Summary
Uso in vitro de tenocytes degenerativa é essencial ao investigar a eficácia do tratamento romance na tendinopatia. No entanto, a maioria dos estudos de investigação usar apenas o modelo animal ou um tenocyte saudável. Propomos o seguinte protocolo para isolar tenocytes degenerativa humana durante a cirurgia.
Abstract
Tendinopatia, uma condição dolorosa que se desenvolve em resposta à degeneração do tendão, está em ascensão no mundo desenvolvido devido ao aumento da atividade física e a esperança de vida. Apesar de sua crescente prevalência, a patogênese subjacente ainda permanece incerto, e o tratamento é geralmente sintomático. Recentemente, várias opções terapêuticas, incluindo fatores de crescimento, as células-tronco e terapia gênica, foram investigadas na esperança de aumentar a potência de cura do tendão degenerativa. No entanto, a maioria destes estudos de investigação foram realizada somente em modelos animais ou tenocytes humana saudável. Apesar de alguns estudos usando tenocytes patológico, para o melhor de nosso conhecimento não há atualmente nenhum protocolo descreve como obter tenocytes degenerativa humana. O objetivo deste estudo é descrever um protocolo padrão para a aquisição de tenocytes degenerativa humana. Inicialmente, o tecido do tendão foi colhido de um paciente com epicondilite lateral durante a cirurgia. Em seguida, foram coletadas amostras de biópsia do extensor carpi radial brevis tendão correspondendo a mudanças estruturais observadas no momento da cirurgia. Todos os tendões colhidos apareceram para ser maçante, cinza, friável, e edematosa, que fez-los visualmente distintos daqueles saudáveis. Tenocytes foram cultivadas e usadas para experimentos. Entretanto, metade dos tecidos colhidos foram analisados histologicamente, e foi mostrado que partilhavam as mesmas características chaves da tendinopatia (angiofibroblástico displasia ou hiperplasia). Uma análise secundária por imunocitoquímica confirmou que as células cultivadas foram tenocytes com a maioria das células ter manchas positivas para proteínas mohawk e tenomodulin. As qualidades da natureza degenerativa de tenocytes foram então determinadas comparando-se as células com o controle saudável usando um ensaio de proliferação ou qRT-PCR. O tenocyte degenerativa exibido uma maior taxa de proliferação e padrões de expressão de gene semelhante de tendinopatia que combinasse os relatórios anteriores. Em geral, este novo protocolo poderá fornecer uma ferramenta útil para futuros estudos de tendinopatia.
Introduction
Tendinopatia é uma condição de músculo-esquelética crônica degenerativa que se desenvolve em várias partes do corpo. Recentemente, o número de casos de tendinopatia aumentou consideravelmente no mundo desenvolvido devido à crescente participação em esportes recreativos e maior expectativa de vida1,2. A causa da tendinopatia é considerada multifatorial e essas causas incluem isquemia, lesões de radicais livres de oxigênio, um desequilíbrio entre inervações vasoconstritor e vasodilatador, micro-rasga interna e alterações neuro-Regulamento3 ,4,5,6,7,8. A maioria dos tratamentos para tendinopatia apenas aliviar seus sintomas. Além disso, tratamentos sem regeneração de tecidos requerem um longo tempo para reabilitação e alcançar uma resposta limitada de tendões lesionados, que impõe um desafio clínico para os médicos,9.
A incompetência de opções atuais do tratamento, juntamente com a falta de capacidade de degenerativa do tendão de auto-recuperação tem chumbo pesquisadores a ter interesse em explorar estratégias de tratamento alternativo. Recentemente, novos estudos relataram muitos resultados promissores para melhorar a eficácia de cura dos tendões tendinopatia usando fatores de crescimento, células-tronco com base em terapia e terapia de gene10,11,12.
Através de uma revisão de literatura, encontramos que os estudos envolvidos podem ser divididos em duas categorias com base em seus materiais de análise: animal modelos como um rato, um rato ou um coelho; e modelos humanos. No que se refere o modelo animal, atualmente, existem duas técnicas populares para gerar tendinopatia: indução química da lesão ou mecânico sobrecarregando o modelo. No entanto, cada modelo animal foi limitado em reproduzir o complexo humano tendinopatia patologia13,14.
A maioria dos jornais, usando amostras humanas foram analisados histologicamente ou realizado o em vitro experimento com base em um tenocyte humano saudável em vez de um tenocyte degenerativa15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. somente alguns jornais relataram que eles usaram um humano tenocyte degenerativa, mas eles não descrever em detalhe o protocolo usado para obter o tenocyte degenerativa do humano22,23. Neste contexto, note-se que resultados de sucesso do modelo animal ou o tecido saudável/tenocyte não podem necessariamente prever eficácia humana ou dosagem eficaz porque a degeneração do tendão é um processo complicado e a patogênese é Ainda não totalmente compreendidas.
Coletivamente, é necessário descrever o protocolo padrão para obter o tenocyte degenerativa do tecido humano sem causar efeitos adversos para o doador. Este artigo descreve um protocolo sobre como adquirir o tenocyte degenerativa humana. Para validar o protocolo, os tecidos colhidos foram analisados histologicamente. Em seguida, a célula culta foi confirmada como o tenocyte degenerativa usando imunocitoquímica (ICC), um quantitativo em tempo real-cadeia da polimerase (qRT-PCR) e um ensaio da viabilidade.
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Protocol
O protocolo foi realizado em conformidade com a declaração de Helsínquia e o protocolo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional no CHA Bundang Medical Center.
1. colheita de tecido degenerativas do tendão do paciente
- Diagnóstico de epicondilite lateral tomar uma história clínica e achados de exame físico, usando: ternura sobre a origem tendinosa perto do epicôndilo lateral; dor evocada por resistiu à extensão da articulação do pulso.
- Use os seguintes critérios de inclusão: mais de 18 anos de idade; uma história de epicondilite lateral, por um período mínimo de seis meses; recalcitrante para tratamento não-operatório; pelo menos três meses se passaram desde que a injeção de corticosteroide, plasma rico plaquetas ou toxina botulínica
- Excluir o seguinte: as mulheres grávidas; pacientes com história de doença da coluna cervical, cotovelo, artrite, doenças reumatológicas, cirurgia ao redor do cotovelo e síndrome de encarceramento do nervo; pacientes, recusando-se a doar o tecido.
-
Técnica cirúrgica
Nota: Ver Figura 124.- Após anestesia geral por intubação endotraqueal e isoflurano, colocar o braço na mesa e aplicar um torniquete. Em seguida, aplica betadine agente sobre o braço todo e a cortina com uma folha de cirúrgica asséptica.
- Expor o cotovelo lateral através de uma incisão de 3 a 5 cm com n º 15 cirúrgica Bisturi lâmina apenas ântero-medial ao epicôndilo lateral e proximal ao nível da articulação.
- Visualmente identificar a interface de aponeurose do extensor e extensor radial longo do carpo (ECRL) e fazer uma incisão de divisão 2 a 3 mm em profundidade entre o ECRL e extensores aponeurose com uma lâmina de bisturi cirúrgico de n º 15 na interface identificada.
- Extraia o ECRL anteriormente, que trará a origem patológica extensor carpi radial longo brevis (ECRB) abaixo em vista directa.
- Identifica visualmente o tecido degenerativo patológico por sua característica cor cinzento maçante e tecido geralmente edemaciado e friável.
- Após a identificação, cuidadosamente ressecar todo o tecido degenerativo agudamente usando cirúrgica bisturi n º 15 e minilâminas.
- Incorporar o tecido ressecado (cerca de 1 cm3) salina tamponada fosfato (PBS) imediatamente e remover todo o tecido circundante, exceto o tecido do tendão cuidadosamente em cerca de 10 mL de PBS, logo que possível.
- Em casos com Exostose óssea no epicôndilo lateral, remover Exostose usando um rongeur e suavizar isso com uma grosa. Fazer vários furos (diâmetro 1,6 mm, com furos de 6 – 8) no côndilo ântero-lateral para aumentar o suprimento vascular. Isto é opcional.
- Feche a ferida camada por camada, usando material de sutura não absorvível.
-
Tenocyte de controle saudável
- Obter tenocytes saudável do tendão remanescente do tendão autotendão ou autopatela durante a reconstrução do ligamento cruzado anterior e usá-lo como o controle para o seguinte experimento25.
Nota: O número de amostras utilizadas neste estudo foram três em cada grupo.
- Obter tenocytes saudável do tendão remanescente do tendão autotendão ou autopatela durante a reconstrução do ligamento cruzado anterior e usá-lo como o controle para o seguinte experimento25.
2. histologia
- Cerca de metade do tecido colhido armazenar em formol a 10% tamponada neutro em uma coifa química ou equivalente.
- Seção-lo em seções de 4 – 5 µm no e incorporar o tecido em um bloco de parafina (4 – 5 mL).
-
Mancha de seções de controle e degenerativas do tendão com mancha de hematoxilina e eosina (H & E) e mancha azul de Alcian a um pH de 2,5. Execute H & E mancha em uma máquina automatizada mancha como segue.
- Deparaffinize usando o xileno (3 vezes, 5 min, respectivamente).
- Hidrato de álcoois classificados à água (100% álcool, 4 min 100% álcool, 3 min 95% de álcool, 2 min; álcool 70%, 1 min; água, 2 min).
- Coloração em hematoxilina 5 min. Lave bem em água por 2 min.
- Diferenciar em álcool ácido 1% (1% HCl em álcool a 70%) por 3 s. lavar bem em água por 3 min.
- Neutralizar o HCl mergulhando em uma amônia de 0,5% para 10 s, seguido por uma lavagem de água de 3 min.
- Mancha na Eosion por 5 min.
- Desidrata-se através de álcoois (80% de álcool, 30 s; 95% de álcool, 1 min; álcool 1 min, 100% de álcool a 100% 2 min).
- Claro em xileno (3 vezes, 2 min, 2 min e 3 min, respectivamente).
- Montar com um slide de capa.
-
Execute immunohistochemitry (IHC) usando o kit Bond polímero refinar deteção de acordo com as instruções do fabricante com pequenas modificações.
- Depois de deparaffinization usando o xileno, executar um procedimento de recuperação de antígeno usando solução de recuperação de epítopo de Bond por 30 min a 100 ° C. A solução de recuperação de epítopo Bond contém um tampão citrato baseado e surfactante (1 L, pH 5,9 – 6.1).
- Saciar peroxidases endógenas incubando o tecido com peróxido de hidrogênio por 5 min.
- Incube as seções durante 15 minutos a uma temperatura ambiente (21-22 ° C) com anticorpos contra o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (1: 200), tenomodulin (1: 200) ou mohawk (1: 200).
- Execute o anticorpo secundário de marcação com um sistema conjugado de rábano poliméricos livre de biotina peroxidase-linker anticorpo.
- Uso secundário coelho anti-mouse IgG no soro animal de 10% (v/v) em solução tampão saline/0.09% 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one solução para localizar anticorpos do rato.
- Use anticoelho de polímero poli-HRP-IgG (< 25 µ g/mL) contendo 10% (v/v) de soro animal em tampão Tris saline/0.09% para localizar anticorpos de coelho.
- Uso 3, 3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hidrato em uma solução de estabilizador para visualizar o complexo através de um precipitado marrom.
- Counterstain com < 0,1% hematoxilina (azul) para visualizar o núcleo de células.
- Observar os slides corados com H & E, Alcian blue manchas e IHC para VEGF, tenomodulin e mohawk sob microscópio de luz e obter imagens microscópicas representativas de cada slide em campo uma alta potência (400 X).
3. Tenocyte cultura
-
Preparação do tecido
- Prepare a amostra de tendão, removendo todo o tecido circundante completamente com microtesoura e pinça.
- Lavagem com PBS e picar em pedaços pequenos (cerca de 1 mm3 ou menos).
- Digerir tecido por 1h em 30 mL de meio modificado águia de Dulbecco (DMEM) suplementado com 30 mg/mL colagenase II a 37 ° C.
- Passe as células através de um filtro de célula de 100 µm.
- Desactive a colagenase II, adicionando 1 mL de soro fetal bovino (FBS).
- Centrifugar a 196 x g durante 5 min.
-
Cultura celular
- 3 x 105 células de sementes em um prato de 100mm e cultura com DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de solução antibiótico antimicótico a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 por 1 semana.
- Altere o meio de cultura a cada três dias até que ocorra a confluência de 80%. Cultura tanto controle saudável e amostras de células degenerativas até passagem quatro e usar para experimento.
4. imunocitoquímica (ICC)
- 200 µ l de células cultivadas (2 x 105 células) de transferência aos oito poços de um slide de câmara e crescer as células a confluência com a adição de novas mídias para 1 dia.
- Lavar as células com PBS e corrigir com 500 µ l de formol 4% por poço.
- Incubar as lâminas com 0,5% Triton X-100 em PBS por 10 min para permeabilização das membranas.
- Bloquear em PBS com albumina de soro bovino 1% e 0,05% TWEEN-20 para mohawk e tenomodulin, respectivamente.
- Incube no escuro com anticorpo monoclonal antimoicano de rato (diluição de 1: 100) e anticorpo anti-tenomodulin de cabra (diluição de 1: 100) a 4 ° C durante a noite.
- Incubar os anticorpos secundários (Alexa 555-anti cabra (1: 200) por tenomodulin; Rato de 488-anti de Alexa (1: 200) por mohawk) no escuro por 1h à temperatura ambiente.
- Montar com 0,5 µ l de um meio de montagem de fluorescência.
- Analise usando um microscópio de fluorescência (400 X).
5. proliferação ensaio
-
Realidades de célula de medida usando Water-soluble tetrazólio (WST) -1.
- Sementes de células saudáveis e degenerativas em 96 placas bem em uma densidade de 2 x 103 células por poço para 24, 72 e 120 h.
- Após a incubação, adicione 10 µ l da solução de WST-1 de 10% a cada poço.
- Incube as placas durante 3 h a 37 ° C em 5% CO2.
- Medir as densidades ópticas a 450 nm, utilizando um leitor de microplacas. Fazer leituras de pelo menos três vezes em todos os pontos de tempo para cada amostra.
-
Medida celular DNA quantidade usando o ensaio de BrdU.
- Ambos saudável de sementes e célula degenerativa em 96 placas bem em uma densidade de 2 x 103 células por poço para 24, 72 e 120 h.
- Após a incubação, adicione 10 µ l de solução de BrdU 10% a cada poço.
- Incube as placas durante 3 h a 37 ° C em 5% CO2.
- Adicionar 100 µ l/poço da solução de fixação/desnatura (60-70% de etanol, 0,1 – 0,5% de hidróxido de sódio) e manter a placa à temperatura ambiente por 30 min.
- Adicione 100 µ l/poço preparado 1 x solução de anticorpo de deteção e manter a placa à temperatura ambiente durante 1 h.
- Remover a solução e lavar a placa 3 vezes com tampão de lavagem 1X.
- Adicionar 100 µ l/poço preparado 1 solução de anticorpo secundário conjugado HRP x e manter a placa à temperatura ambiente por 30 min.
- Retire a placa da solução e lavar três vezes com tampão de lavagem 1X.
- Adicione 100 µ l de substrato TMB de 50%.
- Incube durante 30 min à temperatura ambiente.
- Adicione 100 µ l de solução de paragem.
- Medir as densidades ópticas a 450 nm, utilizando um leitor de microplacas.
Nota: Leituras de tomar pelo menos três vezes em todos os tempo pontos para cada amostra.
6. análise estatística
- Coletar e analisar dados usando SPSS.
- Retratam dados pela média ± erro padrão da média.
- Teste de Mann Whitney U uso.
- Considerar as diferenças estatisticamente significativas quando o valor de p é menor que 0,05 (p < 0,05).
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Representative Results
Análise histológica revelou que o tecido colhido da epicondilite lateral teve as características de um tendão de tendinopathic. H & E seção de tendinopatia degenerativa do tendão revelou um bundle colágeno desorganizada com uma perda de polaridade e estruturas de fibra fina reta, fortemente embalado paralelo. Histológicas sinais sugestivos de degeneração, tais como maior celularidade e núcleos alargados sem a forma típica do eixo eram comuns nas amostras. Além disso, feixes de colágeno do tendão degenerado eram relativamente fraca eosina manchada por H & E... mas positivamente foram corados por Alcian blue indicando aumentada substância proteoglicanos e glicosaminoglicanos.
Em todos os casos, os vasos sanguíneos foram aumentados em número e agregados ocupando espaços incorporados entre fibras foram comparados com normais fenda, como vasos. Na coloração do IHC, células dos tendões degenerados mostraram reação positiva citoplasmática granular de VEGF em comparação com a reação negativa do controle os. Coletivamente, esses achados confirmaram que os tecidos colhidos de epicondilite lateral foram tecidos degenerativas e apropriado para a cultura de tenocyte degenerativa (ver Figura 2).
As células cultivadas foram confirmadas como tenocytes por ICC e os tecidos colhidos foram confirmados por IHQ como tecido do tendão. A maioria das culturas de células e células no tecido do tendão mostrou uma mancha positiva para os marcadores de tenocyte representante conhecido como proteínas mohawk (verde) e tenomodulin (vermelho) de proteínas com uma aparência alongada sob microscopia (ver Figura 3). Além disso, os tecidos colhidos tinham a coloração positiva para proteínas mohawk e immunohistochemically de proteínas tenomodulin (ver Figura complementar 1). Estas sugeriram que os tecidos colhidos foram compostos pelo tecido do tendão.
Tenocytes cultivadas no tecido colhidos da epicondilite lateral tinha características que correspondem a tendinopatia. Tenocytes degenerativas e saudáveis foram cultivados por 4 dias sob a mesma condição. Em cada ponto de tempo, a taxa de proliferação foi medida pelo ensaio de BrdU e WST-1 ensaio. Os resultados mostraram que a taxa de proliferação das células degenerativas foi significativamente maior em comparação com os controles como anteriormente relatados (p < 0,05) (ver Figura 4).
Cinco genes que são conhecidos por serem acima-está regulada no tendão degenerativo foram analisados por qRT-PCR. Expressões dos genes, COL3A1, ACTA2, TAC1 (SP), receptor de TAC 1, e PTGS2 (COX2) foram aumentados significativamente mais em culturas de células do tendão degenerativa do que nas células dos saudáveis. As expressões relativas para todos os genes são mostradas na Figura 4B e suplementar Figura 2.
Figura 1 : Foto cirúrgica da colheita degenerativa do tendão. (A) após a incisão da pele e dissecção, foi exposto o tecido patológico degenerativo na origem dos extensores comuns, mostrando uma característica cor cinzento maçante com alteração edematosa (linha vermelha). Por outro lado, o aspecto geral do tecido do tendão normal foi brilhante e firme com um tom ligeiramente acinzentado (linha preta). (B) todos os tecidos degenerativas identificados foram ressecados bruscamente e em seguida o osso cabeça radial foi exposto. (C) todos os tecidos ressecados foram incorporados imediatamente a solução salina tamponada fosfato e o tecido circundante não-tendinosas foi cuidadosamente dissecado logo que possível. ECRB: extensor radial curto do carpo. CED: extensor dos dedos communis. ECU: extensor carpi ulnar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Confirmação de degenerativa do tendão histologicamente. (A) em the H & E mancha, degenerativas samples a epicondilite lateral tinham desorganizados feixes de colágeno com perda da polaridade e aumentou o número de celular em comparação ao controle saudável. (B). Alcian coloração azul mostrou que o tendão degenerativo tinha aumentado a substância fundamental, consistindo de proteoglicanos e glicosaminoglicanos com vários patches mucoide e vacúolos entre fibras (seta). (C). Além disso, a imuno-histoquímica VEGF demonstrada aumentado mancha na formação de vasos em amostras de degenerativa do tendão em comparação com as amostras de controle. VEGF: Fator de crescimento de endotélio Vascular. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Identificação de tenocyte por ICC. As culturas de células e células no tecido do tendão foram confirmadas como tenocyte por ICC. A maioria das células mostrou mancha positiva para o marcador de representante tenocyte, incluindo mohawk (verde) e tenomodulin (vermelho) com aparência alongada sob microscopia. Condrócito foi usado como controlo negativo. ICC: imunocitoquímica. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Características de degenerativa tenocyte. (A, B) Tenocytes degenerativa (vermelho) tinha uma maior taxa de proliferação, com um aumento notável na celularidade. (C) cinco genes que são conhecidos para ser relacionado no desenvolvimento da tendinopatia foram significativamente elevados no tenocytes degenerativa. Níveis de expressão de gene foram normalizados contra a GAPDH. *: significa < 0.05, * *: quer dizer < 0,01, respectivamente. SP: substância P. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: confirmação histológica do tecido colhido como o tecido do tendão. O tecido colhido também foi analisado por IHQ para mohawk e tenomodulin determinar se o tecido colhido tinha as características adequadas do tecido do tendão. IHC: imuno-histoquímica. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 2: expressão de tendinopatia relacionados genes em tenocyte. As transcrições dos cinco genes normalizados pela expressão de actina foram significativamente elevadas no tenocytes degenerativa e tem tendências similares à Figura 4. Níveis de expressão de gene foram normalizados contra actina com média < 0,05 e < 0,01, respectivamente. SP: substância P. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um número de estudos anteriores relataram como criar modelos animais tendinopathic crônica, utilizando diferentes procedimentos como colagenase ou injeção de kartogenin, esteira correndo e mais26,,27. Embora os estudos numerosos mostraram promissores efeitos terapêuticos baseados-se nestes modelos animais, experimentos utilizando o tenocyte degenerativa humana seria cruciais no campo da tendinopatia para reproduzir a eficácia do tratamento. Neste artigo, nós estabelecemos um protocolo para colheita e cultura humana tenocytes degenerativa consistentemente com êxito. Ambos colhidos tecido do tendão e o culto tenocyte mostrou as características comuns do degenerativa do tendão e tenocyte7,28.
Em nossa experiência, para a colheita de tecidos bem sucedida, é essencial para compreender as mudanças morfológicas, frequentemente associadas com degenerativa do tendão e para delinear com precisão nessa área durante a cirurgia. Tecido degenerativo é geralmente cinzento ou marrom na cor e o tecido é fino, frágil e desorganizado com textura solta. Os critérios de inclusão e exclusão do protocolo devem ser mantidos estritamente com cuidadosa avaliação dos tratamentos anteriores, antes da colheita.
Tamanho de tecido também é importante para uma cultura de célula bem sucedido. Recomendamos que a colheita de mais de 1 cm3. Geralmente, enquanto toda a área degenerativa é removido, a quantidade de tecido coletado seria suficiente para a cultura de células. Por último, nós não usamos tenocytes sobre passagem seis em todos os experimentos. Até seis de passagem, nós acreditamos que as células cultivadas ainda tinham as características de degeneração.
Nosso protocolo tem várias vantagens. Estas vantagens não incluem nenhum dano para o paciente, uma vez que o tecido degenerativo foi suposto ser removido durante a cirurgia, eficiência, desde que a quantidade de tecido necessária é suficiente para a experiência, altamente ética devido à não violação dos tecidos saudáveis, reprodutibilidade em que tecidos patológicos dos seres humanos pode ser facilmente obtida durante a cirurgia, e, por último, a facilidade de técnicas de aplicação cirúrgica uma vez se familiarizar.
No entanto, reconhecemos que a nossa experiência tem várias limitações. Primeiro, nós não pode excluir completamente o efeito remanescente de corticosteroide anterior ou injeção de plaquetas plasma rico mesmo que foram incluídos apenas pacientes que tinham passado pelo menos três meses de receber qualquer tratamento prévio. Além disso, neste protocolo, só colheu o tendão do ECRB e usou-a para cultura tenocytes degenerativa desde o tendão do ECRB é um local comum de tendinopatia para cirurgia, juntamente com tendões de Aquiles e manguito rotador. Mais estudos devem efectuar-se com um tamanho de amostra maior enfocando as diferenças entre os vários locais de tendinopatia.
Em conclusão, este Protocolo validado para a aquisição de tenocytes degenerativa humana será uma ferramenta útil para futuras investigações em biologia do tendão e para testes romance intervenções terapêuticas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão da Coreia saúde tecnologia R & D projeto através da Coreia saúde indústria desenvolvimento Institute (KHIDI), que foi financiado pelo Ministério da saúde & bem-estar, República da Coreia (número de concessão: HI16C1559).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
References
- Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
- Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40 (2012).
- Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
- Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
- Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
- Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
- Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
- Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
- Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
- Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
- Dirks, R. C., Warden, S. J.
- de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
- Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26 (2009).
- Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
- Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
- Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
- Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209 (2011).
- Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
- Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
- Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
- Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
- Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes' patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
- Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557 (2016).
- Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
- Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), author reply 1359-1360 1359-1360 (2009).
