Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Enkelt celle Multiplex omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons etter Patch-klemme

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57627
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver avgjørende skritt og forholdsregler må utføre enkeltcelle multiplex omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons etter oppdateringen-klemme. Denne teknikken er en enkel og effektiv metode for å analysere uttrykk profilen til et forhåndsbestemt sett av gener fra en enkeltcelle preget av oppdateringen-klemme innspillinger.

Abstract

Hjernebarken består tallrike celletyper viser ulike morfologiske, fysiologiske og molekylære funksjoner. Dette mangfoldet vanskeliggjør enkel identifisering og karakterisering av disse celletyper, forutsetninger for å studere sine bestemte funksjoner. Denne artikkelen beskriver multiplex enkeltcelle omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) protokoll, som gjør, etter oppdateringen-klemme i skiver, å oppdage samtidig uttrykket av gener i en enkelt celle. Denne enkle metoden kan gjennomføres med morfologiske karakterisering og gjelder vidt bestemme fenotypiske trekk av ulike celletyper og deres mobilnettet miljø, som i blodkar. Prinsippet om denne protokollen er å spille inn en celle med patch-klemme teknikken, å høste og reversere transkribere cytoplasmatiske innholdet, og for å oppdage kvalitativt uttrykk for et forhåndsdefinert sett av gener av multiplex PCR. Det krever en forsiktig design av PCR primere og intracellulær patch-klemme løsningen kompatibel med RT PCR. For å sikre en selektiv og pålitelig transkripsjon krever oppdagelsen, denne teknikken også egnede kontroller fra cytoplasma høsting forsterkning trinn. Selv om forholdsregler diskutert her må følges strengt, kan nesten alle elektrofysiologiske laboratorium bruke multiplex enkeltcelle RT PCR teknikk.

Introduction

Hjernebarken består tallrike celletyper involvert i ulike fysiologiske prosesser. Deres identifikasjon og karakterisering, en forutsetning for forståelsen av deres bestemte funksjoner, kan være svært utfordrende gitt store morfologiske, fysiologiske og molekylære mangfoldet som kjennetegner kortikale cellen typer1 ,2,3,4.

Encellede multiplex RT PCR er basert på kombinasjonen av oppdateringen-klemme og RT PCR teknikker. Det kan sonde samtidig uttrykket av mer enn 30 forhåndsdefinerte gener i electrophysiologically identifiserte celler5. Inkludering av en neuronal tracer i innspillingen pipette videre lar morfologiske karakterisering av innspilte cellene etter histochemical åpenbaring6,7,8,9, 10. det er en svært nyttig teknikk for klassifisering av neuronal typer basert på multivariat analyse av deres fenotypiske trekk5,9,10,11,12 ,13,14. Enkelt celle multiplex RT PCR passer også karakterisering av ikke-neuronal celler som astrocyttene15,16,17, og kan brukes nesten hver hjernen strukturen18, 19,20,21,22,23 og celle type, forutsatt at de kan bli registrert i hele celle konfigurasjon.

Denne teknikken er veldig praktisk for identifikasjon av mobilnettet kilder og/eller mål overføring systemer7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, spesielt når spesifikke antistoffer mangler. Det avhenger av oppdateringen-klemme opptak fra visuelt identifiserte celler29og dermed også lar målretting av celler i en bestemt mobile miljøet8,15,16. Videre siden cytoarchitecture av hjernevev er bevart i hjernen skiver, gir dette også studier av anatomisk relasjonene preget cellene med neuronal og ikke-neuronal elements7,8 , 18.

Siden denne teknikken er begrenset av mengden høstet cytoplasma og effektiviteten av RT, kan gjenkjenning av mRNA uttrykt på antall lave Kopier være vanskelig. Selv om andre tilnærminger basert på RNaseq teknologi tillater for å analysere det hele transcriptome enkeltceller3,4,30,31, trenger de høy gjennomstrømming dyre sequencere ikke nødvendigvis tilgjengelig for hvert laboratorium. Siden enkeltcelle multiplex RT PCR teknikken bruker end-point PCR, krever det bare tilgjengelig thermocyclers. Den lett kan utvikles i laboratorier utstyrt med elektrofysiologiske set-ups krever ikke dyrt utstyr. Det kan gi, innen en dag, en kvalitativ analyse av uttrykk for et forhåndsdefinert sett av gener. Dermed gir denne tilnærmingen lett tilgjengelighet til molekylær karakterisering av enkeltceller på en rask måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer som bruker dyr ble utført i strengt samsvar med franske regler (Code Rural R214/87 til R214/130) og likedannet etiske retningslinjer både det europeiske økonomiske fellesskapet (86/609/EEC) og det franske nasjonale Charter på etikk dyr eksperimentering. Alle protokoller var godkjent av Charles Darwin etikk og sendt til franske departementet for utdanning og forskning (godkjenning 2015 061011367540). IBPS dyr anlegget er akkreditert av franske myndigheter (A75-05-24).

1. foreløpige hensyn

Merk: For å unngå forurensing, overholde følgende anbefalinger før foretaket enkeltcelle RT PCR etter oppdateringen-klemme.

  1. Ikke bruk plasmider inneholder gener av interesse i laboratoriet som de er en potensiell kilde til forurensning.
  2. Reservere en lab-benken fra gel geleelektroforese rommet for å forberede PCRene.
  3. Vie et sett med Pipetter og aerosol motstandsdyktig filter tips å manipulere DNA og RNA i konsentrasjoner lavere enn 1 ng/µL. Aldri bruke disse til å analysere PCR produkter.
  4. Alltid bruker RNase - og DNase-frie produkter og bruke hansker.
  5. Bruk dedikert kjemikalier for å forberede interne patch-klemme løsninger. Bruk en slikkepott, men heller veier papir for å veie pulver.
  6. Bruk en dedikert pH elektrode og pH standard løsninger, som de kan være en kilde til forurensing (f.eksRNase).
  7. Lagre Borosilikatglass kapillærene; 20 µL lang, fin og fleksibel tips; 20 µL brønnene; en hjemmelaget expeller (patch-klemme pipette holderen knyttet til 10 mL sprøyte); 500 µL PCR rør; 10 µL aerosol motstandsdyktig filter tips; og tynn markørpenner i en dedikert (figur 1).

2. primer Design

Merk: Multiplex RT PCR, avhengig av to forsterkning trinn. Under den første PCR, er alle genene severdigheter co forsterket ved å blande sammen alle PCR primere. For å oppdage pålitelig transkripsjoner fra enkeltceller, er det viktig å utforme effektive og selektiv PCR primere. Bruk av nestede (intern) primere for de andre rundene av PCR forbedrer både spesifisitet og effektiviteten av forsterkning.

  1. Hente kuratert mRNA sekvenser av gener av interesse i NCBI referansedatabase sekvens32 , samt de av deres familien (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. Angi navnet på gene(s) og arter rundt som en spørring og klikk på Hentet relevante sekvensen.
    2. For å begrense analysen koding sekvensen av gene(s), klikk på Send til (øverst til høyre), og velg koding sekvenser og FASTA Nucleotide som format. Klikk på Opprette filen og lagre FASTA sekvensen bruker filtypen "NT".
  2. Bruk MACAW programvare33 (flere justering konstruksjon & analyse Workbench) eller en annen flere justering programvare for å bestemme regionene homologi.
    1. Klikk på arkiv | Nytt prosjekt... og velg DNA som sekvens. For å importere gensekvenser, velg rekkefølge | Importere sekvens... og belaste en "NT" fil. Gjenta dette for alle relaterte sekvenser.
    2. Klikk og dra alle sekvenser i vinduet skjematisk å velge hele sekvensene.
    3. Søke regionene homologi ved å velge justering | Søk etter blokker... (CTRL + S). Velg segmentet par overlapper Søkemetode. Justere den Pairwise score cutoff til en relativt høy verdi (f.eks1000) og Min. seqs. per blokk til antall sekvenser Juster, og klikk på begynne.
    4. I vinduet vises Søkeresultatet Velg Oppslag med høyest MP-poengsum og klikk på linken. Hvis ingen resultater, redusere Pairwise score cut-off og/eller Min. seqs. per blokk.
    5. For å lette visualisering av homologe regioner, velg justering | Skyggelegging | Mener score.
    6. Velg Ordne deler av sekvenser og gjenta trinn 2.2.3–2.2.4 for å finne potensielt andre regioner av homologi med lavere MP-score.
    7. For å få de mest spesifikke primerne, Velg områdene med den minste sekvens homologi.
  3. Gjenta trinn 2.2.1–2.2.6 hente sekvenser av alle skjøte-varianter. Velg sine vanlige områder for en total gjenkjenning. Vurder alternative kassetter for dedikert skjøte varianter analyser20,34,35,36.
  4. Juster mRNA sekvenser på dyremodell genomet bruker BLAST37 genomer (grunnleggende lokale justering søkeverktøyet) til å bestemme intron-ekson strukturen av genene (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. Velg BLAST musen genomet ved å klikke på musen og sende Hentet FASTA sekvensen i delen Angi spørringen sekvens . I Programvalg, velg Optimaliser for ligner sekvenser (megablast), klikk på knappen BLAST .
    2. I Beskrivelse -delen velger du justering med høyeste identitet (opptil 100%). Kontroller at det tilsvarer genet av interesse som angitt i funksjoner i delen justeringer .
    3. Sortere justeringen av spørringen startposisjon i samme avsnitt å få exons rekke koding sekvensen. Merk stillingene som start- og alle treff som omtrent tilsvarer plasseringen av introns på spørringen sekvensen (figur 2A).
  5. Velg to forskjellige exons for fornuft og antisense primerne å skille lett cDNA fra genomisk DNA (gDNA) forsterkning basert på et størrelse vilkår (figur 2).
    Merk: Forsterkningen på gDNA kan oppstå på en lav frekvens når kjernen er høstet med cytoplasma. Derfor er det viktig å designe intron overspanning primer par (figur 2A). Ved intron mindre gener er innsamling av kjernen problematisk siden det kan føre til potensielt confounding resultater. For å løse dette problemet, omfatte et sett med primere å forsterke en intronic sekvens å undersøke etter gDNA25. Hvis kontrollen genomisk er positivt, må resultatene for alle intron mindre gener forkastes.
  6. For å oppnå en effektiv forsterkning, Velg primere generere amplicons med lengde ideelt består mellom 200 og 400 base parene (figur 2).
  7. For å forsterke samtidig ulike cDNAs under multiplex PCR trinnet, utforme primere mellom 18 og 24 nukleotider og en Smeltetemperaturen (Tm) mellom 55 og 60 ° C.
  8. For å minimere dannelse av sekundær strukturer, som reduserer forsterkningen avkastningen, Velg følelse og anti-følelse primere med minimal hårnål og dupleks lengder (figur 2B).
  9. Utforme interne primere på samme måte (trinn 2.5-2.8).
  10. Kontroller spesifisiteten av PCR primere ved å justere primerne referanse RNA sekvens databasen av organismen rundt med en nukleotid BLAST.
    1. BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), klikk på nukleotid BLAST. Lim inn sekvensen av en primer i Angi spørringen sekvens.
    2. I delen Velg søk angitt Klikk på andre (nr etc.), velg Referanse RNA sekvenser (refseq_rna) i databasealternativet og angi organismen (f.eks Mus musculus (taxid:10090) ) å begrense analyse til den ønskede arten.
    3. Velg Optimaliser for noe lignende sekvenser (blastn)i Favorittprogram . Redusere ordet størrelsen til 7 for å øke sjansen til å få treff i delen algoritmen parametere .
  11. Utforme selektiv primere, holde bare de som har minst 3 uoverensstemmelser med uønskede cDNAs når det er mulig.
  12. Bestill avsalte primere på en relativt høy konsentrasjon (f.eks, 200 µM) å sikre at alle eksterne primere kan blandes sammen i en siste konsentrasjon på 1 µM.

3. forberedelse RT reagenser

  1. 5 x RT-mix: forberede i RNase-fritt vann 400 µL av arbeider RT blanding løsning (5 x) som inneholder tilfeldig primere på 25 µM og dNTPs på 2,5 hver. Lagre denne arbeider blandingen 20 µL dele i 500 µL rør.
  2. 20 x Dithiothreitol (DTT): forberede 1 mL av 0,2 M DTT i RNase uten vann og lagre den med 50 µL dele.
  3. Lagre 2500 U av RNase hemmer (40 U/µL) og 10.000 U av revers transkriptase (RTase, 200 U/µL) 5 µL dele.
  4. For å sikre en optimal kvalitet RT reagenser, lagre dele på-80 ° C. Bruke dem for opptil 10 celler og bare for en dag.

4. PCR validering

  1. Klargjør cDNAs ved å gjøre en omvendt transkripsjon på en relativt stor mengde totale RNA (vanligvis 1 µg) utdraget38 fra strukturen av interesse.
    1. Ikke bruk Pipetter dedikert til enkelt RT PCR-cellen for disse foreløpige skritt, men bruker de RNase-ledig pipetter. Fortynne totale RNA ned 1 µg/µL.
    2. I en 500 µL PCR tube, Legg 1 µL av utvannet totalt og 8 µL RNase uten vann. Denature på 95 ° C i 1 min og kjøle ned røret på is.
    3. 4 µL RT 5 x bufferen leveres av produsenten, 4 µL av RT blanding løsning, 1 µL av RTase, 1 µL av RNase hemmer og 1 µL av 200 mM DTT (se avsnitt 3).
    4. Sveip røret spinn og ruge over natten på 37 ° C.
    5. Lagre cDNAs ved-80 ° C i opptil flere år. Klargjør en aliquot av cDNAs utvannet til 1 ng/µL av totalt RNAs ekvivalenter.
  2. Bland og fortynn hver primer par på 1 µM med Pipetter dedikert til enkeltcelle RT PCR. Bruk 20 µL av hver primer for 100 µL PCRene.
  3. På is, forberede for hvert primer par en premix inneholder: vann (QS, 80 µL), 10 µL av 10 X buffer og 1 µL 100 x dNTPs (50 µM hver), 500-1000 pg av cDNA utvannet på 1 ng/µL 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) av Taq utvalg.
  4. Bruk PCR-rør som passer tett brønnene av PCR maskinen for en optimal temperaturkontroll. Legge 2 dråper (~ 100 µL) av mineralolje til premix uten å berøre veggen eller hetten PCR røret.
  5. For å minimere dannelsen av primer-dimers, utføre en varm start ved å plassere PCR rør i thermocycler forvarmet til 95 ° C. Etter 30 s, raskt utvise 20 µL av primer miksen på oljen.
  6. Etter 3 min på 95 ° C, kjøre 40 sykluser (95 ° C, 30 s, 60 ° C, 30 s, 72 ° C, 35 s) etterfulgt av en siste forlengelse trinn ved 72 ° C i 5 minutter.
  7. Analysere 10 µL av hver PCR produkter av agarose gel geleelektroforese (2%, vekt/volum)39. Hvis noen PCR-produkter ikke har den forventede størrelsen, re-design andre primere (se punkt 2).
    Forsiktig: Ethidium bromide er en intercalating kjemisk som kan indusere DNA mutasjoner. Kontakt lokale sikkerhet kontoret før du bruker den. Alltid bruk hansker når du manipulerer den. Bruk en kommersielt tilgjengelig løsning ethidium bromide (10 mg/mL) løsning i stedet for pulver for å minimere risikoen for innånding. Tilsvarende kan UV lys være skadelig, så pass på å bruke UV beskyttelse vernebriller eller en maske. Trekke skitnet gels, tips, hansker og buffer i beholdere dedikert til ethidium avfall.
  8. Når alle primer par har validert individuelt, teste multiplex protokollen (Figur 3).
    1. Bland og fortynne alle eksterne primere sammen på 1 µM. Store multiplex primerne bland på-20 ° C i opptil flere uker.
    2. På is, forberede en premix inneholder: vann (QS, 80 µL), 10 µL av 10 X buffer, 1 µL av 100 x dNTPs (50 µM hver), 500-1000 pg av cDNAs utvannet 1 ng/µL og 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) av Taq utvalg.
    3. Sveip PCR røret, spinn, og legge til to dråper (~ 100 µL) mineralolje.
    4. Utfør en varm start som beskrevet i trinn 4,5 med 20 µL av multiplex primer. Etter 3 min på 95 ° C, kjøre 20 PCR sykluser identisk med de av trinn 4.6.
    5. Forberede en rekke PCR rør identisk med antall gener analysere. Forberede en premix som trinn 4.8.2, men bruker 1 µL av første PCR produktet per genet som mal. Justere alle volum av antall gener å analysere og vurdere å bruke 10% ekstra volum for å kompensere for pipettering feil.
    6. Riste forsiktig, spinne røret, sende 80 µL av premix i hver PCR-rør og legge to dråper (~ 100 µL) mineralolje per tube uten å berøre veggen eller hetten av rørene.
    7. Utføre en varm starte (se trinn 4.5) av utvise 20 µL av interne primer forberedt i trinn 4.2. Kjøre 35 PCR sykluser identisk trinn 4.6.
    8. Analysere andre PCR produktene av agarose gel geleelektroforese. Kontroller at alle andre PCR genererer en amplicon av forventet størrelse. Ved ineffektiv eller uspesifikke amplifications, re-design nye primere (trinn 2.5-2.12) og validere dem (trinn 4.2-4.8).

5. forberedelse og validering av intracellulær Patch-klemme løsning

Merk: Følgende protokollen beskriver utarbeidelse og validering av en K+/gluconate basert intern løsning, men nesten alle typer patch-klemme løsning kan brukes så lenge det ikke hemme effektiviteten av RT-PCR. Bruk hansken er obligatorisk å skaffe en RNase-gratis intern løsning.

  1. For 60 mL av interne patch-klemme innspillingen løsning, forberede bevisst 10 mL av 0.1 M KOH.
  2. Oppløse 11.4 mg EGTA (0,5 mM endelige) i 0.9 mL 0.1 m KOH.
  3. Legg til 40 mL RNase gratis vann og oppløse 2,02 g K-gluconate (144 mM endelige), 143 mg HEPES (10 mM endelige) og 180 µL av 1 M MgCl2 (3 mM endelige).
  4. Justere pH til 7.2 ved å legge til ~ 6 mL 0.1 M KOH.
  5. Justere osmolaritet til 295 mOsm med ~ 13 mL RNase gratis vann.
  6. Siden den interne løsningen brukes også som en buffer for omvendt transkripsjon, nøye kontrollere Mg2 + konsentrasjon. Kompensere for et lavere Mg2 + konsentrasjon i interne løsningen ved å legge MgCl2 etterpå for å nå en siste konsentrasjon av 2 mM i RT reaksjonen.
  7. Hvis etiketten høstet cellen etter oppdateringen-klemme opptak, legge til 2-5 mg/mL RNase gratis biocytin interne løsningen beskrevet ovenfor (trinn 5.1-5.5).
  8. Filtrere (0.22 µm porestørrelse) interne løsningen og lagre den på-80 ° C som 100-250 µL dele.
  9. For å godkjenne bruk av interne løsningen for enkeltceller RT PCR, Legg til 0,5 µL av totalt RNAs utvannet på 1 ng/µL til 6 µL av oppdateringen-klemme løsning og la den på benken i ca 30 min.
  10. 2 µL brønnene, legge 2 µL av 5 x RT-mix, 0,5 µL av 20 x DDT, 0,5 µL RNase hemmer og 0,5 µL RTase, og ruge over natten på 37 ° C.
  11. Spinne røret. Tilsett vann (QS, 80 µL), 10 µL av 10 X buffer og 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) av Taq utvalg på is.
  12. Utføre 40 sykluser av PCR med en validert primere (trinn 4.4-4.6).
  13. Analysere PCR produktene av agarose gel geleelektroforese (se trinn 4.7) og kontrollerer at de har den forventede størrelsen.
    Merk: Utelate den 0,5 µL av totalt og erstatte den med 0,5 µL RNase-fritt vann vil sikre at interne løsningen er gratis RNA og/eller DNA forurensing.

6. akutt skive forberedelse

Merk: Denne protokollen beskriver kutting fremgangsmåten for juvenile (dvs.mindre enn 28 postnatal dager) mannlige og kvinnelige mus. Andre kutte løsninger, som sukrose-basert kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) er også brukbar40.

  1. Forberede 2 L aCSF som inneholder (i mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 glukose og 15 sukrose. For å redusere glutamatergic aktivitet under skive forberedelse, forberede en kutte løsning ved å legge til 1 mM kynurenic syre.
  2. Før kutting, forberede en disseksjon kit som inneholder kirurgisk saks, fine iris saks, to spatler, tang, en plate papirfilter og cyanoacrylate lim.
  3. Bruke iskald kutte løsning mettet med O2/CO2 (95% / 5%) og avkjøles av cutting kammeret på 20 ° C.
  4. Bedøve musen med en liten papirhåndkle fuktet med isoflurane. Etter ~ 2 min, sørg for at musen er under dyp anestesi ved å godkjenne fravær av svar til pote knipe.
  5. Raskt halshugge musen. Fjerne hodebunnen og åpne skallen. Ekstra hjernen nøye og legg den i et lite beger fylt med iskald (~ 4 ° C) kutte løsning oksygenert med O2/CO2.
  6. Fjern kutte kammeret fra 20 ° C-forhold og fjerne fuktighet med et papirhåndkle.
  7. Nøye analysere hjernen å isolere regionen rundt, lim den på kutte kammeret og legge iskald kutte løsningen oksygenert med O2/CO2.
  8. Kuttet 300 µm tykke skiver med en vibratome. Overføre dem i romtemperatur i en hvile kammer fylt med oksygenrikt kutte løsning og tillate dem å gjenopprette for minst 0,5 h.

7. enkeltcelle RT PCR etter Patch-klemme opptak

  1. Rengjør perfusjon systemet regelmessig med ~ 100 mL av 30% H2O2 løsning og skyll grundig med ~ 500 mL destillert vann å unngå bakterievekst, som det er et oversett RNase forurensning.
  2. Chlorinate filament med en patch pipette fylt med konsentrert blekemiddel daglig høsting. Ikke bruk brønnene fylle oppdateringen pipette, men heller en 20 µL lang, fin, fleksibel tupp knyttet til en 1 mL sprøyte. Deretter skyll det mye med RNase kostnadsfritt vann og tørk den med en gass-støvkost.
  3. Forbered en liten boks med is som inneholder 5 x RT-mix og 20 x DTT dele. Lagre RTase og RNase inhibitor dele på 20 ° C i en Borstemmaskin kjøligere.
  4. Overføre et stykke inn i innspillingen kammeret parfyme på 1-2 mL/min med oksygenrikt aCSF.
  5. Trekk oppdateringen Pipetter (1-2 µm åpne tuppens diameter, 3-5 MΩ) fra Borosilikatglass med hansker og fylle en av dem med 8 μL intern løsning. Husk på at knotter av pipette puller er en kilde til RNase forurensning.
  6. Plass Pipetter i pipette abonnenten mens iført nye hansker og ikke røre filament med fingrene.
  7. Tilnærming oppdateringen pipette med et positivt trykk og utføre hele celle opptak betegner målrettet cellen (Figur 4).
  8. For å bevare mRNAs, begrense tiden i hele celle konfigurasjonen til 20 min41.
  9. Ved slutten av innspillingen, utarbeide en 500 µL PCR rør fylt med 2 µL av 5 x RT Mix og 0,5 µL av 20 x DTT, spinn, og lagre det på isen.
  10. Høste cellen cytoplasma ved å bruke en mild negative trykket (Figur 4). Visuelt kontroll som innholdet i cellen kommer innenfor pipette samtidig opprettholde en tett forsegling.
    1. Unngå så mye som mulig å samle kjernen hvis noen intron mindre gener er vurdert. I slike tilfeller Inkluder alltid et sett med primere å forsterke gDNA til etter genomisk forurensning.
    2. Hvis kjernen kommer nær spissen av pipette, slipp den negative trykket og flytte pipette fra kjernen. Sikre at tett opprettholdes og start for å samle cytoplasma på den nye pipette-plasseringen.
  11. Stopp høsting når ingen mer materiale kommer og/eller før de tapte tett.
  12. Trekke Pipetter forsiktig for å danne en utsiden ut oppdateringen begrense forurensning ved ekstracellulære rusk (Figur 4) og å favorisere nedleggelsen av cellemembranen for påfølgende histochemical analyse.
  13. Vær oppmerksom på at knotter, micromanipulators, tastaturet eller mus er potensielle kilder til RNase forurensning. Hvis de har vært rørt under innspillingen, endre hansker.
  14. Fest Pipetter til expeller og utvise innholdet inn i PCR røret ved å bruke et positivt trykk (figur 1).
  15. Bryte spissen av Pipetter i PCR røret å dens innholdet.
  16. Kort sentrifuge røret, Legg til 0,5 µL av RNase hemmer og 0,5 µL av RTase, bland forsiktig, sentrifuge igjen og ruge over natten på 37 ° C.
  17. Spinn røret og lagre den på-80 ° C i opptil flere måneder før PCR analyse.
  18. Utføre forsterkning steg direkte i røret som inneholder ~ 10 µL av RT produkter ved å legge vann (QS, 80 µL), 10 µL 10 x bufferen og 0,5 µL (2,5 U) av Taq utvalg. Følg deretter instruksjonene som er beskrevet i trinnene 4.8.2–4.8.8.

8. histochemical farging av innspilte cellen (valgfritt)

  1. Etter elektrofysiologiske opptakene, opprettholde sektoren for 20 min i oksygenrikt aCSF tillate spredningen av biocytin i dendrittiske og axonal treet.
  2. Sett stykket i et godt av en 24-vel plate og fikse det overnatting på 4 ° C med 1 mL av 4% paraformaldehyde i 0.1 M fosfatbuffer.
  3. Vask skiver 4 ganger, 5 minutter hver, med 1 mL fosfat Buffered Saline (PBS).
  4. I samme Vel, permeabilize og Mette sektoren under 1 time i rom temperatur med 1 mL av PBS med 0,25% Triton X-100 og 0,2% gelatin fra kaldt vann fisk hud (PBS-GT).
  5. Ruge over natten med en fluorescently merket avidin utvannet 1/400 i 250-500 µL av PBS-GT.
  6. Vask 5 ganger, 5 minutter hver, med 1 mL av PBS og montere skiver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En representant validering av multiplex RT PCR vises i Figur 3. Protokollen ble utformet å undersøke samtidig uttrykket av 12 ulike gener. Vesicula glutamat transporter vGluT1 ble tatt som en positiv til glutamatergic neurons42. GABA syntetisere enzymer (GAD65 og GAD 67), Neuropeptide Y (NPY) og Somatostatin (SOM) ble brukt som markører for GABAergic interneurons3,5,11. Cyclooxygenase-2 enzymet (COX-2) ble brukt som en markør av pyramideformet celle sub-populasjon3,16.

ATP1α1-3 underenheter av Na+/K+ ATPase og Kir6.2 og SUR1 underenheter av ATP-sensitive K+ kanaler ble valgt for å evaluere forholdet mellom neuronal aktivitet og metabolske stater43. Siden Kir6.2 er en intron mindre genet, ble SOM intron inkludert som en genomisk kontroll. Protokollen er testet på 1 ng av omvendt transkribert totale RNA utvunnet fra musen hele hjernen, som omtrent tilsvarer utskrifter av 20 celler44. Multiplex PCR produsert 12 amplicons av forventet størrelse (Figur 3 og tabell 1) demonstrere den sensitivitet og effektiviteten av protokollen. Negativ kontrollen utføres uten RNA produsert ingen amplicon (data ikke vist).

En lag V pyramideformet Nevron ble visuelt identifisert av sin store soma og en fremtredende apikale dendrite (figur 5A, innfelt). Hele cellen opptak avslørt typisk elektrofysiologiske egenskaper for lag V vanlige skyter neurons5,45,46 , spesielt, en lav input motstand, langvarig handling potensialer og uttales spike frekvens tilpasning (figur 5A). Molekylær analyse av denne Nevron avslørt uttrykk for vGluT1 (figur 5B), bekrefter sin glutamatergic fenotypen42,46. Denne Nevron også uttrykt SOM ATP1α1 og 3 underenheter av Na+/K+ ATPase. Biocytin merking av innspilte neurons bekreftet en pyramideformet morfologi (figur 5 d).

Som forventet fra glutamatergic nerveceller, avslørt molekylær analyse av 26 lag V pyramideformet celler uttrykk for VGluT1, men ingen av de to GADs (figur 5C). Markører for interneurons ble sjelden observert5,42,46. COX-2, hovedsakelig uttrykt av lag II-III pyramideformet celler3,16, ble ikke funnet i lag V pyramideformet celler. ATP1α1 og 3 underenheter var ofte observert enn ATP1α2 delenhet3. De Kir6.2 og SUR1 underenheter ble sjelden funnet i lag V pyramidale nevroner, som er i samsvar med deres fortrinnsrett uttrykk i øvre lag3,43. Care ble tatt ikke å høste kjerner, som resulterer i sjeldne gjenkjenning av SOM introno (3 av 26 celler, i.e.12%).

Figure 1
Figur 1: dedikert boksen enkeltcelle RT PCR. Liste over materialer forbeholdt RT PCR etter oppdateringen-klemme. (1) Borosilikatglass kapillærene, (2) 20 µL lange, fine, fleksibel tips, (3) 20 µL brønnene, (4) hjemmelaget expeller, (5) 500 µL PCR rør, (6) 10 µL aerosol motstandsdyktig filter tips og 7 markørpenner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: PCR primer designstrategi. (A) skjematisk fremstilling av koding sekvensen av COX 2 cDNA justert til musen Kromosom 2 sekvensen som inneholder COX 2 genet. Exons representeres av svarte bokser og introns på gDNA av hvite bokser. Merk hull i cDNA tilsvarer intronic sekvenser på gDNA. Representative eksempler på dårlige og gode oligonucleotides vises som røde og grønne pilene, henholdsvis. Høyre- og venstrepiler betegne forover og bakover grunning. (B) sekvenser og andre strukturer i oligonucleotides vises i (A). Venstre og høyre paneler angir hårnål selv-komplementaritet og selv-dimer formasjon, henholdsvis. B1 -oligonucleotide viser begge en sterk hårnål selv-komplementaritet og dimer formasjon mens B2 -oligonucleotide viser bare dimer formasjon. Både B3 og B4 oligonucleotides har ingen hårnål selv-komplementaritet og ingen dimer formasjon; de er intron overspanning (A) har blitt valgt som potensielle PCR primere (se tabell 1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: validering av multiplex PCR. 1 ng av totalt fra musen hele hjernen ble utsatt for en omvendt transkripsjon etterfulgt av to rundene PCR forsterkning. 12 PCR produkter ble løst i separate felt av agarose gel geleelektroforese parallelt med Φx174 fordøyd av HaeIII. Andre PCR produktene hadde størrelser (i bp) spådd av sekvenser: 153 (vGluT1), 248 (GAD65), 255 (GAD67), 181 (COX 2), 220 (NPY), 146 (SOM), 183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2), 128 (ATP1a3), 342 (Kir6.2), 211 (SUR1) og 182 (SOMheltall). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Patch-klemme høsting i hjernen skiver. Når en celle identifiseres visuelt, er innspillingen pipette kontaktet med et positivt trykk for å unngå mobilnettet rusk forurensning på spissen av pipette. Merk smilehull på membranen av denne Nevron. Positivt trykk deretter avbrutt for å danne en celle-vedlagt konfigurasjon med en Gigaohm tett forsegling. Kort suctions brukes for å bytte til hele celle konfigurasjon. På slutten av innspillingen, er cytoplasma høstet ved å bruke en mild negative trykket i pipette samtidig opprettholde tett. Merk svinn av celle kroppen under høsting prosedyren. Innspillingen pipette trekkes deretter forsiktig for å danne en utsiden ut oppdateringen, noe som favoriserer cellemembranen nedleggelse for påfølgende biocytin åpenbaring og bevaring av høstet materiale i oppdateringen pipette. Gjengitt fra Cauli og Lambolez47 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: karakterisering av lag V neocortical pyramideformet celler. (A) membran potensielle svar til en lag V pyramideformet celle indusert av nåværende pulser av 100,-40, -10, + 60, 120 og 500 pA (bunnen spor). Nevron viser en svak potensielle deflection etter første hyperpolarizing reaksjon (øvre spor). Svar på en supraliminal depolarization utladet Nevron langvarig handling potensialer sakte utvikle etter-hyperpolarization (øvre trace). Nær metning, Nevron slippes ut på en lav frekvens og utstilt en uttalt tilpasning (øvre grå trace). Innfelt: infrarøde bilder av innspilte lag V pyramideformet Nevron. Pial er oppover. Skala bar: 20 µm. (B) Multiplex RT PCR analyse avsløre uttrykk for vGluT1, SOM, ATP1α1 og ATP1α3. (C) Gene expression profil i et utvalg av 26 lag V pyramideformet celler. vGluT1 ble uttrykt i alle neurons mens GAD65, GAD67 og COX2 ble aldri funnet. NPY, SOM, Kir6.2, SUR1 og SOMint ble sjelden observert. Pyramideformet celler uttrykt ATP1α3, 1 delenhet i Na+/K+ ATPase og ATP1α2 i mindre grad. (D)-maksimale intensitet projeksjon av AC confocal bilder viser biocytin merking av Nevron registrert i (A). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Gene / GenBank nummer Eksterne primere Størrelse (bp) Intern primere Størrelse (bp)
vGlut1
NM_182993		 Forstand,-113 259 Forstand, -54 153
GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC ATTCGCAGCCAACAGGGTCT
Anti-forstand, 126 Anti-forstand, 79
CCAGCCGACTCCGTTCTAAG TGGCAAGCAGGGTATGTGAC
GAD65
NM_008078		 Forstand, 99 375 Forstand, 219 248
CCAAAAGTTCACGGGCGG CACCTGCGACCAAAAACCCT
Anti-forstand, 454 Anti-forstand, 447
TCCTCCAGATTTTGCGGTTG GATTTTGCGGTTGGTCTGCC
GAD67
NM_008077		 Forstand, 529 598 Forstand, 801 255
TACGGGGTTCGCACAGGTC CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC
Anti-forstand, 1109 Anti-forstand, 1034
CCCAGGCAGCATCCACAT AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC
COX 2
NM_011198		 Forstand, 199 268 Forstand, 265 181
CTGAAGCCCACCCCAAACAC AACAACATCCCCTTCCTGCG
Anti-forstand, 445 Anti-forstand, 426
CCTTATTTCCCTTCACACCCAT TGGGAGTTGGGCAGTCATCT
NPY
NM_023456		 Forstand, 16 69° Forstand, 38 220
CGAATGGGGCTGTGTGGA CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT
Anti-forstand, 286 Anti-forstand, 236
AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA
SOM
NM_009215		 Forstand, 43 208 Forstand, 75 146
ATCGTCCTGGCTTTGGGC GCCCTCGGACCCCAGACT
Anti-forstand, 231 Anti-forstand, 203
GCCTCATCTCGTCCTGCTCA GCAAATCCTCGGGCTCCA
ATP1Α1
NM_144900 		Forstand, 1287 288 Forstand, 1329 183
CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA TAAGCGGGCAGTAGCGGG
Anti-forstand, 1556 Anti-forstand, 1492
CCGTGGAGAAGGATGGAGC AGGTGTTTGGGCTCAGATGC
ATP1Α2
NM_178405		 Forstand, 1392 268 Forstand, 1430 213
AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG AAATCCCCTTCAACTCCACCA
Anti-forstand, 1640 Anti-forstand, 1623
ACAGAAGCCCAGCACTCGTT GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC
ATP1Α3
NM_144921		 Forstand, 127 216 Forstand, 158 128
CGGAAATACAATACTGACTGCGTG TGACACACAGTAAAGCCCAGGA
Anti-forstand, 324 Anti-forstand, 264
GTCATCCTCCGTCCCTGCC CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA
Kir6.2
NM_010602		 Forstand, 306 431 Forstand, 339 342
CGGAGAGGGCACCAATGT CATCCACTCCTTTTCATCTGCC
Anti-forstand, 719 Anti-forstand, 663
CACCCACGCCATTCTCCA TCGGGGCTGGTGGTCTTG
SUR1
NM_011510		 Forstand, 1867 385 Forstand, 2041 211
CAGTGTGCCCCCCGAGAG ATCATCGGAGGCTTCTTCACC
Anti-forstand, 2231 Anti-forstand, 2231
GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG
SOMint
X51468		 Forstand, 8 240 Forstand, 16 182
CTGTCCCCCTTACGAATCCC CTTACGAATCCCCCAGCCTT
Anti-forstand, 228 Anti-forstand, 178
CCAGCACCAGGGATAGAGCC TTGAAAGCCAGGGAGGAACT

Tabell 1. Sekvenser av første og andre PCR primere. Plasseringen av hver PCR primer og sekvensene er gitt fra 5 til 3. Bortsett fra somatostatin intron tilsvarer posisjon 1 den første basen i starten codon av hver genet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Enkelt celle multiplex RT PCR etter oppdateringen-klemme kan samtidig og pålitelig sonde uttrykket av mer enn 30 gener i electrophysiologically identifiserte celler5. Analysere genuttrykk på enkeltcelle nivå krever svært effektiv PCR primere. En av de mest begrensende trinnene er samling av innholdet i cellen. Effektiviteten avhenger av diameteren på oppdateringen pipette spissen, som må være så stor som mulig samtidig som cellestørrelsen. Pipetter med 1-2 µm åpne tips diameter ble påvist for å være egnet for mest neuronal typer. Det er også viktig å sørge for at bare mobilnettet innholdet blir samlet inn, og ikke de omkringliggende vev. Dette oppnås ved å kontrollere electrophysiologically bevaring av en tett forsegling under innhøstingen. Dannelsen av en utsiden ut oppdateringen konfigurasjon under pipette uttak ytterligere beskytter høstet cytoplasma fra mobilnettet rusk. Suksessrate på enkeltcelle multiplex RT PCR avhenger også av mRNAs overflod av undersøkte celle type. For eksempel avkastningen med astrocyttene, som uttrykker mRNAs i relativt små mengder3, er generelt lavere enn med nevroner og dermed krever økende utvalg størrelse15,16. Omvendt transkripsjon, som har en lav effektivitet i rør48, er begrensende reaksjonen av én celle multiplex RT PCR. Det er derfor viktig å bruke topp kvalitet reagenser, lagre dem som dele ved-80 ° C, og bruke dem bare for en dag. Endelig er DNA polymerase aktiviteten til RTase ofte en oversett kilde av primer-dimer formasjon. For å løse dette problemet, er utfører en varm start med primere avgjørende å effektivisere forsterkning. Dette reduserer i tillegg den hemmende effekten av RTase på Taq DNA polymerase aktivitet49.

Enkelt celle multiplex RT PCR teknikken er svært allsidig. Det har vært mye brukt i gnagere10,11,13,19,20,34,50,51,52 ,53,54 men kan tilpasses nesten alle dyremodeller og gener forutsatt at vev og gene sekvenser er tilgjengelige. Ulike patch-klemme løsninger kan brukes så lenge de ikke forstyrrer den RT PCR på cellen gratis analyser. For eksempel er interne løsninger basert på K+ eller Cs+ kasjoner, Cl- eller gluconate vellykket brukt6,36,41,55.

Klassisk falske negative resultater stammer fra RNase forurensning av oppdateringen pipette filament eller interne patch-klemme løsning. Nøye chlorinating filament og validere interne løsningen vanligvis løse dette problemet. Falske negative resultater kan også oppstå når et gen uttrykkes på en lav enkeltcelle nivå, siden bare en del av cytoplasma er høstet. Høsting kvaliteten kan økes ved hjelp av større Pipetter og/eller ved å redusere antall det hele-cellen. Høsting kvalitet kan vurderes ved å inkludere et gen kalt uttrykkes på et lavt nivå i enkeltceller20. Falske positive resultater kan oppstå med bad vev kvalitet, der mengden av forurensende mobilnettet rusk er høy. Teste tilstedeværelsen av rusk gjøres ved å sette inn en patch pipette i stykket uten å utføre noen segl og slippe positiv presset før pipette fjerning. Tilstedeværelsen av amplifiable materialer er deretter undersøkt av multiplex RT PCR42. Silanizing oppdateringen pipette har også brukt til å redusere samlingen ekstracellulære forurensninger56. Enkelt celle PCR er en svært følsom teknikk som kan oppdage så lite som én kopi av double-strandet DNA57. Ved intron mindre gener, kan gDNA i kjernen også produsere falske positiver. Unngå samlingen av gDNA ved å plassere pipette fra kjernen under høsting bidrar til å løse dette problemet. Tilstedeværelsen av gDNA kan bli pålitelig analysert ved å forsterke en intronic sekvens25.

Gjenkjenning av mRNA molekyler av RT PCR blir upålitelige på 10 kopier44, antagelig på grunn av lav effektiviteten i RTase48, og kan føre til en under påvisning av lav-overflod transkripsjoner26,42. Dette kan være problematisk hvis intron mindre gener. Faktisk, unngå av kjernen reduserer mengden cytoplasma som kan bli samlet og derfor oppdagelsen følsomheten. Kombinasjonen av encellede RT PCR etter oppdateringen-klemme med biocytin merking krever at formen på cellen opprettholdes som mulig (Figur 3). Uunngåelig, reduserer dette mengden av materiale som kan bli samlet, og dermed redusere suksessraten. Et kompromiss mellom cytoplasma samling og bevaring av celle morfologi er obligatorisk.

Multiplex encellede RT-PCR-dataene er ikke kvantitativ som bare gi informasjon om cDNAs er presentere eller fraværende i det innsamlede materialet. Men på grunn av gjenkjenning grensene beskrevet ovenfor, kan forekomsten av gjenkjenning på befolkningsnivå gjenspeile overflod av gener på enkeltcelle nivå. Alternative tilnærminger tillater generering av mer kvantitative data, men de tekniske begrensningene pålagt av sine spesifikke forsterkning strategier (dvsrelativ kvantifisering av homologe gener eller RT-qPCR) i stor grad begrense antall gener som kan samtidig analysert41,53,55,58,59,60,61,62,63 ,64,65,66. Siste kombinasjonen av oppdateringen-klemme innspillinger og enkelt celle RNaseq, kalles Patch-seq30,31, kan kvantitative transcriptomic analyse av electrophysiologically preget celler. Det er en nye og lovende tilnærming, men det krever tilgang til høy gjennomstrømming sequencere og dataene som genereres krever tidkrevende analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Alexandre Mourot for hans kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 og ANR-17-CE37-0010-03), BLG støttes av fellesskap fra Fondation pour la Recherche sur Alzheimers. Vi takker dyr anlegget å IBPS (Paris, Frankrike).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series - 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series - 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series - 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13 (2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

Tags

Nevrovitenskap problemet 136 Gene expression profil nerveceller astrocyttene hjernen skiver hele celler konfigurasjon nestede polymerasekjedereaksjons (PCR)
Enkelt celle Multiplex omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons etter Patch-klemme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet,… More

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter