणि असेसमेंट प्रयोग डॉट सोख्ता विश्लेषण
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Chunhui, H., Dilin, X., Ke, Z., Jieyi, S., Sicheng, Y., Dapeng, W., Qinwen, W., Wei, C. A11-positive β-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57592, doi:10.3791/57592 (2018).

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