Summary
في المختبر استخدام تينوسيتيس التنكسية ضروري عند التحقيق في فعالية العلاج الرواية في تيندينوباثي. ومع ذلك، استخدام معظم البحوث والدراسات فقط نموذج الحيوان أو تينوسيتي صحية. ونحن نقترح البروتوكول التالي لعزل تينوسيتيس التنكسية الإنسان أثناء الجراحة.
Abstract
تيندينوباثي، حالة مؤلمة أن يتطور استجابة لانحطاط وتر، أخذ في الارتفاع في العالم المتقدم النمو بسبب زيادة النشاط البدني وعمر أطول. على الرغم من انتشاره المتزايد، المرضية الأساسية لا تزال غير واضحة، وعلاج الأعراض عموما. في الآونة الأخيرة، تم التحقيق في العديد من الخيارات العلاجية، بما في ذلك عوامل النمو والخلايا الجذعية والعلاج الجيني، أملا في تعزيز فاعلية الشفاء لوتر التنكسية. ومع ذلك، أجريت معظم هذه الدراسات البحثية فقط على نماذج حيوانية أو تينوسيتيس بشرية صحية. على الرغم من بعض الدراسات باستخدام تينوسيتيس المرضية، على حد علمنا لا يوجد حاليا البروتوكول لا تصف كيفية الحصول على تينوسيتيس التنكسية البشرية. الهدف من هذه الدراسة وصف بروتوكول قياسي لاكتساب تينوسيتيس التنكسية البشرية. في البداية، كان حصاد الأنسجة وتر من مريض مع اللقيمه أثناء الجراحة. ثم أخذت عينات خزعة من باسطة الباسطة القصيرة وتر المقابلة للتغييرات الهيكلية التي لوحظت في وقت الجراحة. ظهر كل الأوتار المقطوع لتكون مملة، والرمادي، وقابلة للتفتيت، ومتوذمه، مما جعلها متميزة بصريا من الأصحاء. تينوسيتيس مثقف وتستخدم لإجراء التجارب. وفي الوقت نفسه، حللت نصف الأنسجة المقطوع الأشيع، وتبين أنهما يشتركان في نفس الميزات الرئيسية من تيندينوباثي (خلل التنسج أنجيوفيبروبلاستيك أو تضخم). وأكد تحليل ثانوي من إيمونوسيتوتشيميستري الخلايا المستزرعة تينوسيتيس مع الأغلبية من وجود البقع الإيجابية للبروتينات الموهوك وتينومودولين الخلايا. ثم حددت صفات طبيعة الأمراض التنكسية تينوسيتيس بمقارنة الخلايا مع مراقبة صحية باستخدام مقايسة الانتشار أو قرت-بكر. عرض تينوسيتي التنكسية أعلى معدل انتشار وأنماط التعبير الجيني مماثلة تيندينوباثي مطابقة للتقارير السابقة. وعموما، هذا البروتوكول الجديد قد توفر أداة مفيدة للدراسات المستقبلية من تيندينوباثي.
Introduction
تيندينوباثي هو شرط العضلات والعظام التنكسية مزمنة التي تتطور في أجزاء مختلفة من الجسم. في الآونة الأخيرة، ازداد عدد الحالات من تيندينوباثي إلى حد كبير في العالم المتقدم النمو بسبب تزايد المشاركة في الرياضة الترفيهية وزيادة متوسط العمر المتوقع1،2. يعتبر القضية تيندينوباثي المتعددة العوامل، وتتضمن هذه الأسباب الاسكيمية، وإصابات الجذور الحرة الأكسجين، واختلال توازن بين innervations مضيق للأوعية ووعائي والدموع الصغيرة الداخلية والتغيرات العصبية-التنظيم3 ،،من45،6،،من78. معظم العلاجات تيندينوباثي فقط تخفيف أعراضه. وعلاوة على ذلك، العلاج دون تجديد الأنسجة تتطلب وقتاً طويلاً لإعادة التأهيل وتحقيق استجابة محدودة من الأوتار الجرحى، مما يفرض تحديا السريري للأطباء9.
وقد عجز خيارات العلاج الحالي جنبا إلى جنب مع عدم القدرة على وتر الأمراض التنكسية للاعطاب الباحثين يؤدي الاهتمام باستكشاف استراتيجيات العلاج البديل. في الآونة الأخيرة، أفادت الدراسات الجديدة العديد من النتائج المبشرة بالخير لتعزيز فعالية الشفاء الأوتار تيندينوباثي باستخدام عوامل النمو، الخلايا الجذعية استناداً إلى العلاج، والجينات العلاج10،،من1112.
ومن خلال استعراض الأدبيات، وجدنا أن الدراسات المعنية قد تقسم إلى فئتين استناداً على تحليل المواد: نماذج الحيوانات مثل الفئران، أو ماوس، أو أرنب؛ والنماذج البشرية. فيما يتعلق بالنموذج الحيواني، وحاليا هناك اثنين من التقنيات شعبية لتوليد تيندينوباثي: الكيميائية التعريفي للإصابة أو الميكانيكية التحميل الزائد النموذج. ومع ذلك، كانت محدودة كل نموذج الحيوان في استنساخ ال13،علم الأمراض المعقدة تيندينوباثي البشرية14.
معظم الأوراق باستخدام العينات البشرية حللت الأشيع أو أداؤها في المختبر التجربة استناداً إلى تينوسيتي بشرية صحية بدلاً من الأمراض التنكسية تينوسيتي15،16،،من1718 , 19 , 20 , 21-إلا بضع ورقات أفادت أنها تستخدم تينوسيتي التنكسية بشرية، ولكن أنها لم تصف بالتفصيل البروتوكول المستخدم للحصول على تينوسيتي التنكسية من البشرية22،23. وفي هذا السياق، تجدر الإشارة إلى أن نتائج ناجحة من الطراز الحيوان أو صحية الأنسجة/تينوسيتي قد لا بالضرورة التنبؤ بفعالية الإنسان أو الجرعات الفعالة نظراً لانحطاط وتر عملية معقدة، والآلية المرضية لا تزال غير مفهومة تماما.
جماعياً، من الضروري أن تصف البروتوكول القياسي للحصول على تينوسيتي التنكسية من الأنسجة البشرية دون التسبب في آثار ضارة إلى الجهة المانحة. توضح هذه المقالة بروتوكول حول كيفية الحصول على تينوسيتي التنكسية البشرية. للتحقق من البروتوكول، تم تحليل الأنسجة المقطوع الأشيع. بعد ذلك، تم تأكيد الخلية مثقف تينوسيتي التنكسية باستخدام إيمونوسيتوتشيميستري (المحكمة الجنائية الدولية) وكمية الوقت الحقيقي-تفاعل البوليميراز المتسلسل (قرة-PCR) مقايسة بقاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجرى البروتوكول وفقا "إعلان هلسنكي" والبروتوكول أقر "مجلس المراجعة المؤسسية" في المركز الطبي بوندانج تشأ.
1-الأمراض التنكسية وتر الأنسجة الحصاد من المريض
- تشخيص اللقيمه بأخذ تاريخ طبي واستخدام نتائج اختبار بدني: الرقة على أصل تيندينوس قريبة من ابيكونديلي الجانبية؛ ألم أثارت قبل التمديد وقاوم المشتركة للرسغ.
- استخدام معايير الاشتمال التالية: أكثر من 18 سنة عمر؛ تاريخ اللقيمه على الأقل لمدة ستة أشهر؛ المتعنت للمعاملة غير المنطوق؛ لقد مرت ثلاثة أشهر على الأقل منذ حقن الكورتيزون أو البلازما الغنية الصفيحات البوتولينوم
- استبعاد ما يلي: النساء الحوامل؛ المرضى الذين يعانون من أمراض عنق الرحم العمود الفقري، الكوع التهاب المفاصل، وأمراض الروماتيزم، والجراحة حول الكوع، ومتلازمة فخ العصبية؛ المرضى الذين يرفضون التبرع بالانسجة.
-
تقنية جراحية
ملاحظة: انظر الشكل 124.- بعد التخدير العام isoflurane والتنبيب داخل الرغامى، وضع الذراع على الطاولة وتطبيق عاصبة. قم بتطبيق عامل تدين في الذراع كله وثني مع ورقة جراحية معقمة.
- كشف الكوع الجانبية من خلال شق 3 – 5 سم مع أنتيروميديال فقط من المبضع الجراحي من 15 رقم بليد ابيكونديلي الأفقي والدانية إلى المستوى المشترك.
- بصريا وتحديد طويلة باسطة الباسطة (اكرل) وواجهة aponeurosis الباسطة وجعل شق تقسيم 2 – 3 ملم في العمق بين aponeurosis اكرل والباسطة بشفرة المبضع جراحي رقم 15 في الواجهة التي تم تحديدها.
- استخراج اكرل في الأسفل، الذي سيجلب طويلة باسطة الباسطة باثولوجي قصيرة (اكرب) الأصل أدناه في العرض المباشر.
- تحديد بصريا باثولوجي الأنسجة التنكسية بلونه رمادي مملة المميزة والأنسجة عادة متوذمه وقابلة للتفتيت.
- بعد تحديد الهوية، يرسخ بعناية جميع الأنسجة التنكسية حادا استخدام المبضع الجراحي رقم 15 وشفرات صغيرة.
- تضمين الأنسجة ريسيكتيد (حوالي 1 سم3) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) فورا وإزالة جميع الأنسجة المحيطة باستثناء الأنسجة وتر بعناية إلى حوالي 10 مل من برنامج تلفزيوني بالسرعة الممكنة.
- في الحالات مع اكسوستوسيس عظمى في epicondyle الأفقي، إزالة استخدام رونجيور exostosis وتنعيم أنه مع عرموش. جعل عدة ثقوب الحفر (قطرها 1.6 ملم، حوالي 6 – 8 فتحات) في اللقمة أنتيرولاتيرال لتعزيز إمدادات الأوعية الدموية. وهذا اختياري.
- إغلاق طبقة بطبقة باستخدام مواد غير الامتصاص خياطة الجرح.
-
تينوسيتي مراقبة صحية
- الحصول على تينوسيتيس صحية من وتر المتبقية لوتر الركبة السيارات أو السيارات-الرضفة أثناء إعادة بناء الرباط الصليبي الأمامي، واستخدامه كعنصر تحكم ل التجربة التالية25.
ملاحظة: عدد العينات المستخدمة في هذه الدراسة كانت ثلاث منها في كل مجموعة.
- الحصول على تينوسيتيس صحية من وتر المتبقية لوتر الركبة السيارات أو السيارات-الرضفة أثناء إعادة بناء الرباط الصليبي الأمامي، واستخدامه كعنصر تحكم ل التجربة التالية25.
2-علم الأنسجة
- تخزين حوالي نصف الأنسجة المقطوع في محايدة الفورمالين 10% مخزنة في غطاء الأبخرة الكيميائية أو ما يعادلها.
- تضمين الأنسجة في كتلة بارافين (4 – 5 مل) والفرع أنه في 4 – 5 ميكرون أبواب التاج.
-
وصمة عار المقاطع من التحكم ووتر التنكسية مع وصمة عار الهيماتوكسيلين وويوزين (H & E) ووصمة عار السيان الأزرق في الرقم الهيدروجيني 2.5. أداء ح & ه تلطيخ في جهاز الآلي وصمة عار على النحو التالي.
- ديبارافينيزي استخدام زيلين نفط (3 مرات، 5 دقائق، على التوالي).
- هيدرات من كحول متدرج للمياه (الكحول 100%، 4 دقيقة 100 ٪ من الكحول، 3 دقيقة الكحول 95 ٪، 2 دقيقة؛ والكحول 70%، 1 دقيقة; المياه، 2 دقيقة).
- وصمة عار في توضع للحد الأدنى 5 يغسل جيدا في الماء لمدة 2 دقيقة.
- التفريق في الكحول حمض 1% (1% HCl في الكحول 70%) 3 س. يغسل جيدا في الماء لمدة 3 دقائق.
- تحييد HCl بالغمس في الأمونيا 0.5% لمدة 10 ق، تليها يغسل الماء 3 دقائق.
- وصمة عار في اوسيون لمدة 5 دقائق.
- يذوي من خلال الكحول (الكحول 80%، 30 s؛ الكحول 95%، 1 دقيقة والكحول 100% 1 دقيقة، الكحول 100% 2 دقيقة).
- واضح في زيلين نفط (3 مرات، 2 دقيقة، 2 دقيقة، ودقيقة 3، على التوالي).
- جبل مع شريحة غلاف.
-
أداء إيمونوهيستوتشيميتري (المدينة) باستخدام مجموعة "السندات البوليمر صقل الكشف" وفقا لإرشادات الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة.
- بعد ديبارافينيزيشن باستخدام زيلين نفط، إجراء إجراء استرجاع مستضد استخدام "السندات حانمه استرجاع الحل" لمدة 30 دقيقة عند 100 درجة مئوية. حل استرداد السندات حانمه يحتوي على سترات يقوم المخزن المؤقت والفاعل بالسطح (1 لتر، 5.9 – 6.1 درجة الحموضة).
- آرو بيروكسيداسيس الذاتية التي تفرخ الأنسجة مع بيروكسيد الهيدروجين لمدة 5 دقائق.
- احتضان الأقسام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة المحيطة (21-22 درجة مئوية) مع الأجسام المضادة الأولية ضد عامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF) (1: 200)، تينومودولين (1: 200)، أو الموهاكية (1: 200).
- القيام بوضع علامات على جسم الثانوية مع خالية من البيوتين البوليمرية الفجل البيروكسيديز-رابط نظام جسم المتقارنة.
- استخدام أرنب ثانوية المضادة للماوس مفتش في مصل الحيوان 10% (v/v) في مخزنة تريس saline/0.09% 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one حل لتعريب الماوس الأجسام المضادة.
- استخدم الأرنب المضادة البوليمر بولي-برنامج الصحة الإنجابية-مفتش (< 25 ميكروغرام/مل) الذي يحتوي على 10% (v/v) مصل الحيوان في مخزنة تريس saline/0.09% لتعريب أضداد الأرنب.
- استخدام 3، 3 '-ديامينوبينزيديني تيتراهيدروتشلوريدي هيدرات في حل مثبت لتصور المعقدة عن طريق متسرعا براون.
- كونتيرستاين مع < الهيماتوكسيلين 0.1% (أزرق) لتصور نواة الخلية.
- مراقبة الشرائح ملطخة H & ه السيان الأزرق البقع، والمدينة فيجف وتينومودولين والموهوك تحت المجهر الخفيفة والحصول على صور مجهرية الممثل لكل شريحة تحت حقل واحد عالية القوة (400 X).
3-تينوسيتي الثقافة
-
إعداد الأنسجة
- إعداد عينة وتر عن طريق إزالة جميع الأنسجة المحيطة دقة مع مايكرو-مقص وملقط.
- تغسل ببرنامج تلفزيوني وفرم إلى قطع صغيرة (حوالي 1 مم3 أو أقل).
- هضم الأنسجة ح 1 في 30 مل من المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم) وتستكمل مع 30 ملغ/مل كولاجيناز الثاني في 37 درجة مئوية.
- تمر الخلايا عبر مصفاة خلية 100 ميكرومتر.
- قم بإلغاء تنشيط "كولاجيناز الثاني" بإضافة 1 مل مصل البقر الجنين (FBS).
- الطرد المركزي في 196 س ز لمدة 5 دقائق.
-
خلية ثقافة
- البذور 3 × 105 خلايا في طبق 100 مم والثقافة مع دميم تستكمل مع 10% FBS والحل 1% مضاد حيوي فطري في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة لمدة أسبوع واحد.
- تغيير ثقافة المتوسط كل ثلاثة أيام حتى يحدث التقاء 80%. الثقافة مراقبة صحية وعينات الخلايا التنكسية حتى مرور أربع واستخدام للتجربة.
4-إيمونوسيتوتشيميستري (المحكمة الجنائية الدولية)
- نقل 200 ميليلتر من خلايا (2 × 105 خلايا) إلى ثمانية آبار شريحة الدائرة وزراعة الخلايا لالتقاء بالإضافة إلى وسائط جديدة لمدة يوم واحد.
- تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإصلاحها مع 500 ميليلتر من 4% فورمالدهايد كل بئر.
- احتضان الشرائح مع 0.5% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة ل permeabilization الأغشية.
- كتلة في برنامج تلفزيوني مع ألبومين المصل البقري 1% و 0.05% 20 توين الموهوك وتينومودولين، على التوالي.
- احتضان في الظلام مع الماوس الموهوك المضادة [مونوكلونل] جسم (تخفيف 1: 100) والماعز تينومودولين مكافحة جسم (تخفيف 1: 100) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- احتضان الأجسام المضادة الثانوية (أليكسا 555-مكافحة الماعز (1: 200) تينومودولين؛ 488-مكافحة أليكسا الماوس (1: 200) الموهوك) في الظلام ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- جبل مع 0.5 ميليلتر من وسط تصاعد الأسفار.
- تحليل استخدام مجهر الأسفار (400 X).
5-انتشار الإنزيم
-
قياس فيابيليتيس الخلية باستخدام تيترازوليوم للذوبان في الماء (WST)-1.
- البذور خلايا صحية، والأمراض التنكسية في لوحات جيدا 96 في كثافة الخلايا 2 × 103 كل بئر 24 و 72 ح 120.
- بعد التفريخ، إضافة 10 ميليلتر من الحل WST-1 10% لكل بئر.
- احتضان لوحات ح 3 في 37 درجة مئوية في شركة 5%2.
- قياس الكثافة الضوئية في 450 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية. أخذ قراءات ثلاث مرات على الأقل في جميع النقاط الزمنية لكل عينة.
-
قياس مقدار الحمض النووي الخلوي استخدام مقايسة بردو.
- البذور على حد سواء صحية وخلية التنكسية في 96 ألواح جيدا في كثافة 2 × 103 خلايا كل بئر 24 و 72 ح 120.
- بعد التفريخ، إضافة 10 ميليلتر من الحل بردو 10% لكل بئر.
- احتضان لوحات ح 3 في 37 درجة مئوية في شركة 5%2.
- إضافة 100 ميليلتر/بئر الحل تحديد/ديناتورينج (60-70% إيثانول، 0.1-0.5% هيدروكسيد الصوديوم) والاحتفاظ اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 100 ميليلتر/آبار المعدة 1 × كشف الأجسام المضادة حل وتبقى اللوحة في درجة حرارة الغرفة ح 1.
- إزالة الحل وتغسل لوحة ثلاث مرات مع 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
- إضافة 100 ميليلتر/كذلك أعدت الحل مترافق HRP جسم الثانوي x 1 والاحتفاظ اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- إزالة لوحة الحل ويغسل ثلاث مرات مع 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
- إضافة 100 ميليلتر من الركازة TMB 50%.
- احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 100 ميليلتر لوقف الحل.
- قياس الكثافة الضوئية في 450 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية.
ملاحظة: أخذ قراءات ثلاث مرات على الأقل في جميع الأوقات النقاط لكل عينة.
6. التحليل الإحصائي
- جمع وتحليل البيانات باستخدام SPSS.
- تصوير البيانات قبل ± يعني الخطأ المعياري للوسط.
- استخدام اختبار مان ويتني U.
- تنظر فروق معتد بها إحصائيا عندما تكون قيمة p أقل من 0.05 (ف < 0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكشفت تحاليل نسيجية أن الأنسجة المقطوع من اللقيمه يتسم بسمات وتر تيندينوباثيك. وكشف قسم ح & ه من تيندينوباثي وتر التنكسية حزمة الكولاجين غير منظم مع فقدان قطبية وهياكل غرامة الألياف المتوازية المستقيمة، ومعبأة بشدة. كانت علامات نسيجية توحي بانحطاط مثل سيلولاريتي أعلى ونوى الموسع دون الشكل المغزل النموذجية الشائعة في العينات. بالإضافة إلى ذلك، حزم الكولاجين لوتر تحولت كانت ضعيفة نسبيا ويوزين الملون من ح & ه ولكن كانت إيجابيا الملون بالأزرق السيان تشير إلى زيادة في مادة بروتيوجليكانس والجليكوزامينوجليكان.
وفي جميع الحالات، كانت زيادة الأوعية الدموية في عدد والمجاميع الاحتلال مسافات مضمنة بين الألياف وقورنت بالأوعية الدموية مثل الشق العادي. في تلطيخ المدينة، أظهرت خلايا الأوتار تحولت هيولى حبيبية رد فعل إيجابي VEGF مقارنة برد الفعل السلبي من مراقبة منها. جماعياً، تأكدت هذه النتائج أن كانت الأنسجة المقطوع من اللقيمه الأنسجة التنكسية ومناسبة لثقافة تينوسيتي التنكسية (انظر الشكل 2).
الخلايا المستزرعة تم تأكيد تينوسيتيس بالمحكمة الجنائية الدولية، وتأكدت الأنسجة المقطوع بالمدينة كوتر الأنسجة. أظهرت معظم استزراع الخلايا والخلايا في الأنسجة وتر وصمة إيجابية لعلامات تينوسيتي الممثل المعروفة كالبروتينات الموهاكية (الأخضر) والبروتينات تينومودولين (أحمر) مع مظهر ممدود تحت المجهر (انظر الشكل 3). أيضا، قد الأنسجة المقطوع تلطيخ إيجابية للبروتينات الموهوك والبروتينات تينومودولين إيممونوهيستوتشيميكالي (انظر تكميلية الشكل 1). واقترحت هذه أن تتألف الأنسجة المقطوع بالانسجة وتر.
وقد تينوسيتيس مثقف من الأنسجة المقطوع من اللقيمه السمات المميزة لتتوافق مع تيندينوباثي. كانت مثقف تينوسيتيس كل الأمراض التنكسية وصحية لمدة 4 أيام تحت نفس الشرط. في كل نقطة من الزمن، تم قياس معدل انتشار بردو المقايسة والمقايسة WST-1. وأظهرت النتائج أن معدل انتشار الخلايا التنكسية كان إلى حد كبير أعلى بالمقارنة مع عناصر التحكم كما ذكر سابقا (ف < 0.05) (انظر الشكل 4أ).
الجينات الخمسة التي من المعروف أن ينظم حتى في وتر التنكسية حللت بها قرت PCR. التعبير عن الجينات، COL3A1، ACTA2، TAC1 (SP)، ومعاهدة الصداقة والتعاون مستقبلات 1، و PTGS2 (COX2) زيدت أكثر كثيرا في الخلايا المستزرعة من وتر التنكسية مما في الخلايا من الأصحاء. تظهر تعبيرات النسبي لجميع الجينات في الشكل 4ب و تكميلية الشكل 2.
الشكل 1 : صور الجراحية للحصاد وتر التنكسية. (أ) بعد شق الجلد والتشريح، باثولوجي الأنسجة التنكسية عن منشأ الباسطة المشتركة تعرضت، إظهار لون رمادي المملة مميزة مع تغير متوذمه (خط أحمر). على العكس من ذلك، كان المظهر العام للأنسجة وتر طبيعية لامعة وثابتة مع لهجة رمادي قليلاً (خط أسود). (ب) جميع الأنسجة التنكسية التي تم تحديدها كانت مستأصل حادا وثم تعرضت عظم رأسه شعاعي. (ج) تم تضمينها جميع الأنسجة ريسيكتيد في المياه المالحة الفوسفات مخزنة فورا وتم بعناية تشريح الأنسجة المحيطة غير تيندينوس وقت ممكن. اكرب: قصيرة باسطة الباسطة. الصادرات: باسطة أصابع communis. وحدة نقدية أوروبية: باسطة الزندية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تأكيد لوتر التنكسية الأشيع. (أ) قد مشوش حزم الكولاجين مع فقدان قطبية العينات المصبوغة، والأمراض التنكسية في ح & ه من اللقيمه وزيادة عدد الخلايا مقارنة بمراقبة صحية. (ب)-السيان تلطيخ الأزرق أظهرت أن وتر التنكسية زادت مادة الأرض تتألف من بروتيوجليكانس والجليكوزامينوجليكان مع عدة بقع مخاطاني و vacuoles بين الألياف (السهم). (ج)-بالإضافة إلى ذلك، زادت immunohistochemistry VEGF أظهرت تلطيخ في تشكيل السفينة في عينات وتر التنكسية مقارنة بالعينات السيطرة. VEGF: الأوعية الدموية غشائي النمو عامل. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحديد تينوسيتي بالمحكمة الجنائية الدولية- وأكدت المحكمة الجنائية الدولية استزراع الخلايا والخلايا في الأنسجة وتر تينوسيتي. وأظهرت معظم الخلايا إيجابية وصمة عار لعلامة تينوسيتي التمثيلية، بما في ذلك الموهاكية (أخضر) وتينومودولين (أحمر) مع ظهور ممدود تحت المجهر. تشوندروسيتي كعنصر سلبي. المحكمة الجنائية الدولية: إيمونوسيتوتشيميستري. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: الخصائص للأمراض التنكسية تينوسيتي. (أ وب) تينوسيتيس التنكسية (أحمر) كان معدل انتشار أعلى مع زيادة ملحوظة في سيلولاريتي. الجينات (ج) الخمسة التي هي معروفة لتكون ذات صلة بتطوير تيندينوباثي كانت مرتفعة إلى حد كبير في تينوسيتيس الأمراض التنكسية. وقد تم تطبيع مستويات التعبير الجيني ضد جابده. *: تعني < 0.05، * *: يعني < 0.01، على التوالي. س: مضمون ص الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الرقم 1: تأكيد النسيجي للأنسجة المقطوع الأنسجة وتر. وقد تم تحليل الأنسجة المقطوع أيضا بالمدينة الموهوك وتينومودولين لتحديد ما إذا كانت الأنسجة المقطوع خصائص كافية من الأنسجة وتر. المدينة: إيمونوهيستوتشيميستري. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الرقم 2: التعبير عن تيندينوباثي المتعلقة بالجينات في تينوسيتي- محاضر خمس جينات تطبيع بالتعبير أكتين كانت مرتفعة إلى حد كبير في تينوسيتيس الأمراض التنكسية واتجاهات مماثلة في الشكل 4. تم تطبيع مستويات التعبير الجيني ضد أكتين بمتوسط < 0.05 و < 0.01، على التوالي. س: مضمون ص الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أفاد عدد من الدراسات السابقة كيفية إنشاء نماذج حيوانية تيندينوباثيك المزمن باستخدام إجراءات مختلفة مثل كولاجيناز أو حقن كارتوجينين وتشغيل المطحنة وأكثر26،27. على الرغم من أن العديد من الدراسات التي تبين الآثار العلاجية الواعدة استناداً إلى هذه النماذج الحيوانية، تجارب باستخدام تينوسيتي التنكسية البشرية سيكون حاسما في ميدان تيندينوباثي من أجل استخراج فعالية العلاج. في هذه المقالة، قمنا بإنشاء بروتوكول للحصاد والثقافة تينوسيتيس التنكسية الإنسان دائماً بنجاح. تحصد كل الأنسجة وتر وتينوسيتي مثقف وأظهرت الخصائص المشتركة للأمراض التنكسية وتر وتينوسيتي7،28.
في تجربتنا، لحصاد الأنسجة ناجحة، من الضروري لفهم التغيرات المورفولوجية متكرر المقترنة بوتر التنكسية وتحدد هذا المجال بدقة أثناء الجراحة. الأنسجة التنكسية عادة رمادي أو براون في اللون والأنسجة رقيقة وهشة وغير منظم مع نسيج فضفاض. ينبغي أن تظل معايير اشتمال واستبعاد للبروتوكول الصارم مع تقييم دقيق للعلاجات السابقة قبل موسم الحصاد.
حجم الأنسجة مهم أيضا لثقافة خلية ناجحة. ونحن نوصي حصد أكثر من 1 سم3. عادة، ما دام هو إزالة كافة مجال الأمراض التنكسية، كمية الأنسجة التي تم جمعها سيكون كافياً لثقافة الخلية. وأخيراً، نحن لم تستخدم تينوسيتيس على مرور ستة في كل التجارب. حتى مرور ستة، ونحن نعتقد أن الخلايا المستزرعة لا يزال يتسم بسمات الانحطاط.
لدينا بروتوكول له العديد من المزايا. وتشمل هذه المزايا أي ضرر للمريض حيث كان من المفترض الأنسجة التنكسية المراد إزالتها أثناء الجراحة، والكفاءة نظراً لكمية الأنسجة المطلوبة بما فيه الكفاية للتجربة، أخلاقية عالية نظراً لأنه لا يوجد انتهاك للأنسجة السليمة، إمكانية تكرار نتائج في تلك الأنسجة المرضية من البشر يمكن سهولة الحصول أثناء الجراحة، وأخيراً، تيسيرا لتطبيق التقنيات الجراحية مرة تصبح مألوفة.
ومع ذلك، نعترف بأن لدينا تجربة العديد من القيود. أولاً، لا يمكن أن نستبعد تماما بقايا أثر الكورتيكوستيرويدات السابقة أو الحقن البلازما الغنية بالصفائح الدموية حتى ولو قمنا بتضمين فقط المرضى الذين قد مرت ثلاثة أشهر على الأقل من تلقي أي علاج السابقة. وبالإضافة إلى ذلك، في هذا البروتوكول، نحن فقط تحصد وتر اكرب واستخدمتها للثقافة تينوسيتيس التنكسية منذ وتر اكرب موقع تيندينوباثي مشتركة لعملية جراحية جنبا إلى جنب مع الأوتار أخيل والكفة. ينبغي أن يتم إجراء المزيد من الدراسات مع حجم عينة أكبر مع التركيز على أية اختلافات بين مختلف المواقع على تيندينوباثي.
وفي الختام، سيكون هذا البروتوكول المصادق عليها لاكتساب تينوسيتيس التنكسية الإنسان أداة مفيدة لإجراء تحقيقات في المستقبل في مجال البيولوجيا وتر والتدخلات العلاجية رواية الاختبار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
كان يؤيد هذا البحث بمنحه من كوريا الصحة التكنولوجيا والتطوير د المشروع من خلال كوريا الصحة الصناعة تطوير معهد (خيدي)، الذي تموله وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية، جمهورية كوريا (منح رقم: HI16C1559).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
References
- Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
- Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40 (2012).
- Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
- Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
- Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
- Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
- Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
- Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
- Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
- Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
- Dirks, R. C., Warden, S. J.
- de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
- Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26 (2009).
- Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
- Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
- Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
- Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209 (2011).
- Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
- Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
- Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
- Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
- Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes' patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
- Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557 (2016).
- Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
- Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), author reply 1359-1360 1359-1360 (2009).
